【關(guān)鍵詞】苦黃顆粒；膽汁淤積；肝損傷；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；FXR通路

【中圖分類號】R285.5 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A 【收稿日期】2023-11-30

膽汁淤積是由于膽汁形成、分泌和排泄異常，導(dǎo)致膽汁酸過度蓄積，進(jìn)而引起肝損傷。該病癥主要表現(xiàn)為肝功能異常、黃疸和皮膚瘙癢等癥狀，最終可能演變?yōu)楦渭?xì)胞凋亡、肝纖維化，甚至肝衰竭[1-2]。鑒于膽汁淤積的發(fā)病機(jī)制極為復(fù)雜，目前治療該病的藥物選擇相當(dāng)有限。在臨床上，通常采用熊去氧膽酸、奧貝膽酸和糖皮質(zhì)激素等藥物進(jìn)行治療。然而，這些藥物存在著價(jià)格昂貴、部分患者治療反應(yīng)不佳或無法耐受，以及可能引發(fā)皮膚瘙癢等副作用[3-4]。因此，開發(fā)針對抗膽汁淤積性肝損傷的新藥物具有重要意義。

傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論將膽汁淤積歸入“黃疸”范疇，《金匱要略》指出黃疸病“從濕得之”，清熱利濕退黃是治療黃疸的基本法則?？帱S顆粒源于《傷寒論》中的“茵陳蒿湯”，經(jīng)后世改良開發(fā)所得，主要由苦參、大黃、茵陳、柴胡和大青葉五味中藥組成，具有清熱利濕、疏肝退黃的功效[5]。研究表明，苦黃顆粒具有改善黃疸型病毒性肝炎、非酒精性脂肪性肝病和急性藥物性肝損傷等多種保肝作用[6-8]。然而，苦黃顆粒是否具有減輕膽汁淤積肝損傷的作用及其潛在機(jī)制尚不明確。

為揭示苦黃顆粒對膽汁淤積的治療作用和分子機(jī)制，本研究綜合了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、生物信息學(xué)和分子生物學(xué)等系統(tǒng)藥理學(xué)方法，初步探討了苦黃顆粒治療膽汁淤積的關(guān)鍵靶點(diǎn)和潛在通路，旨在為苦黃顆粒在抗膽汁淤積的臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 化學(xué)品與試劑

苦黃顆粒（批號：VC14009），購于雷允上藥業(yè)集團(tuán)有限公司；α-萘異硫氰酸酯（alpha-naphthyl isothiocyanate，ANIT，批號：140018），購于美國Sigma公司；聯(lián)苯雙酯滴丸（批號：H33021305），購于萬邦德公司；堿性磷酸酶（alkaline phos?phatase，AKP，批號：20230308）、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine trans?aminase，ALT，批號：20230307）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartateaminotransferase，AST，批號：20230308）、直接膽紅素（directbilirubin，DBIL，批號：20230308）、總膽紅素（total bilirubin，TBIL，批號：20230307）、總膽汁酸（total bile acid，TBA，批號：20230308）、超氧化物歧化酶（super oxide dismutase，SOD，批號：20230409）、丙二醛（malondialdehyde，MDA，批號：20230409）、谷胱甘肽-過氧化氫酶（glutathione peroxidase，GSH-Px，批號：202304092）均購于南京建成生物工程研究所。法尼醇X 受體（farnesoid X receptor，F(xiàn)XR）抗體（批號：001013007）購于武漢Proteintech 公司；小異二聚體伴侶（small heterodimer partner，SHP）抗體（批號：5500000677）購于ABclonal公司；膽固醇7α-羥化酶（cholesterol 7α-hydroxy?lase，CYP7A1）抗體（批號：BB09278963）購于Bioss 公司；膽鹽輸出泵（bile salt export pump，BSEP）抗體（批號：B07RC23）和多藥耐藥相關(guān)蛋白2（multidrug resistance-associated pro?tein 2，MRP2）抗體（批號：B4001）均購于immunoway公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模及分組

雄性C57BL/6J小鼠（SPF級，18～22 g，8周），購自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司[生產(chǎn)許可證號SCXK（京）2019-0010]，所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均按照SPF級標(biāo)準(zhǔn)在動(dòng)物房中進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)程序以及動(dòng)物處死方法均獲得了重慶大學(xué)附屬三峽醫(yī)院倫理委員會(huì)的審核和批準(zhǔn)（批準(zhǔn)編號：SXYYDW2023-007）。

