摘 要： 本研究旨在建立一種牛支原體體外感染模型-牛肺組織精準(zhǔn)切片（precision-cut lung tissue slices， PCLS）感染模型。采集2月齡犢牛新鮮肺臟，經(jīng)低熔點瓊脂糖灌注、固定后，使用振動切片機制成厚度為250 μm的牛PCLS，利用牛支原體野毒株HB0801（P1）及其傳代致弱株P(guān)150 以108 CFU·孔-1的劑量進行體外感染，分別經(jīng)qRT-PCR、乳酸脫氫酶（LDH）細胞毒性試驗、3D熒光顯微鏡全景掃描、免疫組化等技術(shù)評估牛支原體在PCLS中的感染效果。結(jié)果顯示正常 PCLS在體外培養(yǎng)72 h后，細胞活力可維持在60%以上，組織形態(tài)學(xué)觀察PCLS邊緣清晰，肺泡結(jié)構(gòu)正常；qRT-PCR檢測牛支原體強、弱菌株在PCLS中的基因拷貝數(shù)，發(fā)現(xiàn)二者均可存活和增殖，免疫組化觀察牛支原體主要定位于PCLS的肺泡腔周圍以及支氣管間隙，LDH試驗檢測發(fā)現(xiàn)牛支原體強、弱菌株感染18 h出現(xiàn)細胞毒性反應(yīng)，二者均可誘導(dǎo)PCLS產(chǎn)生促炎因子IL-1β和IL-8，且強毒株誘導(dǎo)水平顯著高于弱毒株（Plt;0.05）。本研究初步建立了牛支原體PCLS體外感染模型，提供了一種可模擬牛支原體體內(nèi)感染試驗的離體模型，為今后研究牛支原體與宿主相互作用提供借鑒和參考。

關(guān)鍵詞： 牛支原體；肺組織精準(zhǔn)切片模型；體外感染；炎性反應(yīng)

中圖分類號：S852.62

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）10-4638-08

收稿日期：2023-12-13

基金項目：西南民族大學(xué)中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金資助（ZYN2023045）; 西南民族大學(xué)引進高層次人才科研資助金資助（RQD2023031）; 寧夏回族自治區(qū)重點研發(fā)計劃項目（2021BEF02028; 2023BCF01038）

作者簡介：張 慧（1986-），女，山西定襄人，助理研究員，博士，主要從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究，E-mail：dkyzhanghui@163.com

*通信作者：郭愛珍，主要從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究，E-mail： aizhen@mail.hzau.edu.cn

Establishment of Cattle Precision-Cut Lung Tissue Slices （PCLS） Models Infected

with Mycoplasma bovis in vitro

ZHANG" Hui1， LU" Doukun2， ZHANG" Yiqiu2， ZHAO" Gang3， CHEN" Yingyu2， CHEN" Xi2， HU" Changmin2， GUO" Aizhen2*

（1.College of Animal and Veterinary Sciences， Southwest Minzu University， Chengdu 610041，" China;

2.College of Veterinary Medicine， Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070，" China;

3.

School of Life Sciences， Ningxia University， Yinchuan 750021，" China）

Abstract： Mycoplasma bovis （M. bovis） is an important pathogen of bovine respiratory disease complex （BRDC）， mainly causing pneumonia， mastitis， arthritis， keratoconjunctivitis， otitis， and genital disorders， leading to high economic losses in dairy and beef cattle production. Lack of small animals’ models have greatly hindered the progress of effective vaccines and drugs for prevention and control in Mycoplasma bovis. In this study， we have established an in vitro infection model of M. bovis in Precision-cut lung tissue slices （PCLS）. We collected bovine lungs from apparently healthy two-months cattle after slaughter， filled the lung airway with low melting point agarose， transferred it to the vibratome tissue slicer and then made the 250 μm-thickness precision cut lung slices. After M. bovis wildtype strain HB0801（P1） and its attenuated strain P150 at a MOI of 108 CFU infected， quantitative real-time PCR， lactate dehydrogenase cytotoxicity assay， 3D fluorescence microscope panoramic scanning， immunohistochemistry analysis were performed. The results showed that cultured PCLS remained 60% cell viability for at least 72 h and maintained normal structural integrity including edge sharpness and alveolar structure well in uninfected PCLS." After infected with wildtype and attenuated M. bovis strains respectively， we found that both M. bovis could survive and proliferate in PCLS， tropism to alveolar and bronchial space， and showed cytotoxic reactions until 18 h post-infection. We also observed that after 36 h incubation with M. bovis wildtype strain P1 and its attenuated strain P150， cultured PCLS produced pro-inflammatory factors IL-1β and IL-8 in PCLS， and M. bovis wildtype strain HB0801 could induce significantly higher level than P150 （Plt;0.05）. In conclusion， this study provides a model and method to investigate M. bovis infection in vitro which can mimic M. bovis infection in vivo. It is expected to provide reference for subsequent research on host-pathogen interaction in M. bovis.

