關(guān)鍵詞

分析化學(xué) 超高效液相色譜-質(zhì)譜法 EMR 固相萃取小柱 五氯酚 魚(yú)肉

0引言

五氯酚（pentachlorophenol，PCP），又稱五氯苯酚，是一種氯代烴類的殺蟲(chóng)劑、滅真菌劑等，可作為除草劑用于水稻田或防霉劑用于紡織品、皮革、紙張等。五氯酚具有致畸、致癌、致突變等毒副作用，對(duì)人體的神經(jīng)系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、皮膚、肝臟和腎臟等均有毒性[1]。還具有生物蓄積作用，在高有機(jī)質(zhì)含量的酸性土壤或沉積物中具有很高的吸附性，可被植物吸收并進(jìn)入食物鏈，最終危害人體健康。五氯酚對(duì)水生生物也有極高毒性，可在水生環(huán)境中造成長(zhǎng)期不利影響，導(dǎo)致水生和陸地生態(tài)系統(tǒng)受到一定程度的污染。具有生物毒性、難降解性等特點(diǎn)，是一種環(huán)境中常見(jiàn)的污染物[2]。我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第193號(hào)及第235號(hào)規(guī)定，所有動(dòng)物源食品中禁止使用五氯酚及其鈉鹽[3，4]。2017年10月27日，世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)公布的致癌物清單中，確定五氯酚為一類致癌物[5]。2018年，國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局對(duì)國(guó)家食品安全監(jiān)督抽檢中明確強(qiáng)調(diào)對(duì)畜禽產(chǎn)品及其副產(chǎn)品須嚴(yán)格檢測(cè)五氯酚和五氯酚鈉[6]。

目前五氯酚常用的檢測(cè)方法有液相色譜-質(zhì)譜法[7，8]、氣相色譜-質(zhì)譜法[9，10]。相比較氣相色譜-質(zhì)譜法，液相色譜-質(zhì)譜法因其前處理無(wú)需衍生這一復(fù)雜、繁瑣的步驟，且具有更高準(zhǔn)確性和靈敏度這一優(yōu)勢(shì)，應(yīng)用得更為廣泛。目前的凈化方法主要報(bào)道的有固相萃取法[11，12]和QuEChERS法[13，14]，其中固相萃取法操作步驟繁瑣耗時(shí)較長(zhǎng)，在日常檢測(cè)中經(jīng)常需要進(jìn)行批量樣品處理時(shí)，此方法不能在短時(shí)間內(nèi)處理大量樣品，工作效率較低，不能很好地滿足日常檢測(cè)需求。GB23200.92—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物源性食品中五氯酚殘留量的測(cè)定液相色譜-質(zhì)譜法》中規(guī)定的方法在檢測(cè)五氯酚過(guò)程中存在處理時(shí)間長(zhǎng)、回收率偏低、重復(fù)性不好、基質(zhì)干擾等問(wèn)題，不能保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，需要進(jìn)行進(jìn)一步的方法優(yōu)化。

Agilent Captiva EMR（以下簡(jiǎn)稱EMR小柱）作為一種新型的固相萃取柱，能夠高選擇性地去除脂質(zhì)基質(zhì)，可通過(guò)體積排阻和疏水作用吸附脂類等長(zhǎng)鏈物質(zhì)達(dá)到凈化的目的，且不會(huì)造成分析物損失，能最大程度減少目標(biāo)分析物的基質(zhì)干擾[15]，這類通過(guò)吸附干擾物的通過(guò)式凈化方式相比傳統(tǒng)的“上樣、淋洗、洗脫”三步法SPE凈化方式更為便捷高效。EMR小柱凈化操作步驟簡(jiǎn)便，基質(zhì)適用性較強(qiáng)，已經(jīng)成功在動(dòng)物源性樣品的藥物殘留和毒素檢測(cè)中得到廣泛應(yīng)用[16，17]。

