摘要：為提高以前體形式合成的蛋白質(zhì)折疊與成熟效率，以枯草桿菌蛋白酶SprD為研究對象，通過蛋白重組表達、氨基酸定點突變、包涵體純化結(jié)合體外復(fù)性、酶催化性能測定等方法比較各前體蛋白折疊成熟情況。結(jié)果表明，野生型前導(dǎo)肽介導(dǎo)的SprD前體蛋白可以在230 min內(nèi)完成成熟，時間較長；成熟肽序列中E112A、S221A及S221C等突變導(dǎo)致相應(yīng)前體蛋白成熟時間延長或成熟失?。欢皩?dǎo)肽串聯(lián)表達和切割位點酪氨酸缺失等措施可以將蛋白成熟時間縮短至80～160 min，成熟效率提高0.5～2.0倍，且成熟酶催化能力不受影響。前導(dǎo)肽序列中單個氨基酸位點改變對蛋白成熟影響較小，但對酶催化能力提升有一定幫助。因此，前導(dǎo)肽介導(dǎo)的蛋白成熟與酶催化能力的改變是2個相對獨立的過程，前導(dǎo)肽表達方式與切割位點變化是促進蛋白體外成熟的較優(yōu)方案。研究結(jié)果為加速蛋白成熟與蛋白改造提供了可參考方法。

關(guān)鍵詞：前導(dǎo)肽；SprD蛋白；蛋白復(fù)性；折疊；成熟

doi：10.13304/j.nykjdb.2023.0176

中圖分類號：Q816 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：1008‐0864（2024）09‐0054‐08

枯草桿菌蛋白酶是由芽孢桿菌類產(chǎn)生的一類絲氨酸蛋白酶，可以水解蛋白質(zhì)為肽段或氨基酸，被廣泛用于洗滌劑、羽毛降解和食品加工等行業(yè)[1]。這類蛋白以前體蛋白形式合成，并在自身前導(dǎo)肽作用下折疊為具有催化活性的成熟酶[2-4]。已報道的α-水解蛋白酶、脂肪酶、角蛋白酶等也具有同樣的特征[5-7]。成熟肽多由1個含275個氨基酸殘基組成的多肽鏈構(gòu)成，歷經(jīng)折疊、自加工和前導(dǎo)肽釋放與降解等階段才得以成熟，保守D、H和S氨基酸構(gòu)成其催化中心三聯(lián)體[2-4]。在前2個階段，前導(dǎo)肽介導(dǎo)前體蛋白折疊和加工，并與自身形成穩(wěn)定的抑制復(fù)合物[8‐9]。前導(dǎo)肽從復(fù)合物中釋放與降解才最終預(yù)示著成熟酶的激活，這也是蛋白成熟速率的決定步驟[8-10]。然而，體外研究顯示，蛋白成熟需約240 min，時間較長[8‐9]。為提高蛋白成熟效率，在單位時間獲取更多有活性功能的酶，本研究以枯草桿菌蛋白酶SprD為研究對象探索相關(guān)方法與途徑。

SprD蛋白（登錄號No. KC153302）是芽孢桿菌屬中發(fā)現(xiàn)的與枯草桿菌蛋白酶E 蛋白（No.CAA74536）具有相似氨基酸構(gòu)成與底物水解功能的成員，并在前導(dǎo)肽作用下完成體內(nèi)折疊與成熟[11]。但是，該蛋白折疊過程與成熟機制尚不清晰。研究發(fā)現(xiàn)，前導(dǎo)肽不僅促進蛋白體內(nèi)成熟，還將其氨基酸信息印記至成熟肽，進而使具有一致氨基酸序列的成熟肽具備不同催化能力，也即“蛋白記憶”模式[10]?；诖?，改變前導(dǎo)肽序列提升酶催化能力的策略被廣泛采納。然而是否還有更優(yōu)的提升蛋白成熟方案需進一步驗證。大腸桿菌具有清楚的遺傳背景與表達體系，是研究蛋白重組表達的模式生物。本研究利用前體蛋白重組表達結(jié)合體外復(fù)性研究蛋白折疊成熟不僅排除了原宿主干擾，還為蛋白成熟效率及催化性能的提高提供可能。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

