摘要：CREBRF 基因在雌性動(dòng)物生殖過(guò)程中具有重要調(diào)控作用，為了深入了解豬的CREBRF 基因特征和功能，對(duì)CREBRF 基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并通過(guò)RT-qPCR分析不同階段巴馬豬卵巢組織中CREBRF 的表達(dá)規(guī)律。結(jié)果顯示，在5個(gè)品種豬基因組上鑒定到20個(gè)CREBRF 基因的堿基突變，其中7個(gè)為同義突變，13個(gè)為錯(cuò)義突變。豬CREBRF 基因的CDS區(qū)全長(zhǎng)1 920 bp，共編碼639個(gè)氨基酸，不穩(wěn)定系數(shù)較高，為親水性蛋白，有85個(gè)高置信度的磷酸化位點(diǎn)和4個(gè)糖基化位點(diǎn)，且CREBRF 的mRNA具有20個(gè)高可信度的m6A甲基化修飾位點(diǎn)，豬、人和小鼠中的CREBRF蛋白保守性較強(qiáng)。RT-qPCR結(jié)果顯示，豬卵巢中CREBRF 基因的表達(dá)量在豬出生0 和28 d 時(shí)表達(dá)水平較高，隨著豬生長(zhǎng)發(fā)育，在出生180 d 時(shí)表達(dá)量顯著降低，在母豬妊娠38 和80 d 時(shí)CREBRF 的表達(dá)再次升高。通過(guò)比對(duì)不同品種豬中CREBRF 基因CDS區(qū)的堿基突變并分析該基因的理化性質(zhì)及表達(dá)規(guī)律，發(fā)現(xiàn)了CREBRF 基因在豬胎兒期、出生早期和妊娠期卵巢組織中的高表達(dá)，推測(cè)CREBRF 在母豬生殖過(guò)程中起重要作用，為豬高繁殖力基因挖掘和分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)提供參考。

關(guān)鍵詞：豬；卵巢；CREBRF；生物信息學(xué)分析；基因表達(dá)

doi：10.13304/j.nykjdb.2024.0154

中圖分類(lèi)號(hào)：S828 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1008‐0864（2024）09‐0044‐10

雌性動(dòng)物的繁殖性狀直接影響著畜牧業(yè)的生產(chǎn)效率和經(jīng)濟(jì)效益，近年來(lái)對(duì)雌性動(dòng)物繁殖性狀的研究主要集中于生殖生理調(diào)控、營(yíng)養(yǎng)管理與疾病控制、遺傳改良與選擇育種及生殖技術(shù)應(yīng)用等方面，以提高種畜的繁殖能力和生產(chǎn)效率。豬是重要的畜牧動(dòng)物之一，在農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)中扮演著重要角色，豬的繁殖性能直接影響了養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展和效益。對(duì)豬繁殖性狀候選基因的研究有助于揭示其對(duì)豬繁殖性能的影響，為改良豬的繁殖性狀提供理論依據(jù)和技術(shù)支持，對(duì)提高豬的生產(chǎn)效率、加快豬的遺傳改良進(jìn)程具有重要意義[1]。

CREBRF （CREB3 regulatory factor， CREBRF）是Luman/CREB3 蛋白（cAMP responsive elementbinding protein 3，CREB3）的調(diào)節(jié)因子，又稱(chēng)Luman/CREB3 募集因子[2]。Luman/CREB3 是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）過(guò)程中，CREB3參與調(diào)節(jié)膜內(nèi)蛋白水解和核小體轉(zhuǎn)位，激活下游基因，CREBRF蛋白與CREB3在核內(nèi)相互作用并結(jié)合以促進(jìn)CREB3的降解[2]。CREBRF 基因在雌性動(dòng)物的繁殖中發(fā)揮著非常重要的作用。張麗萌等[3]研究表明，CREBRF 基因在綿羊各組織中均表達(dá)，其中腎臟、心臟和卵巢中的表達(dá)水平較高。CREBRF 的敲低會(huì)顯著抑制雌性動(dòng)物子宮內(nèi)膜的功能[4]，此外，CREBRF 在ERS誘導(dǎo)的小鼠顆粒細(xì)胞凋亡中也具有重要作用[5]，其可通過(guò)調(diào)節(jié)小鼠子宮基質(zhì)細(xì)胞的增殖來(lái)調(diào)節(jié)妊娠期間的蛻膜化[6]。楊延周等[7]研究了CREBRF 在雌性小鼠發(fā)情周期中的表達(dá)變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)CREBRF 與卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育、成熟及排卵等過(guò)程息息相關(guān)，同時(shí)CREBRF 可能參與胚胎發(fā)育及附植并介導(dǎo)ERS通路參與調(diào)節(jié)卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡，并受到雌激素、孕激素的調(diào)節(jié)。在基因敲除小鼠中發(fā)現(xiàn)CREBRF缺失的小鼠糖皮質(zhì)激素信號(hào)傳導(dǎo)受到影響，母系行為有嚴(yán)重缺陷，不愿照顧幼崽[8]。