適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，將小鼠隨機(jī)分為6組，每組8只，分別為空白組（Blank組）、模型組（Model組）、苦黃顆粒低劑量組（KH-L組，0.50 g/kg）、苦黃顆粒中劑量組（KH-M組，1.00 g/kg）和苦黃顆粒高劑量組（KH-H 組，2.00 g/kg）、聯(lián)苯雙酯組（LBSZ組，0.15 g/kg）。其中苦黃顆粒臨床用量為18 g/d，生物等效量為2.34 g/kg，結(jié)合前期預(yù)實(shí)驗(yàn)，最終設(shè)置KH-L、KH-M、KH-H組為生物等效劑量0.25∶0.50∶1.00倍。參考文獻(xiàn)造模[9]，各藥物組小鼠灌胃對應(yīng)藥物，Blank組與Model組灌胃相應(yīng)體積的生理鹽水，每天1次，連續(xù)7 d。在第5天，Blank組灌胃橄欖油，其余各組均給予60 mg/kg ANIT橄欖油溶液進(jìn)行模型制備。給藥結(jié)束后，進(jìn)行眼眶采血，收集血清。同時(shí)，將肝臟置于冰上稱重，分別存放于4%多聚甲醛溶液中和-80 ℃冰箱待測。

1.3 方法

1.3.1 肝功能和膽汁酸水平檢測 按照試劑盒的使用說明書，檢測小鼠血清中ALT、AST、AKP、DBIL、TBIL 和TBA 的含量。

1.3.2 肝組織病理形態(tài)學(xué)分析 將固定好的肝臟組織進(jìn)行石蠟包埋，石蠟切片脫蠟至水、染色、脫水封片等步驟，通過光學(xué)顯微鏡鏡檢觀察各組肝組織的病理學(xué)變化。

1.3.3 肝組織氧化應(yīng)激水平檢測 按試劑盒的使用說明書，檢測各組小鼠肝組織勻漿中SOD、MDA和GSH-Px的含量。

1.3.4 苦黃顆粒成分及靶點(diǎn)的篩選 通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）和文獻(xiàn)檢索苦黃顆粒中的五味中藥，然后根據(jù)TCMSP數(shù)據(jù)庫“口服吸收度（oral bio?availability，OB）≥ 30% 和類藥性（drug-like properties，DL）≥0.18”的篩選規(guī)則收集苦黃顆?；钚猿煞旨捌湎嚓P(guān)靶點(diǎn)，并從ETCM 數(shù)據(jù)庫（http：//www.tcmip.cn/ETCM/）收集上述藥物的靶點(diǎn)進(jìn)行補(bǔ)充。借助UniProt數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org）將靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行均一化處理后，進(jìn)行合并和去重。

1.3.5 肝內(nèi)膽汁淤積靶點(diǎn)的收集 通過GEO數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）獲取GSE79850數(shù)據(jù)集，該數(shù)據(jù)集對8名健康志愿者和9名高危原發(fā)性膽汁性膽管炎（Primarybiliary cholangitis，PBC）患者的肝臟進(jìn)行了基因測序。使用R軟件的limma軟件包研究mRNA的差異表達(dá)，獲取潛在疾病靶點(diǎn)。在GeneCards（https：//www.genecards.org）、OMIM（https：//omim.org）和DisGeNET（https：//www.disgenet.org）數(shù)據(jù)庫中，以“intrahepatic cholestasis”為檢索詞，進(jìn)一步收集肝內(nèi)膽汁淤積相關(guān)疾病靶點(diǎn)。最后，將上述數(shù)據(jù)庫靶點(diǎn)進(jìn)行合并去重。