近年來(lái)我國(guó)多地河流水環(huán)境中均存在五氯酚，其中長(zhǎng)江及沿長(zhǎng)江流域的洞庭湖、鄱陽(yáng)湖五氯酚殘留量較高，并且五氯酚污染范圍有從主要的江河、湖泊等向沿海海域蔓延的趨勢(shì)[18]。各類魚(yú)肉是日常生活中常見(jiàn)的水產(chǎn)品，魚(yú)肉中的五氯酚殘留量超標(biāo)的現(xiàn)象也偶有發(fā)生，各種魚(yú)類產(chǎn)品中五氯酚的含量超標(biāo)與否也受到人們?cè)絹?lái)越密切的關(guān)注。為提高五氯酚檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，保證其可信度，本次研究在GB 23200.92—2016的基礎(chǔ)上對(duì)前處理方法進(jìn)行了優(yōu)化，采用EMR固相萃取凈化與超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)分析結(jié)合，能夠簡(jiǎn)化前處理分析步驟、縮短前處理操作時(shí)間，以達(dá)到建立一種更適用于魚(yú)類產(chǎn)品中五氯酚殘留量批量測(cè)定方法的目的，進(jìn)而降低分析成本以及提高大批量樣品的篩查效率。

1材料與方法

1.1材料與試劑

新鮮魚(yú)肉，市場(chǎng)采購(gòu)，共15批次；標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控樣品2批次；五氯酚酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品（純度98.0%，上海安譜公司）；甲醇、乙腈、甲酸（均為色譜純，美國(guó)Thermo Fisher公司）；Oasis MAX（規(guī)格為60mg，3mL，美國(guó)Waters公司）；Captiva EMR-Lipid（規(guī)格為300mg，3mL，美國(guó)Agilent公司）；PTFE針式過(guò)濾器：（規(guī)格為13mm，0.22μm，天津HEAION公司）；試驗(yàn)用水（超純水）。

1.2儀器和設(shè)備

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（型號(hào)為Xevo-TQD，Waters科技有限公司）；高速離心機(jī)（型號(hào)為Centrifuge5804R，德國(guó)Eppendorf公司）；全自動(dòng)智能氮吹儀（型號(hào)為FV64，廣州得泰儀器科技有限公司）；氮?dú)獍l(fā)生器（型號(hào)為SP-40LN，上海氣譜儀器設(shè)備有限公司）；多位渦旋振蕩器（型號(hào)為MV-3000，賦德生物公司）；電子天平（型號(hào)為JJ500Y，常熟市雙杰測(cè)試儀器廠）。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

五氯酚標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取五氯酚酸鈉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)0.01324g，以甲醇溶解并定容至10.00mL棕色容量瓶中，折算純度后得到五氯酚標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的質(zhì)量濃度為1104μg/mL。

五氯酚標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：精密移取適量的五氯酚標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用50%甲醇水（含2%甲酸）稀釋，配制成0μg/mL、1.1μg/mL、2.2μg/mL、5.5μg/mL、11.0μg/mL、22.1μg/mL、55.2μg/mL系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3.2樣品前處理

提?。悍Q取樣品2g（精確到0.01g）于50mL離心管中，加入500mg無(wú)水硫酸鎂，混勻后加入6mL2%甲酸乙腈溶液，渦旋提取3min，超聲提取5min，8000r/min離心2min，收集上清液于離心管中，離心后的殘?jiān)僦貜?fù)提取一次，合并所有上清液，混勻，待下一步凈化。

凈化：移取3mL上清液至EMR小柱中，收集流出液，再用2mL2%甲酸乙腈溶液沖洗柱子，混勻流出液，于40℃氮吹至近干，用50%甲醇水（含2%甲酸）溶液定容至0.5mL，0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，待測(cè)。

1.3.3儀器條件

1.3.3.1液相色譜條件

色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18柱（1.7μm，100mm×2.1mm）；流動(dòng)相A為甲醇，流動(dòng)相B為5mmol/L乙酸銨溶液；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：5μL，梯度洗脫程序如表1所示。