Key words： Mycoplasma bovis; precision-cut lung tissue slices; infected in vitro; inflammatory response

*Corresponding author： GUO Aizhen， E-mail： aizhen@mail.hzau.edu.cn

牛支原體（Mycoplasma bovis， M. bovis）作為牛呼吸疾病綜合征的首要病原和基礎(chǔ)病原，主要引起牛肺炎、乳腺炎、關(guān)節(jié)炎等疾病，能顯著增加其他病原體所致呼吸疾病的嚴(yán)重程度和防治難度。牛支原體在呼吸系統(tǒng)疾病綜合征（bovine respiratory disease， BRD）發(fā)生早期影響呼吸環(huán)境，增加常見細菌如溶血性曼氏桿菌的表達豐度，對BRD的發(fā)生具有重要影響［1］。一項研究表明，牛支原體在肺組織的檢出率達61%，鼻拭子檢出率35%，氣管組織檢出率28%，氣管拭子為27%，而且耐藥型牛支原體發(fā)生愈來愈普遍，成為制約牛呼吸疾病綜合征的重要原因［2］。我國于1983年首次報道牛支原體乳腺炎，于2008年首次報道牛支原體肺炎，該病在牛群中的發(fā)病率為50%～100%，病死率達10%～60%［3］，對養(yǎng)牛業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失，也是制約我國和世界養(yǎng)牛業(yè)發(fā)展的重要威脅之一，然而臨床上牛支原體病仍缺乏有效疫苗和特效藥物用于防治。由于牛支原體具有高度的宿主特異性，致使牛支原體缺乏小動物感染模型，嚴(yán)重阻礙了牛支原體致病機理研究、毒力因子挖掘和疫苗及藥物評價等研究，因此建立新型牛支原體感染性細胞模型對牛支原體基礎(chǔ)及應(yīng)用研究具有重要意義。

在研究呼吸系統(tǒng)疾病的體外模型中，以肺臟構(gòu)建的三維（3D）細胞感染模型能夠更好地模擬肺臟的自然環(huán)境，維持細胞間自然的相互作用和更逼真的生理生化反應(yīng)，對內(nèi)源性和外源性刺激應(yīng)答更接近體內(nèi)反應(yīng)，構(gòu)建的原理主要基于兩種方式，一種是組織塊浸沒培養(yǎng)（STC），另一種是氣液交界面（ALI）培養(yǎng)系統(tǒng)［4］，如精準(zhǔn)肺切片模型（precision-cut lung slices， PCLS）、類器官模型（organoids）以及肺芯片（lung-on-chip， LOC）等［5］。然而，目前關(guān)于牛支原體體外3D感染模型的報道仍較少。其中，PCLS目前研究人員廣泛使用的器官體外模型，也是一種可進行體外培養(yǎng)的活組織模型，利用振動切片機在保持組織活力的條件下精準(zhǔn)切割肺組織，用于制備具有特定厚度、易重復(fù)的體外培養(yǎng)的組織活性外植體，具有保存完好的肺組織結(jié)構(gòu)和肺組織內(nèi)多種類型的呼吸道細胞，包括DC、巨噬細胞、中性粒細胞和T細胞等［6］，在體外可以模擬病原體感染過程中多細胞相互作用的過程。因此，建立PCLS感染模型，能更大程度上模擬體內(nèi)肺環(huán)境，彌補了體外細胞實驗的缺點和減少實驗動物的使用。目前國際上已建立了多種動物PCLS體外培養(yǎng)體系，如小鼠［7］、人［8］、豬［9］、牛［10］等，廣泛應(yīng)用于病原體的體外研究以及相關(guān)藥物的毒理學(xué)和代謝等研究，對于牛支原體這種具有嚴(yán)格器官和組織嗜性的病原具有較好的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料