E.coli DH5α 菌株、E.coli BL21（DE3）、產(chǎn)SprD蛋白酶的Bacillus sp. L010 由本試驗室保存。pMD19-T為亞克隆載體，pET28a為表達載體。LB培養(yǎng)基由蛋白胨1%、酵母膏0.5%與氯化鈉1%組成，根據(jù)需要添加氨芐青霉素或卡那霉素，終質(zhì)量濃度分別為100、50 μg·mL-1。引物合成與測序由華大基因完成。化學(xué)合成底物succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide （AAPF）購自Sigma（美國）。pMD19-T、Ex Taq polymerase、限制性內(nèi)切酶等分子試劑購于TaKaRa（日本）。

1.2 試驗方法

1.2.1 載體構(gòu)建

以Bacillus sp. L010 基因組為模板擴增前體蛋白對應(yīng)的基因片段pro-sprD，并將其亞克隆至pMD19-T，經(jīng)序列測定驗證后重組至表達載體pET28a（酶切位點為Nco I與Xho I）。采用重疊PCR進行定點突變構(gòu)建含突變體前體蛋白的載體，具體方法參照文獻[12]。引物見表1。

1.2.2 蛋白誘導(dǎo)與重組表達

重組載體轉(zhuǎn)化BL21（DE3），37 ℃培養(yǎng)至OD600=0.6，加入誘導(dǎo)劑異丙基硫代- β -D- 半乳糖苷（Isopropyl-beta-Dthiogalactopyranoside，IPTG）至終含量0.3 mmol·L-1，37 ℃誘導(dǎo)4～6 h，離心收集樣品，用含50 mmol·L-1Tris-HCl、150 mmol·L-1 NaCl、pH 7.0 的裂解緩沖液洗滌2次后于-80 ℃保存，以備蛋白表達檢測或前體蛋白純化。聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）檢測蛋白表達，具體操作參照李丹等[11]的方法。以上獲得的前體蛋白為包涵體（即未折疊狀態(tài)、非活性狀態(tài)），將用于體外折疊與成熟研究。

1.2.3 前體蛋白純化

取出-80 ℃保存的樣品冰浴融化，裂解緩沖液重懸，超聲波（功率35%、超聲3 s、間隔3 s、時間30 min，冰?。┝呀猓? ℃ 、16 000 r·min-1離心40 min；棄上清、留沉淀；低水平尿素緩沖液（含50 mmol·L-1 NaH2PO4·2H2O， 3～4 mol·L-1 尿素，pH 7.0）洗滌；4 ℃ 、16 000 r·min-1離心40 min，棄上清，留沉淀；反復(fù)洗滌至上清液中無雜蛋白；最后將沉淀溶解于高水平尿素緩沖液（8 mol·L-1 尿素）中，采用BCA 檢測試劑盒測定蛋白含量，完成蛋白純化。

1.2.4 前體蛋白體外折疊

質(zhì)量濃度約為3.8 mg·mL-1的前體蛋白加入復(fù)性體系折疊（稀釋體積比為1∶30），采用磁力攪拌器在4 ℃條件下攪拌，在不同時間取樣，利用酶活性與SDS-PAGE檢測蛋白折疊與成熟情況，成熟時間為每樣品2次SDS-PAGE檢測到的時間區(qū)間值。

SDS-PAGE檢測用樣品處理：向500 μL樣品中加入55 μL 100%三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）終止蛋白折疊，冰上放置30 min；4 ℃、12 000 r·min-1 離心15 min，留沉淀；加入500 μL丙酮洗滌；4 ℃下12 000 r·min-1離心15 min，留沉淀；反復(fù)洗滌2～3次，晾干，進行SDS-PAGE檢測。

1.2.5 成熟酶催化性能測定

成熟酶催化性能參照文獻[13]進行測定，以化學(xué)合成肽succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide （AAPF）為底物。釋放p-nitroaniline的量通過OD410 nm 值變化確定。酶活單位定義是單位時間（1 min） 內(nèi)釋放1 μmolp-nitroaniline所需要酶量。酶與底物（50 mmol·L-1Tris-HCl， 1 mmol·L-1 CaCl2， 50 μg AAPF， pH 8.0）反應(yīng)一定時間，檸檬酸溶液（2 mol·L-1，pH 5.0）終止反應(yīng)后，測定吸光值。在體系中添加不同含量的底物與酶反應(yīng)，連續(xù)監(jiān)測光吸收值，以計算酶活參數(shù)米氏常數(shù)（Km）和催化常數(shù)（kcat）。催化性能測定時每樣品3個重復(fù)，數(shù)值為均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