1.3.3.2質(zhì)譜條件

電噴霧電離源（ESI）：負(fù)離子掃描，多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；毛細(xì)管電壓：1.00kV；脫溶劑溫度：450℃；脫溶劑氣流量：900L/h；錐孔氣流量：50L/h；源溫度：150℃。

2結(jié)果與分析

2.1提取液的選擇

五氯酚一般以五氯酚鈉或者五氯酚的形式殘留在食品中，五氯酚鈉易溶于水而五氯酚易溶于有機(jī)溶劑，通常采用酸性溶液或堿性溶液兩種方式提取動(dòng)物性食品中的五氯酚鈉。根據(jù)五氯酚的結(jié)構(gòu)以及化學(xué)特性，乙腈作為常用提取試劑，能提取待測(cè)組分的同時(shí)，還可以沉淀樣品中蛋白成分，利于后續(xù)樣品凈化操作。參考GB 23200.92—2016，本次試驗(yàn)考察了乙腈、3%甲酸酸化乙腈、70%乙腈-水溶液、5％三乙胺乙腈-水溶液4組溶劑的提取效果，平行測(cè)定3次。如圖1結(jié)果顯示，3%甲酸酸化乙腈和5％三乙胺乙腈-水溶液對(duì)五氯酚鈉的提取效率較高，平均回收率達(dá)到80%以上，純乙腈和70%乙腈-水溶液對(duì)樣品中五氯酚殘留提取效率均較低。另外，當(dāng)70%乙腈-水溶液和5％三乙胺乙腈-水溶液作為提取溶劑時(shí)，可能是水分含量較高的原因，提取后試樣液較為渾濁，雖經(jīng)冷凍離心后效果有改善，但是在后續(xù)過(guò)EMR凈化小柱時(shí)，基質(zhì)較為復(fù)雜的樣品易造成柱子堵塞。綜合考慮，為簡(jiǎn)化操作，以3%甲酸酸化過(guò)的乙腈作為樣品提取液，相比GB 23200.92—2016前處理方法中用含5%三乙胺堿化的乙腈-水溶液作為提取液，前者更為澄清，過(guò)柱效率更高。

2.2固相萃取柱的選擇

動(dòng)物組織中含有大量蛋白質(zhì)和脂肪物質(zhì)，對(duì)測(cè)定產(chǎn)生很大干擾，凈化步驟必不可少。為減少對(duì)色譜儀器的損害和降低背景化合物的干擾，通常需要對(duì)目標(biāo)分析物進(jìn)行凈化與濃縮，常使用固相萃?。⊿PE）凈化方法對(duì)提取液進(jìn)行凈化和濃縮。參考GB 23200.92—2016，本次試驗(yàn)對(duì)Waters Oasis MAX（以下簡(jiǎn)稱MAX）和Agilent Captiva EMR-Lipid（以下簡(jiǎn)稱EMR）兩種固相萃取柱的回收率和凈化效果進(jìn)行了對(duì)比試驗(yàn)。結(jié)果顯示，使用MAX與EMR小柱凈化的回收率相當(dāng)，均大于78%。使用EMR小柱凈化時(shí)，操作步驟簡(jiǎn)便，且相對(duì)穩(wěn)定，極少出現(xiàn)柱床堵塞的問(wèn)題。而使用MAX柱子凈化時(shí)，操作復(fù)雜，耗時(shí)較長(zhǎng)，容易堵塞，回收率不穩(wěn)定，受樣品基質(zhì)影響較大。因此，選用Captiva EMR作為凈化柱對(duì)樣品進(jìn)行凈化。