上述研究表明，CREBRF 基因在雌性動(dòng)物生殖生理調(diào)控及卵巢發(fā)育過(guò)程中有著不可或缺的作用。目前關(guān)于該基因的研究主要集中于人和小鼠，但對(duì)豬的研究較少。本課題組前期研究中發(fā)現(xiàn)，豬CREBRF 基因在不同組織中均有表達(dá)，且在卵巢、子宮以及輸卵管等組織中表達(dá)水平較高。因此，本研究克隆了不同品種豬CREBRF 基因的CDS區(qū)并進(jìn)行序列比對(duì)，對(duì)該蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并進(jìn)一步探討了CREBRF 在不同階段豬卵巢中的表達(dá)規(guī)律，為后續(xù)進(jìn)一步探索CREBRF基因?qū)ωi繁殖性能的調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)組織樣品為不同品種180日齡母豬的卵巢組織，采自山東日照豬場(chǎng)，包括巴馬豬、梅山豬、松遼豬、大白豬和長(zhǎng)白豬。CREBRF 基因在豬不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量檢測(cè)選用巴馬豬的卵巢組織，包括胚胎期80 d 的雌性胎豬、出生后0、28、180 d和妊娠38和80 d母豬的卵巢組織。

1.2 主要儀器與試劑

無(wú)酶無(wú)菌水（R1600-10），北京索萊寶科技有限公司；2×Phanta Max Master Mix 高保真酶（P515）、RNA Isolater Total RNA Extraction Reagent傳統(tǒng)總RNA提取試劑（R401-01）、HiScript Ⅲ Allin-one RT SuperMix Perfect for qPCR（R333）、ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（Q711），南京諾唯贊生物科技股份有限公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（DR0101050），浙江易思得生物科技有限公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成。

組織勻漿儀（PreceIIys 24），Bertin Technologies（法國(guó)）；研磨珠（120030C），Welab；離心機(jī)（Micro17R），Thermo Scientific；PCR 儀（C1000Touch?）、電泳儀（PowerPac HV）、凝膠成像系統(tǒng)（Universal HoodⅡ），上海伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司；分光光度計(jì)（Nano-100），杭州奧盛儀器有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（QuantStudio 3），Applied Biosystems。

1.3 組織RNA 提取及反轉(zhuǎn)錄

使用傳統(tǒng)Trizol法提取豬卵巢組織的RNA[9]，使用分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的純度與含量，檢測(cè)合格后按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作方法取1 μg RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，存放于-20 ℃冰箱備用，剩余RNA存放于-80 ℃冰箱備用。

1.4 引物設(shè)計(jì)與合成

在NCBI 網(wǎng)站上獲得家豬CREBRF 基因的CDS 區(qū)序列（登錄號(hào)：XM_013990647.2），使用SnapGene 軟件和NCBI-Blast設(shè)計(jì)特異性引物（表1），由上海生工生物工程有限公司合成。

1.5 豬CREBRF 基因克隆與測(cè)序

使用豬卵巢組織的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR 反應(yīng)體系40 μL：2 × Phanta Max MasterMix 20 μL，上、下游引物各 1 μL，無(wú)菌水16 μL，cDNA 2 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性15 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35次循環(huán)；72 ℃修復(fù)延伸5 min。使用膠回收試劑盒回收產(chǎn)物并交由上海生工生物工程有限公司進(jìn)行一代測(cè)序。

