【關(guān)鍵詞】DNA納米花；缺氧；肺癌；反義寡核苷酸

【中圖分類號】R734.2 【 文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A 【收稿日期】2023-11-10

化療是臨床肺癌治療的主要方式之一，其療效往往受到實(shí)體腫瘤微環(huán)境的影響[1-3]，其中缺氧是肺癌耐藥、轉(zhuǎn)移的重要誘導(dǎo)因素之一[4]。缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）是一種與缺氧高度相關(guān)的蛋白，也是癌癥進(jìn)展與治療的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[5]。HIF-1α 不僅可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移以及血管異常[6]，還會(huì)通過誘導(dǎo)外排藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的耐藥性[7]。因此，抑制HIF-1α的表達(dá)有利于削弱腫瘤細(xì)胞的耐藥性并提高化療藥物對腫瘤的治療效果。目前已有多種技術(shù)被用于特異性抑制基因表達(dá)[8-9]，其中，反義技術(shù)是一種通過沃森-克里克堿基互補(bǔ)原理來干擾基因表達(dá)的手段，其最常使用的反義寡核苷酸（antisense oligonucleotide，ASO）也被視作一種新型藥物[10]。與傳統(tǒng)藥物相比，ASO直接在基因?qū)用姘l(fā)揮作用，干擾蛋白質(zhì)的翻譯，具有高度特異性、合成簡單等優(yōu)點(diǎn)，因而備受關(guān)注[11]。

DNA納米花（DNA nanoflower，DF）是一類以焦磷酸鹽為核心的具有多孔花瓣?duì)罱Y(jié)構(gòu)的DNA無機(jī)雜化納米材料，具有良好的生物相容性、穩(wěn)定性、pH響應(yīng)性和核酸序列可編輯等特點(diǎn)[9，12]。DF表面致密纏繞的DNA長鏈能有效抵抗核酸酶的水解，亦可作為ASO、核酸酶等來抑制特定基因的表達(dá)[9]。阿霉素（doxorubicin，DOX）是一種臨床常用的蒽環(huán)類化療藥物，被用于多種腫瘤的治療[13-14]，可以通過氫鍵和靜電吸附作用嵌入DNA堿基當(dāng)中[12]。由此可見，DF可作為運(yùn)輸DOX和ASO的納米載體，用于治療腫瘤。

本研究制備含有AS1411 適配體和HIF-1αASO 并載有化療藥物DOX 的DNA 納米花（DHADDF），其具有靶向連接小鼠肺癌（lewis lung carci?noma，LLC）細(xì)胞、催化活性氧（reactive oxygen spe?cies，ROS）生成、抑制HIF-1α表達(dá)等功能，能有效抑制LLC細(xì)胞增殖、遷移及侵襲。本研究旨在應(yīng)用該納米載體高效且安全地遞送藥物，抑制LLC細(xì)胞HIF-1α的表達(dá)并削弱缺氧導(dǎo)致的耐藥、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等不利影響，為臨床腫瘤治療提供一種新的治療策略。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

本研究所用DNA模板及引物由上海生工生物工程股份有限公司代為合成與純化，見表1；T4 DNA連接酶、DNA lad?der購自北京Takara公司；dNTPs溶液購自上海生工生物工程股份有限公司；二苯基異苯并呋喃（1，3-diphenylisobenzo?furan，DPBF）、異硫氰基熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標(biāo)記dUTP 購自美國sigma-Aldrich 公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、DMEM 培養(yǎng)基購自美國Gibco 公司；Phi29 DNA聚合酶、瓊脂糖和DNA酶I（deoxyribonucleaseI，DNase I）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司； 細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑（cell counting kit-8，CCK-8）購自日本Dojindo研究所；Falcon細(xì)胞培養(yǎng)小室購自美國Corning公司；Matrigel基質(zhì)膠購自美國Invitrogen公司；產(chǎn)氣厭氧袋購自日本三菱瓦斯化學(xué)株式會(huì)社；HIF-1α一抗（NB100-105）購自諾偉司國際貿(mào)易（上海）有限公司。