牛支原體菌株（HB0801株、HB0801-P150株）由本實驗室保存；2月齡犢牛購自本地牛場；低熔點瓊脂糖購自索萊寶公司，DMEM F-12細胞培養(yǎng)基和EBSS平衡鹽溶液以及抗生素Antibiotic-Antimycotic購自Gibco公司，胎牛血清和卡那霉素購自Sigma公司，蘇木精伊紅（HE）染色試劑盒和乳酸脫氫酶（LDH）細胞毒性檢測試劑盒均購自碧云天生物公司，TRIzol購自Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄酶（HiScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit）和熒光定量酶（AceQ qPCR SYBR Green Master Mix）均購自南京諾唯贊公司。

1.2 牛PCLS的制備

取2月齡犢牛的新鮮肺臟組織，確認各個肺葉未損傷，水平放置，肺葉展開以確定主支氣管和細支氣管的最佳視角，支氣管插入硅膠管并用止血鉗固定，保證灌注時不漏液，然后用50mL注射器小心注入37℃保存的3%低熔點瓊脂糖至肺臟，直至肺葉充盈，小心觸碰肺臟表面，觀察是否平整堅硬，將每個支氣管進行同樣操作，直至整個肺灌注完成，將灌注好的肺臟置于冰箱內(nèi)凝固，肺臟變堅硬后，在靠近氣管端一側(cè)，使用尖刀將肺切割成3～5 cm厚度的牛排狀，操作過程中保證低溫。取出肺組織進行大小修整，將其切成直徑為1～2 cm的圓柱形組織芯， 置入圓柱形切片膜具，滴入3%低熔點瓊脂糖后固定，然后凝固后置于切片機進行切片，在振動切片機（VF200/300 amp;600 CompresstomeTM microtome，Precisionary Instruments）水槽中倒入遇冷的EBSS培養(yǎng)基，將切成柱體形狀的組織固定在切片機底座，設(shè)置切片機參數(shù)，調(diào)整PCLS切片厚度為250 μm。將制備好的牛PCLS置于24孔板中，每孔加入含有青霉素、鏈霉素、卡那霉素和兩性霉素B等抗生素的新鮮DMEM-F12培養(yǎng)基 1 mL，于37℃，5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每小時換液1次，換液3～4次，以去除肺臟組織中殘留的低熔點瓊脂糖，最終得到大小一致、厚度均勻的牛PCLS，將切好的PCLS轉(zhuǎn)移到細胞培養(yǎng)板中，每孔500 μL培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。

1.3 HE染色和LDH細胞毒性檢測評估PCLS細胞活力

取制備好的牛PCLS，經(jīng)洗滌、固定后，按照HE染色試劑盒說明書進行操作，染色后在顯微鏡下觀察PCLS組織學(xué)形態(tài)。將制備好的PCLS接種到24孔細胞培養(yǎng)板中（每孔加入2片PCLS培養(yǎng)），各孔設(shè)置為以下幾組：無細胞的培養(yǎng)液孔（背景空白對照孔），未經(jīng)牛支原體感染的對照細胞孔（樣品對照孔），未經(jīng)牛支原體感染的用于后續(xù)裂解的細胞孔（樣品最大酶活性對照孔），以及牛支原體感染的細胞孔（每孔接種牛支原體108 CFU，感染樣品孔），設(shè)置不同處理時間（4、6、12、18、36、 60、72 h），在預(yù)定的檢測時間點前1 h，在樣品最大酶活性對照孔中加入LDH釋放試劑，反復(fù)吹打數(shù)次混勻，然后繼續(xù)在細胞培養(yǎng)箱中孵育。到達預(yù)定時間后，取各孔的上清液120 μL， 加入到一新的96孔板相應(yīng)孔中，各孔分別加入60 μL LDH檢測工作液，室溫避光孵育30 min，酶標(biāo)儀測定OD490 nm，細胞活力（%）=1-（處理樣品吸光度-樣品對照孔吸光度）/（細胞最大酶活性的吸光度-樣品對照孔吸光度）×100。每組兩個重復(fù)。