1.6 生物信息學(xué)分析

在NCBI 上下載豬CREBR 蛋白的氨基酸序列，通過(guò)在線(xiàn)工具Expasy-ProtParam（https：//web.expasy. org/protparam/）分析其理化性質(zhì)；使用Expasy-ProtScale（https：//web.expasy.org/protscale/）在線(xiàn)工具分析親/疏水性；使用WOLF PSORT（https：//wolfpsort.hgc.jp/）進(jìn)行亞細(xì)胞定位；使用NetNGlyc（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/NetNGlyc-1.0/）進(jìn)行糖基化位點(diǎn)分析；NetPhos3.1（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/NetPhos-3.1/）進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)分析；使用SRAMP（https：//www.cuilab.cn/sramp）進(jìn)行m6A 甲基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)；在NCBI上下載豬（登錄號(hào)：XP_005657688.1）、人（登錄號(hào)：NP_705835.2）、小鼠（登錄號(hào)：NP_084146.1）的氨基酸序列，用ClustalW進(jìn)行多序列比對(duì)，用ESPript 3.0對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化分析。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)使用SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）在線(xiàn)工具進(jìn)行分析預(yù)測(cè)。

1.7 基因相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)和分析

以不同發(fā)育時(shí)期豬卵巢組織的cDNA 為模板，通過(guò)RT-qPCR測(cè)定豬CREBRF 基因的相對(duì)表達(dá)量，使用β-ACTIN 作為內(nèi)參，每組設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。RT-qPCR 反應(yīng)體系15 μL：2 × ChamQUniversal SYBR qPCR Master Mix 7.5 μL，CREBRF-F/R各0.3 μL，無(wú)菌水16 μL，cDNA 1 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火34 s，40 次循環(huán)；95 ℃ 15 s ，60 ℃延伸1 min，95 ℃退火1 s。結(jié)果采用2-△△CT法[10]計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)結(jié)果使用GraphPad prism進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，用One-Way ANOVA 方差分析進(jìn)行顯著性分析，數(shù)據(jù)結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，Plt;0.05表示差異顯著，Pgt;0.05表示差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬CREBRF 基因的擴(kuò)增及測(cè)序

選取巴馬豬、梅山豬、松遼豬、大白豬和長(zhǎng)白豬的卵巢組織cDNA為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到豬CREBRF 基因的CDS 區(qū)。對(duì)PCR 純化產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，比對(duì)后發(fā)現(xiàn)（圖1），巴馬豬CREBRF 的CDS區(qū)與參考基因組（杜洛克豬）相比存在1個(gè)突變位點(diǎn)，為錯(cuò)義突變；梅山豬的CDS區(qū)存在8個(gè)突變位點(diǎn)，其中有4個(gè)同義突變，4個(gè)錯(cuò)義突變；松遼豬的CDS區(qū)存在1個(gè)堿基缺失和4個(gè)堿基突變，其中有2 個(gè)同義突變，3 個(gè)錯(cuò)義突變；大白豬的CDS區(qū)存在2個(gè)突變位點(diǎn)，均為錯(cuò)義突變；長(zhǎng)白豬的CDS區(qū)存在1個(gè)堿基缺失，3個(gè)堿基突變，其中有1個(gè)同義突變，3個(gè)錯(cuò)義突變，這些突變表明不同品種豬之間CREBRF 基因編碼區(qū)序列存在堿基突變，不同品種間存在的基因序列差異可能是導(dǎo)致該基因在品種間基因表達(dá)和功能差異的原因。

2.2 CREBRF 蛋白理化性質(zhì)分析

利用ProtParam 在線(xiàn)軟件預(yù)測(cè)豬CREBRF 蛋白理化性質(zhì)，CREBRF蛋白含有639個(gè)氨基酸，在氨基酸組分中谷氨酸（Glu）含量最多（10.5%），色氨酸（Trp）含量最低（0.9%）（表2）。CREBRF的蛋白分子式為C3 128H4 918N856O1 056S21，原子總數(shù)9 979，相對(duì)分子質(zhì)量72 085.82 Da，理論等電點(diǎn)（pI）4.77。CREBRF 蛋白帶正電荷殘基總數(shù)量（賴(lài)氨酸和精氨酸）為76個(gè)，負(fù)電荷氨基酸殘基的數(shù)量（天冬氨酸和谷氨酸）為115 個(gè)。體外半衰期為30 h，不穩(wěn)定系數(shù)為53.574（lt;40為穩(wěn)定，≥40為不穩(wěn)定），因此CRERBF蛋白為不穩(wěn)定蛋白，容易發(fā)生結(jié)構(gòu)變化或失去功能，易降解。