2.3濾膜的選擇

HPLC樣品及流動(dòng)相過(guò)濾是保證儀器和色譜柱正常工作的步驟。過(guò)濾可以延長(zhǎng)色譜柱壽命，降低儀器故障率，提高數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，還可以消除壓力波動(dòng)，泵柱塞桿、密封、進(jìn)樣閥密封損壞等現(xiàn)象。選擇不同種類、孔徑的濾膜對(duì)流動(dòng)相及樣品進(jìn)行過(guò)濾達(dá)到澄清除菌、去除雜質(zhì)顆粒的作用，對(duì)保護(hù)色譜系統(tǒng)及色譜柱具有重要意義。濾膜的材質(zhì)，耐酸耐堿性，化學(xué)相容性，對(duì)目標(biāo)物是否有吸附，都會(huì)影響分析物的回收率，直接影響最終結(jié)果。有研究表明，濾膜對(duì)五氯酚具有吸附作用，導(dǎo)致化合物的回收率很低[19]。液相色譜常用的濾膜主要有水系膜（主要材質(zhì)為混合纖維素酯CN-CA）、尼龍膜（主要材質(zhì)為聚酰胺NYLON）、PVDF膜（主要材質(zhì)為聚偏二氟乙烯）、PTFE膜（主要材質(zhì)為聚四氟乙烯）。本次試驗(yàn)將質(zhì)量濃度為2.5ng/mL的五氯酚標(biāo)液分別過(guò)水系膜、尼龍膜、PVDF膜、PTFE膜后，平行測(cè)定6次，測(cè)定其質(zhì)量濃度，以考察不同材質(zhì)的濾膜對(duì)五氯酚吸附作用。如表2所示，水系膜、尼龍膜、PVDF膜3種濾膜均對(duì)五氯酚有不同程度的吸附作用，PTFE濾膜對(duì)五氯酚幾乎無(wú)吸附作用，且相對(duì)穩(wěn)定。

2.4基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)是指樣品中除了待測(cè)物以外的其他基質(zhì)成分對(duì)待測(cè)物測(cè)定值的影響，即基質(zhì)對(duì)分析方法準(zhǔn)確測(cè)定分析物的能力的干擾[20]?；|(zhì)效應(yīng)分為基質(zhì)減弱和基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，若陽(yáng)性樣品未檢出則是因?yàn)榛|(zhì)減弱效應(yīng)，若出現(xiàn)假陽(yáng)性樣品則是因?yàn)榛|(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，假陽(yáng)性樣品的檢出和陽(yáng)性樣品未檢出都會(huì)給檢測(cè)結(jié)果帶來(lái)很大的分析誤差[21]。以50%甲醇水（含2%甲酸）配制質(zhì)量濃度為0ng/mL、1.1ng/mL、2.2ng/mL、5.5ng/mL、11.0ng/mL、22.1ng/mL、55.2ng/mL的五氯酚鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液，制作標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，同時(shí)選擇鱸魚(yú)、白鯽魚(yú)、黃骨魚(yú)、桂花魚(yú)、金鯧魚(yú)、鰱魚(yú)、鯉魚(yú)、羅非魚(yú)等8種不同陰性樣品，按照上述樣品處理步驟處理后，分別在經(jīng)EMR小柱凈化后的樣品溶液中加入五氯酚標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，配制成與上述質(zhì)量濃度范圍（0ng/mL～55.2ng/mL）一致的空白基質(zhì)系列標(biāo)準(zhǔn)溶液用作校準(zhǔn)工作曲線，按公式ME=A/B－1進(jìn)行計(jì)算，評(píng)估基質(zhì)效應(yīng)。式中：ME為基質(zhì)效應(yīng)；A為基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率；B為溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率。ME＞0，表明基質(zhì)效應(yīng)增強(qiáng)，ME＜0，表明基質(zhì)效應(yīng)抑制。|ME|=0表示不存在基質(zhì)效應(yīng)，|ME|＜0.2為弱基質(zhì)效應(yīng)，0.2≤|ME|≤0.5為中等基質(zhì)效應(yīng)，|ME|＞0.5為強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果表明，8條曲線線性相關(guān)系數(shù)均大于0.994，且|ME|均小于0.2（弱基質(zhì)效應(yīng)），表明采用Captiva EMR凈化方式能有效消除基質(zhì)效應(yīng)，本方法定性和定量均具有良好的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。