掃描電子顯微鏡（scanning electron microscopy，SEM）和能量色散X射線能譜（energy dispersive spectroscopy，EDS）購自日本Hitachi公司；馬爾文激光粒度儀（dynamic light scat?tering，DLS）購自美國Zetasizer 公司；激光共聚焦顯微鏡（confocal laser scanning microscopy，CLSM）購自日本Nikon公司；電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀（inductively coupledplasma optical emission spectrometer，ICP-OES）、多功能酶標(biāo)儀、恒溫混勻儀購自美國Thermo Scientific科技公司；紫外分光光度計(jì)購自日本島津制作所。

1.2 細(xì)胞來源及培養(yǎng)

LLC細(xì)胞株購自上海富衡生物科技有限公司，人支氣管上皮樣細(xì)胞系16HBE細(xì)胞株由重慶醫(yī)科大學(xué)腫瘤學(xué)及表觀遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。LLC細(xì)胞和16HBE細(xì)胞均使用含10%FBS和1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，在5% CO2、37 ℃恒溫濕潤的條件下培養(yǎng)。

1.3 方法

1.3.1 DNA納米花的制備及表征 DNA納米花的制備流程見圖1。

1.3.1.1 環(huán)化反應(yīng) 將DNA模板鏈（終濃度為1 μmol/L）和對應(yīng)的引物鏈（終濃度為1.5 μmol/L）加入到T4核酸連接酶緩沖體系中，退火后加入T4 DNA 連接酶（17.5 U/μL），于16 ℃反應(yīng)13 h，65 ℃反應(yīng)10 min使酶失活以終止反應(yīng)。

1.3.1.2 滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng) 將環(huán)狀DNA 模板（0.5 μmol/L）、Phi29 DNA 聚合酶（1 U/μL）、dNTP 混合液（8 mmol/L）加入到RCA 反應(yīng)體系[50 mmol/L Tris-HCl，15 mmol/L MnCl₂，10 mmol/L（NH₄）₂SO₄，4 mmol/L DTT]中混勻?；旌衔镏糜诤銣鼗靹騼x上30 ℃反應(yīng)10 h，最后加熱至65 ℃反應(yīng)10 min以終止反應(yīng)。所得產(chǎn)物經(jīng)10 000 r/min離心獲取沉淀，去離子水洗滌3次后置于4 ℃冰箱保存。用表1所示模板分別制備DHA-DF、DH-DF、DA-DF、HA-DF。在RCA反應(yīng)體系中加入FITC標(biāo)記的dUTP，合成FITC-DHA-DF和FITC-DH-DF。

1.3.1.3 DNA 納米花的表征 2% 瓊脂糖凝膠電泳檢測引物、模板、環(huán)化產(chǎn)物、RCA 產(chǎn)物的相對分子量。DLS 檢測DHA-DF的粒徑及電位。SEM觀察DHA-DF的表觀形貌并通過EDS分析其元素組成。

1.3.2 DNA 納米花的穩(wěn)定性和pH 響應(yīng)性 為驗(yàn)證DHADF的血清穩(wěn)定性和抗核酸酶降解能力，將DHA-DF 與含10% FBS和10 U/mL DNase I的DMEM培養(yǎng)基混合，于37 ℃條件下孵育并在第12、24、36、48 h取樣。為驗(yàn)證DHA-DF的pH響應(yīng)性，將DHA-DF用MES（pH 5.5）溶液重懸，于12、24、36、48 h取樣并調(diào)節(jié)pH至7.0。對上述樣品進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳和DLS檢測。

1.3.3 DNA納米花的載藥和釋藥 將DOX與DF共同孵育，于不同時(shí)間點(diǎn)離心獲取上清液，使用紫外分光光度計(jì)測量233 nm處的吸光度（absorbance，A）值用以計(jì)算DHA-DF和HA-DF的載藥率。同時(shí)測量DOX、DHA-DF、DHA-DDF的紫外光譜，CLSM觀察FITC-DHA-DDF，以驗(yàn)證DOX的成功負(fù)載。將DHA-DDF沉淀用MES（pH 5.5）溶液重懸，于不同時(shí)間點(diǎn)（0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00、12.00、24.00、48.00 h）取上清液測量233 nm處的A值。上清液同時(shí)用ICP-OES測量Mn2+的含量。DOX載藥率、DOX釋放率和Mn2+釋放率計(jì)算公式如下：DOX 載藥率（%）=DOX 負(fù)載量/納米花質(zhì)量×100%；DOX 釋放率（%）=DOX 釋放量/DOX 負(fù)載量×100%；Mn²⁺釋放率（%）=Mn²⁺釋放量/Mn²⁺負(fù)載量×100%。