1.4 免疫組化以及間接免疫熒光觀察牛支原體在PCLS中的黏附和定位

為了直觀地觀察牛支原體在PCLS中的黏附和定位，對感染后的PCLS分別進行免疫組化和間接免疫熒光（IFA）檢測，將制備好的PCLS置于鋪有爬片的24孔板，每孔加入108 CFU·mL-1的牛支原體，同時設(shè)置陰性對照，感染12 h后，經(jīng)4%多聚甲醛固定2 h，根據(jù)參考文獻［11］的方法，加入5% BSA封閉，使用牛支原體單克隆抗體1C11（1∶500稀釋）作為一抗，羊抗鼠HRP-IgG（H+L）為二抗，DAB顯色，顯微鏡下觀察切片免疫組化情況。對于IFA，步驟同上，二抗使用羊抗鼠IgG-FITC（1∶500稀釋），再孵育羅丹明鬼筆環(huán)肽標(biāo)記細胞骨架，加入含DAPI的封片劑封片，經(jīng)3D熒光顯微鏡（基恩士，BZ-X800）進行全景掃描拍片。

1.5 熒光定量檢測牛支原體感染牛PCLS的拷貝數(shù)

將制備好的PCLS置于鋪有爬片的24孔板，每孔加入108 CFU·mL-1的牛支原體，感染4 h后，無菌PBS洗滌三次，換入新鮮的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，選擇不同時間點（18、36、48、60 h）收集感染后PCLS，使用細胞/組織基因組提取試劑盒提取DNA。根據(jù)文獻方法［10］，以牛CEACAM18為宿主參考基因（CEACAM18-F：AGCCAAATCTACATCACCCC；CEACAM18-R：ACCTCTAATGGACACACTTT），牛支原體uvrc基因為病原參考基因（uvrc-F：TAATTTAGAAGCTTTAAATGAGCG-C；uvrc-R： CATATCTAGGTCAATTAAGGCTT-TG），采用SYBR Green方法檢測感染PCLS的牛支原體基因表達，然后根據(jù)ThermoFisher scientific DNA copy number calculator計算基因拷貝數(shù)。

1.6 牛支原體感染PCLS后炎性因子mRNA檢測

將制備好的PCLS置于鋪有爬片的24孔板，每孔加入108 CFU·mL-1的牛支原體，分別感染18、24、36 h，設(shè)置未感染組為陰性對照，TRIzol法提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，根據(jù)文獻［11］中熒光定量PCR方法檢測細胞炎性因子IL-8和IL-1β的mRNA表達水平。

2 結(jié) 果

2.1 PCLS活性和組織形態(tài)評估

細胞毒性檢測以及切片的組織形態(tài)是用于檢測PCLS活性變化的指標(biāo)。將切割好的牛PCLS置于5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔一定時間取出樣品進行LDH細胞毒性檢測，結(jié)果顯示制備后的切片從4到72 h 細胞活力基本維持在60%以上（圖1A）。另外，本試驗選擇PCLS進行HE染色來評估切片的完整性，經(jīng)HE染色后，顯微鏡下觀察組織形態(tài)顯示PCLS邊緣清晰，具有完整的肺組織結(jié)構(gòu)，其中肺泡結(jié)構(gòu)完整，涵蓋肺泡腔和肺支氣管（圖1B）。