1.3.6 苦黃顆粒治療肝內(nèi)膽汁淤積靶點(diǎn)的收集和PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 苦黃顆粒活性成分和肝內(nèi)膽汁淤積相互映射，做韋恩圖，從而獲得苦黃顆粒治療肝內(nèi)膽汁淤積的潛在靶點(diǎn)。將潛在靶點(diǎn)輸入到String 數(shù)據(jù)庫（https：//cn.string-db.org/）中，以獲取蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interactions，PPI）的相關(guān)信息。接下來，采用Cytoscape軟件構(gòu)建可視化的PPI網(wǎng)絡(luò)，計(jì)算各個(gè)節(jié)點(diǎn)的Degree值，獲得PPI網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.3.7 GO和KEGG通路富集分析 將苦黃顆粒治療肝內(nèi)膽汁淤積的潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape 數(shù)據(jù)庫中，進(jìn)行GO 和KEGG的富集分析。Plt;0.01為參考閾值進(jìn)行檢索，借助微生信網(wǎng)站（http：//www.bioinformatics.com.cn）對分析結(jié)果進(jìn)行可視化處理。

1.3.8 Western blot法檢測FXR相關(guān)通路蛋白表達(dá)水平 根據(jù)文獻(xiàn)提供的實(shí)驗(yàn)方法[10]，本研究采用Western blot 技術(shù)檢測FXR、SHP、CYP7A1、BSEP 和MRP2 蛋白的表達(dá)情況。簡而言之，首先從肝組織中提取總蛋白，并在100 ℃下進(jìn)行蛋白滅活。隨后進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜和封閉等步驟。接下來，將膜放入稀釋后的FXR、SHP、CYP7A1、BSEP和MRP2等一抗（1∶1 000）中，在4 ℃孵育過夜。隨后，用TBST 洗滌膜3次，每次10 min，并與相應(yīng)的二抗（1∶5 000）在室溫孵育2 h。最后，通過化學(xué)發(fā)光的方式使蛋白條帶可視化。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，多組間比較選用單因素方差分析，所有結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（-x± s）表示，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 苦黃顆粒對ANIT所致小鼠體重和肝體比的影響

造模前，各組小鼠的精神狀態(tài)、活動(dòng)水平、飲食習(xí)性和尿液顏色等生理狀況均未顯示明顯差異。如圖1所示，給藥結(jié)束后，Model組小鼠體質(zhì)量低于Blank組（P=0.000）。如表1所示，Model 組肝體比高于Blank 組（P=0.000）；KH-H 組及LBSZ 組小鼠的肝體比低于Model 組（P=0.000，P=0.001）；KH-L、KH-M 組肝體比與Model組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.408，P=0.063）。采用單因素方差進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F _肝體比=13.358，P _肝體比=0.000）。

2.3 苦黃顆粒對ANIT所致小鼠肝臟組織病理學(xué)的影響

肝臟組織病理學(xué)顯示，Blank組小鼠肝臟呈粉、絳紅色，表面光滑，無明顯膽汁淤積；肝臟組織結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞核大而圓，核膜明顯。而ANIT處理組小鼠肝臟腫大，色澤黃變，顏色加深、膽汁淤積明顯；肝組織可見明顯炎癥浸潤、小葉間管破壞、肝壞死。KH-L、KH-M、KH-H組和LBSZ組小鼠肝臟膽汁淤積明顯改善；炎癥細(xì)胞浸潤、破壞性小葉間導(dǎo)管和壞死明顯減少。上述結(jié)果表明，苦黃顆?？擅黠@減輕ANIT引起的膽汁淤積性肝損傷（圖2）。

2.5 苦黃顆粒活性成分和靶點(diǎn)

根據(jù)TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選規(guī)則收集苦黃顆粒的活性成分及其相關(guān)靶點(diǎn)，并剔除相關(guān)無靶點(diǎn)成分。結(jié)合文獻(xiàn)和ETCM數(shù)據(jù)庫收集靶點(diǎn)，經(jīng)合并去重后，共獲得626個(gè)潛在靶點(diǎn)，見表4。

2.6 肝內(nèi)膽汁淤積疾病靶點(diǎn)的篩選

通過R語言分析發(fā)現(xiàn)GSE79850數(shù)據(jù)集中共有763個(gè)差異基因，以Plt;0.05和|logFC|≥2為篩選條件，繪制火山圖和熱圖，共獲得392個(gè)差異基因，其中308個(gè)基因上調(diào)，84個(gè)基因下調(diào)，見圖3。然后將Genecards、OMIM、Disgenet和GEO 數(shù)據(jù)庫獲得的靶點(diǎn)合并、刪除重復(fù)項(xiàng)后共獲得512個(gè)治療肝內(nèi)膽汁淤積的潛在靶點(diǎn)。