2.5方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1線性范圍、檢出限和定量限

將五氯酚系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液分別注入液相色譜-質(zhì)譜儀中，測(cè)定相應(yīng)的色譜峰面積，以工作溶液中五氯酚的質(zhì)量濃度x為橫坐標(biāo)，以峰面積y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)R²。結(jié)果表明在6種不同基質(zhì)的魚(yú)肉樣品中，五氯酚均能在質(zhì)量濃度范圍為1ng/mL～50ng/mL時(shí)，保持良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.99。在本方法測(cè)定條件下，考察五氯酚在空白樣品基質(zhì)中的檢出限和定量限，以3倍信噪比響應(yīng)（S/N=3）確定檢出限為0.2μg/kg，以10倍信噪比響應(yīng)（S/N=10）確定定量限為0.5μg/kg。該方法的定量限與GB23200.92—2016相比更低，適用于魚(yú)肉中五氯酚殘留量的檢測(cè)，且能夠滿足相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的要求。

2.5.2回收率及精密度試驗(yàn)

為驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確度，分別在空白樣品中加入不同水平的五氯酚標(biāo)準(zhǔn)溶液，對(duì)3種不同的魚(yú)肉分別進(jìn)行1.1μg/kg、2.2μg/kg和11.0μg/kg三個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收試驗(yàn)，按照新建立的EMR固相萃取凈化方法提取樣品中的五氯酚殘留量，采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)，平行測(cè)定6次，考察加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。結(jié)果顯示，五氯酚平均回收率均在81.7%～94.2%范圍內(nèi)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）范圍為1.5%～7.1%，均小于10%，驗(yàn)證了所建立的分析方法準(zhǔn)確度好、精密度高。

2.6實(shí)際樣品測(cè)定

用本文建立的EMR固相萃取凈化結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法對(duì)佛山市市場(chǎng)隨機(jī)采購(gòu)的15份新鮮魚(yú)肉樣品和2份標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控樣品進(jìn)行篩查分析，顯示2份標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控樣品均檢出五氯酚，質(zhì)量濃度分別為1.8μg/kg和3.4μg/kg，其余樣品均未檢出五氯酚，其中1份質(zhì)控樣品的色譜圖如圖2所示。采用GB 23200.92—2016對(duì)陽(yáng)性樣品進(jìn)行復(fù)驗(yàn)，其檢出值分別為2.0μg/kg和3.1μg/kg，結(jié)果表明，兩種檢測(cè)方法結(jié)果相近，且結(jié)果在證書(shū)參考值范圍內(nèi)，表明本研究建立的分析方法具有良好的準(zhǔn)確性，且檢測(cè)過(guò)程更簡(jiǎn)便、快速。

3結(jié)論

本研究建立EMR固相萃取結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定魚(yú)肉中五氯酚殘留的分析方法。本方法在1μg/kg～50μg/kg濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（R²）均大于0.99，方法檢出限為0.2μg/kg，定量限為0.5μg/kg，平均回收率在81.7%～94.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.5%～7.1%（n=6），適用于魚(yú)肉樣品中五氯酚殘留檢測(cè)的要求。相比GB 23200.92—2016的前處理方法，本方法操作更簡(jiǎn)單，大大縮短了整個(gè)樣品前處理時(shí)間，分析成本更低。經(jīng)驗(yàn)證，本方法測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，技術(shù)指標(biāo)也能夠滿足其他水產(chǎn)品中五氯酚殘留分析檢測(cè)要求，可用于動(dòng)物性食品中五氯酚殘留量的定性定量測(cè)定和食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)大批量樣品的快速篩查分析，篩查獲得的陽(yáng)性樣品可通過(guò)國(guó)標(biāo)方法做進(jìn)一步確證和準(zhǔn)確定量。