2.2 免疫組化檢測牛支原體在PCLS中的定殖

肺臟免疫組化切片可見肺泡隔、肺泡細胞以及支氣管結(jié)構(gòu)等，利用牛支原體單克隆抗體1C11［12］對牛支原體進行標(biāo)記，結(jié)果顯示，肺組織中均顯示牛支原體存在，感染后可黏附到細胞表面，定位于細支氣管以及支氣管間隙，如圖2所示。

2.3 牛支原體感染牛PCLS的3D共聚焦成像

使用牛支原體單抗1C11以及FITC標(biāo)記的熒光二抗顯示牛支原體在PCLS的定位（標(biāo)記為綠色），同時使用細胞染料羅丹明鬼筆環(huán)肽標(biāo)記細胞骨架（標(biāo)記為紅色），細胞核染料DAPI標(biāo)記細胞核（標(biāo)記為藍色），對牛支原體感染PCLS后的切片進行間接免疫熒光檢測，由于PCLS屬于厚度為250 μm的組織，使用3D共聚焦成像系統(tǒng)，對間接免疫熒光標(biāo)記的 PCLS進行掃描后拼圖觀察，結(jié)果顯示，綠色標(biāo)記的牛支原體主要分布于支氣管間隙、肺泡腔等（圖3A、B），而且兩種菌株對PCLS具有較強的黏附作用，陰性對照未見綠色標(biāo)記的牛支原體（圖3C）。

2.4 牛支原體強弱菌株在PCLS中的復(fù)制和細胞毒性檢測

分別將牛支原體強毒株HB0801（P1）及其體外傳代致弱菌株P(guān)150以每孔108 CFU的比例感染PCLS，感染4 h后洗滌去除未黏附的牛支原體，然后繼續(xù)培養(yǎng)至60 h，提取各個時間點感染樣品的DNA，以宿主基因CEACAM18為內(nèi)參，牛支原體uvrc基因作為目的基因，采用SYBR Green檢測牛支原體基因的表達并計算其拷貝數(shù)，結(jié)果顯示，牛支原體強弱菌株從感染后18 h 到48 h，均呈現(xiàn)增長趨勢，在48 h拷貝數(shù)達到最高（圖4A）。乳酸脫氫酶是一種穩(wěn)定存在于細胞質(zhì)內(nèi)的酶，當(dāng)細胞膜受到損傷后能夠從細胞內(nèi)釋放出來，為了進一步研究牛支原體感染是否誘導(dǎo)PCLS損傷，在不同時間點收集上清，利用LDH細胞毒性檢測試劑盒檢測PCLS中乳酸脫氫酶釋放量，結(jié)果顯示隨感染時間延長，牛支原體強毒株P(guān)1感染組細胞活力有降低，但與弱毒株P(guān)150和空白組相比，均未有顯著性差異（圖4B）。

2.5 牛支原體感染后誘導(dǎo)PCLS促炎因子表達

炎性反應(yīng)是支原體感染后刺激宿主細胞的重要表型，PCLS也作為體外細胞模型用于多種病原的炎性反應(yīng)評估［14］。因此，收集牛支原體感染后不同時間點的PCLS，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用qRT-PCR檢測促炎因子IL-1β和IL-8的mRNA表達，結(jié)果顯示，牛支原體強弱菌株均可刺激PCLS產(chǎn)生較強的炎性反應(yīng)，且強毒株誘導(dǎo)產(chǎn)生的IL-1β和IL-8 mRNA水平顯著高于弱毒株P(guān)150和空白組（Plt;0.05，圖5A、B）。

3 討 論

肺精準(zhǔn)切片PCLS是一種制備方法簡便、能夠在體外條件下連續(xù)培養(yǎng)、可凍存后重復(fù)使用的新型3D細胞模型［7］。PCLS涵蓋肺部的40多種細胞類型，保留了不同細胞類型與胞外基質(zhì)之間的相互作用，分化狀態(tài)和定位與體內(nèi)肺組織的生理狀況一致［6］，已被應(yīng)用于多種哺乳動物和人的科學(xué)研究中［14］。本研究通過建立牛肺切片的牛支原體體外感染模型，通過檢測牛支原體感染后細胞活性、肺組織形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)、炎性反應(yīng)等，證實牛支原體可以在PCLS中定殖和復(fù)制，主要分布于支氣管壁和肺泡腔周圍，可以誘導(dǎo)PCLS產(chǎn)生較高水平的IL-1β和IL-8，從細胞活力、病原定位、病原的復(fù)制增殖以及細胞毒性和炎性反應(yīng)等方面探討了牛支原體在該培養(yǎng)模型中的感染特性，為牛支原體體外新型感染模型提供了借鑒和參考。