1.3.4 活性氧產(chǎn)生能力評價(jià) 將DPBF溶液分別與去離子水、DOX、MnCl₂、DHA-DDF（pH7.2）或DHA-DDF（pH5.5）混合，再加入H₂O₂ 溶液（終濃度為1.5%）。每3 min測定11次420 nm處的A 值，將第x分鐘的A 值定義為I_x。根據(jù)體系中DPBF的消耗來評價(jià)催化活性氧產(chǎn)生的能力，計(jì)算公式如下：DPBF消耗率（%）=（I₀-I_x）/I₀×100％。

1.3.5 DNA納米花的靶向性驗(yàn)證 將LLC細(xì)胞以1×10⁵個(gè)/孔的密度接種于共聚焦皿中并孵育24 h，加入2 μg/mLFITC-DHA-DDF或FITC-DH-DDF懸液（本研究細(xì)胞實(shí)驗(yàn)部分所用藥物均以無血清DMEM 培養(yǎng)基配制，藥物濃度以DOX計(jì)）。孵育3 h，用4%多聚甲醛固定，DAPI染液染色，每個(gè)步驟結(jié)束后用PBS 洗滌3 次。CLSM 觀察LLC 細(xì)胞與FITC-DHA-DDF或FITC-DH-DDF的連接情況。

1.3.6 DNA納米花的安全性驗(yàn)證 將生長良好的16HBE細(xì)胞以5×10⁴ 個(gè)/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h后，與不同濃度DOX 或DHA-DDF 溶液（0.00、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00 μg/mL）共同孵育4 h。PBS洗去多余藥物，更換新的無血清DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育，并分別于第24、48和72 h使用CCK-8試劑檢測16HBE細(xì)胞的細(xì)胞活性。

1.3.7 DNA納米花對LLC細(xì)胞活性的影響

1.3.7.1 CCK-8 法測定半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC₅₀） 將生長良好的LLC 細(xì)胞以5×10⁴ 個(gè)/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板中并在缺氧環(huán)境中培養(yǎng)24 h（后續(xù)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理均在缺氧條件下進(jìn)行）。分為DOX 組、DA-DDF 組和DHA-DDF 組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。用不同濃度的DOX、DA-DDF、DHA-DDF 溶液（0.00、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00 μg/mL）孵育4 h，PBS 洗滌3 次并更換新的培養(yǎng)基，24 h后用CCK-8試劑檢測LLC細(xì)胞的活性并計(jì)算各種藥物的IC₅₀。

1.3.7.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期 將生長良好的LLC細(xì)胞接種于6孔板，分為對照組、DOX組、DA-DDF組和DHADDF組，分別使用無血清DMEM 培養(yǎng)基、DOX、DA-DF 和DHA-DDF溶液處理4 h（實(shí)驗(yàn)組的DOX濃度為2 μg/mL），更換新的無血清培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)24 h。收集1×10⁶個(gè)細(xì)胞，1500 r/min離心5 min，PBS洗滌，加入預(yù)冷的70%乙醇固定4 h。1 500 r/min離心去除上清后，加入RNA水解酶和碘化丙啶（propidium iodine，PI）室溫避光染色30 min。用流式細(xì)胞儀檢測并分析結(jié)果。

1.3.8 DHA-DDF對LLC細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響

1.3.8.1 劃痕實(shí)驗(yàn) 將LLC細(xì)胞接種于6孔板，培養(yǎng)至細(xì)胞長滿后用無菌槍頭劃線，PBS 清洗。分組及藥物處理同“1.3.7.2”。在第0 h和24 h觀察并拍照，利用Image J軟件測量各組劃痕面積變化來評價(jià)LLC細(xì)胞的遷移能力。

1.3.8.2 Transwell 小室實(shí)驗(yàn) Matrigel 基質(zhì)膠與無血清DMEM 培養(yǎng)基混合（1∶8）后加入上室凝固成型，上室加入300 μL濃度為5×10⁴個(gè)/mL的LLC細(xì)胞懸液（分組及處理同上），并在下室中加入800 μL含20% FBS的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。4 ℃甲醇固定后用1%結(jié)晶紫溶液染色，PBS洗凈、陰干后觀察計(jì)數(shù)。