2.3 CREBRF 蛋白親/疏水性預(yù)測(cè)

使用Protscale工具分析CREBRF蛋白的親疏水性，分值（score）大于0表示氨基酸在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中更偏向疏水性，這些氨基酸往往會(huì)在蛋白質(zhì)的內(nèi)部區(qū)域聚集，形成蛋白質(zhì)的核心結(jié)構(gòu)，也稱(chēng)為疏水核心，如苯丙氨酸、亮氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸等。分值小于0則表示氨基酸在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中更偏向親水性，如谷氨酸、天冬氨酸、賴(lài)氨酸、精氨酸、組氨酸等。這些氨基酸主要位于蛋白質(zhì)的表面區(qū)域，與周?chē)乃肿酉嗷プ饔?，通過(guò)這些親水性氨基酸，蛋白質(zhì)能夠與其他分子進(jìn)行相互作用。由圖2可知，CREBRF 蛋白氨基酸殘基大多數(shù)在親水區(qū)，其中親水性最大值為359、328、386和387位的谷氨酰胺，分值為-3.500，疏水性最大值為566位的氨基酸，分值為1.756，表明CREBRF為親水性蛋白。

2.4 CREBRF 蛋白磷酸化位點(diǎn)、糖基化位點(diǎn)和m6A 甲基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)

磷酸化、糖基化和甲基化是3種常見(jiàn)的生物分子修飾形式，它們對(duì)生物分子的功能和相互作用產(chǎn)生重要影響。磷酸化可以改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和活性，調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和代謝途徑；糖基化可以影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和功能，參與細(xì)胞黏附和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；甲基化在基因表達(dá)調(diào)控中起著重要作用，影響DNA的可讀性和轉(zhuǎn)錄過(guò)程。

使用在線(xiàn)工具NetPhos3.1預(yù)測(cè)CREBRF蛋白潛在的磷酸化位點(diǎn)，磷酸化潛能大于0.5表明該位點(diǎn)是潛在的磷酸化位點(diǎn)。結(jié)果顯示，CREBRF蛋白存在85 個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)，其中絲氨酸（serine）磷酸化位點(diǎn)有49個(gè)，蘇氨酸（threonine）磷酸化位點(diǎn)有23個(gè)，酪氨酸（tyrosine）磷酸化位點(diǎn)有13個(gè)（圖3），提示CREBRF可能具有復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制和功能，而該蛋白可以在不同的時(shí)間點(diǎn)、不同的細(xì)胞環(huán)境下被磷酸化，以實(shí)現(xiàn)其復(fù)雜的功能調(diào)控。

使用在線(xiàn)工具NetNGlyc預(yù)測(cè)CREBRF蛋白的糖基化位點(diǎn)，糖基化潛能大于0.5為陽(yáng)性，縱坐標(biāo)的數(shù)值越高，代表該氨基酸位置越可能是個(gè)糖基化位點(diǎn)。結(jié)果顯示，CREBRF共存在4個(gè)糖基化位點(diǎn)，分別為第35位的NSSD（N-糖基化勢(shì)能0.699 9）、第336位的NYSL（N-糖基化勢(shì)能0.730 1）、第411位的NDSV（N-糖基化勢(shì)能0.694 8）和第624 的NPTG（N-糖基化勢(shì)能0.551 2）（圖4），這些高置信度的糖基化位點(diǎn)可能參與調(diào)控蛋白質(zhì)的活性或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，可能對(duì)蛋白質(zhì)的功能具有關(guān)鍵影響。

通過(guò)SRAMP 網(wǎng)站對(duì)CREBRF 基因的CDS區(qū)的N6-甲基腺苷（m6A）修飾位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)。結(jié)果顯示，CREBRF 基因CDS區(qū)存在8個(gè)極高置信度的位點(diǎn)（very high confidence），12 個(gè)高置信度的位點(diǎn)（high confidence）（圖5），因此認(rèn)為其CDS區(qū)存在m6A修飾。

2.5 豬、人和小鼠CREBRF 氨基酸序列比對(duì)

小鼠是最常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物之一，其基因組與人類(lèi)有很高的相似性，繁殖周期較短且維護(hù)成本相對(duì)低廉，因此常被用于研究遺傳學(xué)、免疫學(xué)、藥理學(xué)、腫瘤學(xué)等領(lǐng)域[11]。而豬作為大型哺乳動(dòng)物，其生理結(jié)構(gòu)和代謝特征更接近人類(lèi)，被廣泛用于心血管病學(xué)、外科手術(shù)模型以及藥物安全性評(píng)價(jià)等研究領(lǐng)域[12]。將豬、人和小鼠CREBRF的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)。由圖6 可見(jiàn)，豬、人和小鼠CREBRF的氨基酸序列保守性較強(qiáng)，豬和人的序列相似性為98.59%，小鼠和人的序列相似性為93.74%。同時(shí)，通過(guò)將差異氨基酸與CREBRF蛋白的化學(xué)修飾位點(diǎn)比對(duì)發(fā)現(xiàn)，在第73、第179、第248、第317 和第636 位氨基酸處，CREBRF 蛋白的磷酸化位點(diǎn)在豬和人中保持一致，在小鼠中發(fā)生變異，這些磷酸化位點(diǎn)的差異可能影響CREBRF 蛋白的磷酸化修飾及其調(diào)控的基因表達(dá)模式。