2.7 苦黃顆粒治療肝內(nèi)膽汁淤積潛在靶點(diǎn)的篩選與PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

如圖4所示，苦黃顆粒的活性成分與肝內(nèi)膽汁淤積共有55個(gè)交集靶點(diǎn)，構(gòu)建上述交集靶點(diǎn)的PPI圖，節(jié)點(diǎn)的大小和顏色反映Degree 值的大小。根據(jù)Degree 值的排序，TNF、NFKB1、NR1H4（FXR）和ABCC2（MRP2）等可能是苦黃顆粒改善肝內(nèi)膽汁淤積的關(guān)鍵靶點(diǎn)，表明苦黃顆?？赡芡ㄟ^調(diào)控其膽汁酸代謝，減輕肝內(nèi)膽汁淤積患者的炎癥，來減輕肝臟損傷。

2.8 苦黃顆粒治療肝內(nèi)膽汁淤積潛在靶點(diǎn)的富集分析

使用Metascape 對上述55 個(gè)潛在治療靶點(diǎn)進(jìn)行GO 和KEGG通路分析。圖5A的GO富集分析表明苦黃顆粒治療膽汁淤積主要與細(xì)胞對脂質(zhì)的反應(yīng)、炎癥反應(yīng)和炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)等生物進(jìn)程；與細(xì)胞膜、受體復(fù)合物和頂端質(zhì)膜等細(xì)胞成分；與核受體活性、細(xì)胞因子受體結(jié)合和類固醇結(jié)合等分子功能有關(guān)。根據(jù)P 值大小對KEGG富集通路進(jìn)行分析，苦黃顆?？赡芡ㄟ^調(diào)控腫瘤壞死因子信號通路和膽汁分泌等信號通路改善膽汁淤積，主要涉及炎癥反應(yīng)、膽汁酸分泌等相關(guān)生物進(jìn)程，見圖5B。

2.9 苦黃顆粒對FXR通路相關(guān)蛋白的影響

為了驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測的準(zhǔn)確性，本研究使用Western blot來檢測苦黃顆粒對FXR通路相關(guān)蛋白的影響。如圖6 和表5 所示，Model 組小鼠的肝組織中FXR、SHP、BSEP 和MRP2 的蛋白表達(dá)水平低于Blank 組（P=0.000、P=0.003、P=0.001、P=0.005），CYP7A1 蛋白表達(dá)水平高于Blank 組（P=0.010）；KH-M 組FXR、SHP、BSEP 和MRP2 蛋白表達(dá)水平高于Model 組（P=0.021、P=0.034、P=0.021、P=0.333、P=0.013），CYP7A1 蛋白表達(dá)水平低于Model 組（P=0.037）；KH-H組FXR、SHP、BSEP和MRP2蛋白表達(dá)水平高于Model 組（P=0.006、P=0.007、P=0.000、P=0.000），CYP7A1蛋白表達(dá)水平低于Model組（P=0.009）；LBSZ組FXR、SHP、BSEP 和MRP2 蛋白表達(dá)水平高于Model 組（P=0.005、P=0.016、0.008、P=0.001），CYP7A1蛋白表達(dá)水平低于Model組（P=0.012）。采用單因素方差進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F_FXR=9.899；P_FXR=0.000；F_SHP=6.293，P_SHP=0.000；F_BSEP=8.312 ，P_BSEP=0.000 ；F_MRP2=9.115 ，P_MRP2=0.000 ；F_CYP7A1=4.936，P_CYP7A1=0.000），上述結(jié)果表明，苦黃顆粒通過加速膽汁酸的排泄和轉(zhuǎn)運(yùn)、維持膽汁酸穩(wěn)態(tài)來保護(hù)肝細(xì)胞。

3 討論

膽汁淤積與肝細(xì)胞損傷、進(jìn)行性肝纖維化、肝硬化以及肝功能衰竭等密切相關(guān)。在膽汁淤積中可觀察到膽汁酸分泌紊亂、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)等多種反應(yīng)[11-12]。因此，膽汁酸紊亂被認(rèn)為是膽汁淤積性損傷發(fā)病機(jī)制中的決定性因素，而恢復(fù)膽汁酸穩(wěn)態(tài)被認(rèn)為是推薦的治療策略。