1.3.9 DHA-DDF對HIF-1α表達(dá)的影響 將LLC細(xì)胞以1×106個(gè)/孔接種于6孔板，貼壁后加入藥物孵育4 h（分組及處理同“1.3.7.2”），提取各組LLC細(xì)胞總的蛋白及mRNA。

1.3.9.1 蛋白免疫印記實(shí)驗(yàn)（Western boltting，WB） 蛋白樣品行SDS-PAGE凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。封閉后，依次敷抗體和TBST清洗，最后滴加發(fā)光液顯影成像。

1.3.9.2 定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative polymerase chain re?action，qPCR） mRNA 樣品根據(jù)說明書操作步驟進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和定量，以β-actin作為內(nèi)參，通過2-ΔΔCt法計(jì)算HIF-1α的相對表達(dá)量。HIF-1α 上游引物：5’-ACCCATTCCTCATCCGTCAA-3’，下游引物：5’-CTTCCGGCTCATAACCCATC-3’。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行繪圖與數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，2組間比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 DF的物理特性

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示（圖2A），環(huán)化產(chǎn)物比模板鏈移動(dòng)更慢，而RCA產(chǎn)物則停留在加樣孔處，證明成功制備環(huán)狀DNA模板并通過RCA反應(yīng)合成具有大分子量的DNA產(chǎn)物。SEM觀察結(jié)果（圖2B）顯示，RCA產(chǎn)物為具有多孔花瓣?duì)罱Y(jié)構(gòu)的球形顆粒，證明成功合成DF。DLS 分析結(jié)果（圖2C、2D）顯示，DHA-DF的平均粒徑為（421.26±7.90） nm，平均電位為（-18.0±1.8） mV。通過EDS分析DHA-DF中的元素組成（圖2E），檢測到C、N、O、P及Mn元素。DF為DNA與焦磷酸錳自組裝形成的產(chǎn)物，而C、N、O、P及Mn為DNA和焦磷酸錳的主要組成元素。

2.2 DF具有良好的穩(wěn)定性和pH響應(yīng)性

使用DNase I和FBS模擬體內(nèi)富含核酸酶的環(huán)境，檢驗(yàn)DHA-DF的穩(wěn)定性。2%瓊脂糖凝膠結(jié)果（圖2F）顯示，通道2～5內(nèi)的DHA-DF仍停留在加樣孔處，表明其仍具有較高的相對分子量。DLS結(jié)果（圖2H）也顯示，48 h內(nèi)DHA-DF的粒徑未見明顯變化。上述結(jié)果表明，經(jīng)DNase I和FBS處理48 h內(nèi)，DHA-DF未被分解，具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性。

使用MES溶液模擬腫瘤內(nèi)部酸性環(huán)境，驗(yàn)證DHA-DF的pH響應(yīng)性。如圖2G所示，通道2～5內(nèi)的DHA-DF均停留在加樣孔附近，然而DLS結(jié)果（圖2H）顯示，經(jīng)MES處理后，DHA-DF粒徑隨時(shí)間逐漸減小。由上述結(jié)果推測，在酸性環(huán)境下，DHA-DF的焦磷酸錳內(nèi)核逐漸分解導(dǎo)致其粒徑改變，而長鏈DNA仍維持結(jié)構(gòu)及功能完整。

2.3 DF的載藥和釋藥

負(fù)載DOX后DNA納米花由白色變?yōu)榧t色（圖3A），具有與DOX相似的紫外吸收光譜，在233 nm和480 nm處有特異性吸收峰（圖3B）。CLSM觀察FITC-DHA-DDF（圖3C），鏡下所見為橙紅色顆粒點(diǎn)。如圖3D所示，DF在較短時(shí)間（1 h內(nèi)）即可完成對DOX的裝載，其中DHA-DF的DOX負(fù)載率為（59.96±2.64）%，高于無載藥序列HA-DF 的（34.49±4.19）%。DHA-DDF 的DOX 釋放結(jié)果（圖3E）顯示：DHADDF在中性條件下（pH=7.4）較為穩(wěn)定，48 h累計(jì)釋放率僅為（8.33±0.69）%；在酸性條件下，DOX能快速釋放，48 h累計(jì)釋放率達(dá)（86.19±2.69）%。Mn2+在酸性條件下?lián)碛信cDOX相似的釋放曲線（圖3F）。