2.6 豬、人和小鼠CREBRF 二級(jí)結(jié)構(gòu)比對(duì)

基于氨基酸序列的比對(duì)結(jié)果，對(duì)豬、人和小鼠CREBRF蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，根據(jù)預(yù)測(cè)結(jié)果（圖7），在豬、人和小鼠這3種物種CREBRF蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)分布略有不同。

豬和人CREBRF 蛋白中的α-螺旋結(jié)構(gòu)均有54個(gè)，β-折疊結(jié)構(gòu)均有21個(gè)，但小鼠CREBRF蛋白中α-螺旋結(jié)構(gòu)有58 個(gè)，β-折疊結(jié)構(gòu)有17 個(gè)，同時(shí)，在豬和人的CREBRF 蛋白中，無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)個(gè)數(shù)接近，分別為78和79個(gè)，而在小鼠中無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)個(gè)數(shù)為82 個(gè)（表3）。綜上所述，CREBRF 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)顯示豬和人CREBRF蛋白結(jié)構(gòu)更加相近，提示豬可以更好地作為人的研究模型。

2.7 CREBRF 在不同階段豬卵巢組織的表達(dá)水平差異

通過(guò)RT-qPCR對(duì)胚胎期80 d的胎豬，出生后0、28 和180 d 及妊娠38 d 及妊娠80 d 母豬卵巢組織中CREBRF 基因的表達(dá)量進(jìn)行分析，結(jié)果（圖8）表明，CREBRF 基因的表達(dá)量在仔豬出生第0天時(shí)最高，隨著豬生長(zhǎng)發(fā)育，在出生180 d時(shí)表達(dá)量最低，在妊娠母豬和胎豬的卵巢中表達(dá)量顯著上升。CREBRF 基因在豬胎兒期、出生早期和妊娠期卵巢組織中的高表達(dá)提示其在豬的生殖系統(tǒng)發(fā)育和妊娠過(guò)程中非常重要。

3 討論

CREBRF最早是由加拿大圭爾夫大學(xué)發(fā)現(xiàn)的一種具有未折疊蛋白質(zhì)反應(yīng)的堿基區(qū)亮氨酸拉鏈蛋白[2]，其通過(guò)與細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子CREB3/Luman相互作用促進(jìn)CREB3蛋白降解[2]，抑制蛋白反應(yīng)元件的激活。目前CREBRF 已被鑒定為多種核受體的新型轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子[13‐14]，CREBRF 通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)絡(luò)應(yīng)激途徑參與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[5]，還可通過(guò)CREB3/ATG5途徑阻斷缺氧誘導(dǎo)的自噬[14]。

中外豬種在表型和基因型上均存在巨大差異[15]，與歐洲豬相比，亞洲品種表現(xiàn)出更高的繁殖能力、更多的脂肪積累和更慢的生長(zhǎng)速度[16]。豬的繁殖效率受卵母細(xì)胞成熟[17]、卵巢激素[18‐19]、卵巢顆粒細(xì)胞凋亡[20]等諸多因素影響，本團(tuán)隊(duì)前期研究中發(fā)現(xiàn)并鑒定了梅山豬和大白豬的CREB3基因單核苷酸多態(tài)性[21]，并在后續(xù)研究中發(fā)現(xiàn)了妊娠中期母豬卵巢黃體中的差異表達(dá)基因[22]，本研究進(jìn)一步分析了CREBRF 基因的特征及其表達(dá)規(guī)律?？寺〉玫饺L(zhǎng)為1 920 bp的豬CREBRF 基因片段，基于CREBRF 基因所編碼蛋白展開(kāi)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，該基因共編碼639個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量為72 085.82 Da，蛋白分子式為C3128H4918N856O1056S21，親水性較高，為極不穩(wěn)定蛋白。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示CREBRF蛋白主要定位于細(xì)胞核，但是在Yang等[5]對(duì)小鼠卵泡閉鎖期間的卵巢顆粒細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)CREBRF 蛋白定位于凋亡顆粒細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，提示CREBRF 蛋白可能具有多種亞細(xì)胞位置，其定位可能受到細(xì)胞環(huán)境、信號(hào)通路激活等因素的影響。因此，在不同的條件下，CREBRF蛋白可能呈現(xiàn)不同的亞細(xì)胞定位。