ANIT是一種常用于嚙齒動(dòng)物的肝毒劑，可用于模擬人類肝內(nèi)膽汁淤積，小鼠攝入ANIT后，會(huì)釋放大量炎癥因子，引起肝臟炎癥損傷[13-14]。同時(shí)，肝臟內(nèi)膽汁酸的積累促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)過量ROS的產(chǎn)生，誘發(fā)肝臟氧化應(yīng)激損傷。本研究顯示，與空白組相比，模型組小鼠肝損傷和膽汁淤積的標(biāo)志物顯著升高，SOD、GSH-Px等氧化應(yīng)激指標(biāo)顯著下降，與之前的報(bào)道一致[15]。重要的是，苦黃顆?？山档透螕p傷和膽汁淤積的血清標(biāo)志物，并抑制肝臟SOD、GSH-Px等氧化應(yīng)激水平的下降。組織病理學(xué)評估進(jìn)一步表明苦黃顆粒可通過減少細(xì)胞壞死和炎癥細(xì)胞浸潤，對ANIT誘導(dǎo)的肝內(nèi)膽汁淤積發(fā)揮保肝作用。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)通過構(gòu)建基于生物活性化合物、靶點(diǎn)和生物功能的復(fù)雜相互作用網(wǎng)絡(luò)，廣泛應(yīng)用于闡明中藥配方的生物學(xué)機(jī)制[16-17]。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析TNF、NFKB1、NR1H4（FXR）和ABCC2（MRP2）等可能是苦黃顆粒改善肝內(nèi)膽汁淤積的關(guān)鍵靶點(diǎn)，大多數(shù)與肝臟疾病的進(jìn)展有關(guān)。生物信息學(xué)分析炎癥相關(guān)差異基因在PBC病人肝臟中顯著上調(diào)，炎癥反應(yīng)會(huì)抑制多種參與維持膽汁酸相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)和活性，表明抑制炎癥反應(yīng)是防治膽汁淤積的一條潛在途徑。有研究表明FXR可以通過抑制相關(guān)受體從而抑制多種炎癥因子的表達(dá)[18]。

為了進(jìn)一步探索潛在機(jī)制，通過GO 和KEGG富集分析上述潛在靶點(diǎn)。結(jié)合PPI網(wǎng)絡(luò)分析，選擇了FXR信號通路進(jìn)行進(jìn)一步研究，重要的是，F(xiàn)XR通路廣泛參與TNF信號通路和膽汁分泌等信號通路[19-20]。這些結(jié)果表明FXR通路可能是苦黃顆粒抗膽汁淤積關(guān)鍵信號通路。為了更好地揭示苦黃顆?？鼓懼俜e的潛在作用機(jī)制，本研究采用Westernbolt對FXR通路相關(guān)蛋白進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果顯示，模型組FXR、SHP、BSEP和MRP2的表達(dá)量降低，而苦黃顆粒組這些蛋白的表達(dá)顯著升高。上述結(jié)果表明，苦黃顆粒通過調(diào)控FXR通路加速膽汁酸的排泄和轉(zhuǎn)運(yùn)、維持膽汁酸穩(wěn)態(tài)來保護(hù)肝細(xì)胞。

然而，本文仍存在一些局限性：①網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)以中藥中的化學(xué)成分為研究對象；然而，中藥藥效所涉及的化學(xué)物質(zhì)不一定是單一成分，因?yàn)橛行镔|(zhì)可能是一組藥效成分。由于中藥中物質(zhì)的作用靶點(diǎn)和途徑通常是已知的，因此新機(jī)制的發(fā)現(xiàn)存在局限性。未來，人工智能算法可以與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合，以獲得更全面、客觀的信息。②本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法將FXR通路確立為苦黃顆粒治療膽汁淤積的關(guān)鍵通路，因?yàn)镕XR在黃疸型病毒性肝炎、非酒精性脂肪性肝病這些肝臟疾病的發(fā)生和進(jìn)展中起著核心作用。然而苦黃顆粒是否是直接或間接的FXR激動(dòng)劑有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)苦黃顆粒可能通過激活FXR通路緩解急性肝內(nèi)膽汁淤積并預(yù)防膽汁淤積引起的肝損傷，從而為苦黃顆粒治療膽汁淤積的臨床應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。