2.4 DHA-DDF催化ROS生成

通過檢測DPBF的消耗來反映ROS的產(chǎn)量（圖4A），在無DOX和MnCl2的作用時(shí)，DPBF緩慢消耗，15 min內(nèi)消耗率僅為（5.89±0.06）%。在DOX或MnCl₂存在的情況下，15 min內(nèi)的DPBF 的消耗率分別為（25.95±0.36）% 和（19.55±1.50）%。在中性條件下，DHA-DDF催化ROS產(chǎn)生的能力較弱，DPBF消耗率為（16.81±0.07）%；酸性條件下DHA-DDF具有較強(qiáng)的催化ROS 產(chǎn)生能力，15 min 內(nèi)DPBF 消耗率為（36.41±0.48）%。結(jié)果表明，DHA-DDF在酸性環(huán)境下具有較強(qiáng)的催化ROS產(chǎn)生的能力。

2.5 DHA-DDF具有靶向性

通過CLSM 觀察LLC 細(xì)胞與FITC-DHA-DDF 或FITCDH-DDF 的連接情況（圖4B），在相同參數(shù)條件下，F(xiàn)ITCDHA-DDF 組LLC 細(xì)胞表面熒光信號強(qiáng)度高于FITC-DHDDF組，表明FITC-DHA-DDF與LLC細(xì)胞具有更高的連接率。該實(shí)驗(yàn)證明含有AS1411序列的DHA-DF具有特異性識(shí)別并連接LLC細(xì)胞的能力。

2.6 DHA-DDF具有良好的生物相容性

使用CCK-8 試劑檢測經(jīng)DHA-DDF 或DOX 處理后的16HBE 細(xì)胞活性（圖4C～E）。相同濃度條件下，DOX 對16HBE細(xì)胞活性的影響更加明顯，而DHA-DDF對16HBE細(xì)胞活性影響較小。在72 h時(shí)，濃度為8 μg/mL時(shí)，經(jīng)DOX處理后16HBE 細(xì)胞的相對細(xì)胞活性僅為（0.802±0.61）%，而經(jīng)DHA-DDF 處理的16HBE 細(xì)胞的相對細(xì)胞活性為（46.23±0.58）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=36.401，P=0.000），表明通過DHA-DF負(fù)載DOX的形式能夠降低DOX對正常細(xì)胞的毒性作用。

2.7 DHA-DDF能有效抑制LLC細(xì)胞增殖

使用CCK-8檢測來評價(jià)DOX、DA-DDF和DHA-DDF對LLC細(xì)胞活性的影響（圖5A），在相同濃度下，DHA-DDF對LLC細(xì)胞活性的影響明顯高于DOX和DA-DDF（t=3.793，Plt;0.05），可見DHA-DDF 對LLC 細(xì)胞具有更強(qiáng)的細(xì)胞毒性。當(dāng)DOX終濃度為2 μg/mL時(shí)，經(jīng)DHA-DDF處理過后的LLC細(xì)胞的相對細(xì)胞活為（62.91±0.43）%，與DOX（t=27.733，P=0.000）和DA-DDF（t=15.208，P=0.000）形成明顯差異。進(jìn)一步分析得出，在缺氧狀況下，DOX、DA-DDF 和DHADDF對LLC 細(xì)胞的IC₅₀ 分別為2.607、1.846和1.661 μg/mL。上述結(jié)果表明，DHA-DDF在缺氧條件下對LLC細(xì)胞活性的抑制作用強(qiáng)于DOX和DA-DDF。

流式檢測結(jié)果顯示（圖5B），經(jīng)DHA-DDF處理后，滯留于G2/M期的細(xì)胞比例增加，為（40.50±2.86）%，高于DOX組（t=7.428，P=0.002）與DA-DDF 組（t=4.275，P=0.013），表明DHA-DDF能有效抑制LLC細(xì)胞增殖。

2.8 DHA-DDF有效抑制LLC細(xì)胞遷移和侵襲

通過細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell 小室實(shí)驗(yàn)評價(jià)DHADDF對LLC 細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖6A、B）顯示，DHA-DDF處理LLC細(xì)胞24 h過后的劃痕愈合面積為（0.388±0.034） mm²，明顯低于DOX 處理的（0.567±0.037）mm²，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.178，P=0.004）。Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖6C、D）顯示，與DOX處理相比，DHA-DDF 處理組穿過Matrigel 基質(zhì)膠的LLC 細(xì)胞數(shù)量減少，為（82.00±12.12）個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.169，P=0.001）。上述結(jié)果表明，DHA-DDF能有效抑制LLC細(xì)胞的遷移及侵襲能力。