豬的CREBRF 蛋白被預(yù)測(cè)到有85個(gè)磷酸化位點(diǎn)，與張麗萌等[3]對(duì)綿羊CREBRF 蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)到的87個(gè)磷酸化位點(diǎn)相近，進(jìn)一步證實(shí)CREBRF 基因的氨基酸序列的高保守性，有學(xué)者提出CREB 會(huì)應(yīng)答各種信號(hào)等磷酸化反應(yīng)[23]，而作為CREB3的募集因子，CREBRF蛋白高置信度的磷酸化位點(diǎn)提示其在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、代謝調(diào)節(jié)、基因轉(zhuǎn)錄等方面也可能受到磷酸化修飾的影響。CREBRF 蛋白預(yù)測(cè)的糖基化位點(diǎn)只有4個(gè)，提示該蛋白在糖基化修飾方面的影響相對(duì)較少。本研究通過(guò)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，CREBRF 基因CDS 區(qū)共存在20個(gè)高置信度的m6A甲基化位點(diǎn)，說(shuō)明CREBRF基因在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控過(guò)程中可能受到m6A修飾的影響，提示該基因在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中扮演重要角色。通過(guò)對(duì)豬、人和小鼠CREBRF蛋白進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，其保守性較強(qiáng)，可能在生理過(guò)程有著相似的功能。

作為CREBRF 的互作蛋白[24]，CREB3在果蠅胚胎發(fā)生終止時(shí)具有特定的作用[25]，并且在雌性哺乳動(dòng)物的生殖過(guò)程中也發(fā)揮重要作用，CREB3在雌性小鼠的子宮、卵巢以及輸卵管中均有表達(dá)[26]，而且CREB3 的表達(dá)量也隨發(fā)情周期的變化呈現(xiàn)規(guī)律性地表達(dá)[27]。鑒于CREBRF 調(diào)節(jié)CREB3的活性，而CREBRF 敲除的小鼠母性行為嚴(yán)重喪失[8]，Penney等[28]為了闡明CREB3 的生物學(xué)功能，構(gòu)建了CREB3 敲除的基因編輯小鼠，發(fā)現(xiàn)CREB3缺失的小鼠產(chǎn)仔數(shù)顯著下降，且與野生型相比母性較差。CREB3 與雌性動(dòng)物的生殖相關(guān)，進(jìn)一步表明了其募集因子CREBRF 在雌性動(dòng)物繁殖過(guò)程中的重要調(diào)控作用。

本研究初步分析了CREBRF 在不同階段母豬卵巢中的表達(dá)規(guī)律，結(jié)果顯示，CREBRF 在仔豬出生時(shí)表達(dá)量最高，隨著豬的生長(zhǎng)發(fā)育，表達(dá)量逐漸降低，在母豬妊娠期CREBRF 基因表達(dá)水平再次升高，CREBRF 在母豬卵巢中的動(dòng)態(tài)表達(dá)提示其可能在母豬生長(zhǎng)發(fā)育和懷孕過(guò)程中發(fā)揮重要功能。然而，關(guān)于CREBRF 基因具體的作用機(jī)制仍需要進(jìn)一步深入研究和探討。

通過(guò)對(duì)CREBRF 的基因和表達(dá)特征研究發(fā)現(xiàn)，豬的CREBRF 基因的蛋白翻譯后修飾位點(diǎn)非常豐富，表明它可能在調(diào)控細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、基因表達(dá)調(diào)控以及細(xì)胞內(nèi)外相互作用中起著重要作用，且CREBRF 在豬生長(zhǎng)生殖過(guò)程中的卵巢組織中呈現(xiàn)的“ 先高后低再高”的動(dòng)態(tài)表達(dá)模式，提示CREBRF 基因在胎兒發(fā)育和生長(zhǎng)過(guò)程中扮演著重要的角色，且在母豬妊娠過(guò)程中具有重要的調(diào)控作用。本研究能夠?yàn)槟肛i高繁殖力基因挖掘和分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)提供參考。

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