國外有學(xué)者報道，牛PCLS可作為牛支原體和流感病毒的混合感染模型，試驗中發(fā)現(xiàn)制備的牛PCLS在體外可以存活7 d，其凋亡的細胞在24 h內(nèi)少于12%，120 h后可達11%～30%，LDH細胞毒性為10%～30%［15］，這與本研究制備的牛PCLS細胞活力在60%以上相接近。將試驗制備的PCLS作為感染模型，使用牛支原體強弱菌株進行感染，結(jié)合免疫組化和3D熒光共聚焦檢測，發(fā)現(xiàn)牛支原體主要定位于支氣管壁和肺泡腔周圍，這與臨床上牛支原體體內(nèi)感染在肺部的定位一致［16］。

肺組織切片也是一種炎性反應(yīng)評估模型，Angela等［8］利用LPS刺激人PCLS 后可以產(chǎn)生TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎因子?；撾[秘桿菌在感染豬PCLS后，發(fā)現(xiàn)可以顯著損傷肺上皮細胞，激活NLR/Caspase-1信號通路以及NF-κB、MAPK以及AKT等炎性信號通路，促進肺部炎性反應(yīng)發(fā)生［17］。本研究制備的牛PCLS感染牛支原體后，PCLS中促炎因子IL-1β和IL-8 的mRNA水平明顯升高，這可能與肺切片中涵蓋大量的免疫細胞（如DC、巨噬細胞、中性粒細胞和T細胞等）相關(guān)。一項研究發(fā)現(xiàn)，使用不同DC亞群免疫標(biāo)記PCLS，共聚焦顯微鏡觀察可以明顯看到不同類型的免疫細胞，如CD11c+CD88+標(biāo)記的巨噬細胞、CD11c-CD88+標(biāo)記的中性粒細胞、CD324+標(biāo)記的氣道上皮細胞，這些細胞均為重要的免疫細胞，可以產(chǎn)生高水平的炎性反應(yīng)［6］。通過本試驗確定，制備的牛PCLS可作為模擬牛支原體體內(nèi)感染試驗的炎性刺激模型，可為反芻動物BRD相關(guān)疾病的研究帶來便利和較為敏感的評估體系。

目前PCLS模型仍存在一些局限，包括PCLS缺乏標(biāo)準(zhǔn)且均一的細胞培養(yǎng)基導(dǎo)致細胞活力不足，制備的PCLS細胞活力差異較大，在制備過程中細胞活力降低明顯，肺臟離體后，細胞損傷較大，加上缺少適合的培養(yǎng)基維持細胞穩(wěn)定；牛體遺傳學(xué)多樣性導(dǎo)致的個體差異顯著，從而導(dǎo)致切片不同；PCLS從體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)中剝離出來，無法評估肺、血、淋巴結(jié)之間的遷移變化等；但與細胞模型比較，PCLS具有比較完整的組織結(jié)構(gòu)、多樣化的細胞類型以及細胞極性，能最大限度地模擬在體狀態(tài)。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和條件的不斷優(yōu)化，PCLS在牛支原體及BRD相關(guān)疾病的研究中仍蘊藏著巨大的潛力。

4 結(jié) 論

本研究初步建立了牛支原體PCLS體外感染模型，該細胞可用于檢測牛支原體的存活、增殖、定位，感染牛支原體后可誘導(dǎo)產(chǎn)生細胞毒性和炎性反應(yīng)，為臨床提供了一種可模擬牛支原體體內(nèi)感染試驗的離體模型，也為今后研究牛支原體與宿主相互作用提供參考。

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（編輯 白永平）