2.9 DHA-DDF有效降低HIF-1α的表達(dá)

通過蛋白質(zhì)印記實(shí)驗(yàn)檢測不同實(shí)驗(yàn)組LLC細(xì)胞HIF-1α表達(dá)水平的變化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖7A）顯示，與DOX和DA-DDF組相比，DHA-DDF組LLC細(xì)胞的HIF-1α的表達(dá)水平降低。

qPCR結(jié)果顯示（圖7B），與對照組相比，經(jīng)DHA-DDF處理后的LLC細(xì)胞HIF-1α mRNA的表達(dá)水平降低（t=14.750，P=0.000），而DOX 和DA-DDF 組LLC 的HIF-1α mRNA 表達(dá)水平未見明顯變化。

3討論

近年來，腫瘤治療技術(shù)正朝著安全高效的方向發(fā)展，而納米技術(shù)的日益成熟為之提供了便利[15]。納米材料可以用來彌補(bǔ)傳統(tǒng)藥物的不足，實(shí)現(xiàn)藥物的高效組裝及遞送[16]。DNA 納米花是一種優(yōu)秀的DNA無機(jī)雜化納米材料，可靈活設(shè)計(jì)從而滿足不同治療策略的需求。

DOX具有較強(qiáng)的副作用，往往誘發(fā)心肌損傷和骨髓抑制等不良反應(yīng)，不利于治療的進(jìn)行。本研究通過RCA 反應(yīng)制備的DHA-DDF 具有良好的穩(wěn)定性（圖2F、2H），可以避免藥物的提前釋放，通過安全性實(shí)驗(yàn)（圖4C～F）證明負(fù)載DOX的DHA-DDF對正常細(xì)胞的毒性較弱，具有良好的生物相容性。DHA-DDF 表面的AS1411 適配體能與癌細(xì)胞膜表面過表達(dá)的核仁素特異性結(jié)合[17]，增強(qiáng)DHA-DDF與LLC細(xì)胞的連接效率（圖4B），有利于DHA-DDF在靶區(qū)的積累。DHA-DDF 還具有pH 響應(yīng)性（圖3E、3F），其核心組分焦磷酸錳能在實(shí)體腫瘤的酸性微環(huán)境中快速崩解，進(jìn)而加速DOX的釋放[18]。DOX和Mn²⁺具有催化ROS產(chǎn)生的能力[19]，攜帶有DOX和Mn²⁺的DHA-DDF 能夠產(chǎn)生較多的ROS（圖4A）。ROS可以通過氧化脂質(zhì)、損傷DNA、促使蛋白質(zhì)斷裂等多種途徑誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡[20-21]。因此本研究制備的DNA納米花具有特異性殺傷腫瘤細(xì)胞的能力，可以作為遞送DOX的優(yōu)秀載體。

目前，有許多腫瘤治療方式會(huì)消耗氧氣、加重缺氧，進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤耐藥的發(fā)生，增加了治療難度[20，22]。為減少腫瘤缺氧對治療的不利影響，我們在制備DNA納米花的模板鏈中添加了HIF-1α反義序列來抑制HIF-1α的表達(dá)，用以削弱LLC細(xì)胞對DOX 的耐藥性，增強(qiáng)DOX 對LLC 細(xì)胞的療效。經(jīng)DHA-DDF處理后，LLC細(xì)胞HIF-1α的表達(dá)水平降低（圖7A、7B）。與DA-DDF 相比，DHA-DDF 具有更低的IC₅₀，且經(jīng)DHA-DDF 處理后的LLC 細(xì)胞也表現(xiàn)出更弱的增殖、遷移及侵襲等能力（圖5B、圖6A～D），表明抑制HIF-1α 表達(dá)后，LLC 細(xì)胞對DOX的敏感性增強(qiáng)。

綜上所述，本研究成功制備具有靶向、催化ROS生成、特異性抑制HIF-1α表達(dá)等多種功能的DNA納米花，具有良好的生物相容性，能有效抑制LLC細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲，有望為臨床腫瘤治療提供新的思路。