1.2.6 前體蛋白抑制酶活性測定

參照文獻[14]，將成熟酶迅速加入含有前體蛋白與底物AAPF的復(fù)性體系中（摩爾比為1∶5），以秒為單位實時監(jiān)測410 nm光吸收情況，評估前體蛋白對酶的作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 前導(dǎo)肽序列比較分析

經(jīng)DNAMAN 軟件比較，發(fā)現(xiàn)SprD 前導(dǎo)肽與其他序列具有較高相似性（圖1），2段比較保守的序列N1和N2基序構(gòu)成了前導(dǎo)肽疏水核心序列，在前導(dǎo)肽成核反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[15]；N1～N2基序間非保守氨基酸殘基可能通過形成α螺旋和β折疊在蛋白成熟途徑中承擔(dān)功能[16]。將前導(dǎo)肽與成熟肽連接處氨基酸標(biāo)識為“-1”，“-1”位氨基酸在不同基因序列中具有較大變化。SprD蛋白中，-1位氨基酸為Y，其他序列為M或L，推測“-1”位氨基酸組成對蛋白成熟切割作用影響可能不大；-2位氨基酸為A，其他序列為E；-44位氨基酸G與-48位氨基酸I分別處于N2保守基序與N1～N2間非保守序列中。圖1中還標(biāo)識了氨基酸突變與缺失（▲）情況，-48 位氨基酸I突變?yōu)閂（I-48V）；-44位氨基酸G突變?yōu)镈（G-44D）；-1位氨基酸Y缺失（Y-1D’）。

2.2 野生型前體蛋白的加工與成熟

緩沖液組分通過表面電荷、水與離子作用等方式影響蛋白折疊[17‐18]。本研究分別探索了Na2HPO4-NaH2PO4、Tris-HCl、MES 為背景的體外復(fù)性體系，結(jié)果顯示，當(dāng)體系為YABUTA 等[19]報道的50 mmol·L-1 MES-NaOH、500 mmol·L-1（NH4）2SO4、2 mmol·L-1 β -mercaptoethanol、1 mmol·L-1 CaCl2、pH 6.5～6.6時，野生型前體蛋白較快折疊為成熟酶（圖2A）。此外，從圖2 還可知，前導(dǎo)肽與成熟肽折疊、自加工發(fā)生在短暫的起始階段；前導(dǎo)肽釋放與降解，即成熟酶SprD出現(xiàn)發(fā)生在230 min左右；前導(dǎo)肽釋放前與成熟肽通過非共價鍵連接。

成熟肽及其催化三聯(lián)體中氨基酸突變會進一步延長蛋白成熟時間（圖2B～D）。當(dāng)發(fā)生E112A突變時，蛋白在300 min時仍以前體形式存在，蛋白成熟及前導(dǎo)肽釋放發(fā)生在500 min后（圖中未顯示至此刻）；S221A突變直接導(dǎo)致前導(dǎo)肽與成熟肽切割失敗；S221C突變則使前導(dǎo)肽水解與釋放失敗，一直未檢測到有催化活性的成熟酶出現(xiàn)。以上結(jié)果表明，成熟肽及其催化中心氨基酸不僅參與前導(dǎo)肽切割與釋放，還延長蛋白成熟時間甚至造成蛋白成熟成敗?；谶@些數(shù)據(jù)與結(jié)果，推測蛋白成熟效率的提高應(yīng)該圍繞蛋白前導(dǎo)肽進行設(shè)計與探索。

2.3 前導(dǎo)肽串聯(lián)表達對蛋白成熟的影響

為進一步強化前導(dǎo)肽作用，本研究將前導(dǎo)肽串聯(lián)表達以提升蛋白成熟效率（圖3A），結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖3B），pro-pro-SprD蛋白折疊成熟所需時間僅為150～160 min，與野生型前體蛋白相比縮短了近1/3時間，說明前導(dǎo)肽串聯(lián)表達可以大幅提高蛋白成熟效率。釋放的前導(dǎo)肽以單個與串聯(lián)2種形式出現(xiàn)，預(yù)示著成熟酶可以準(zhǔn)確識別切割位點A（-2）-X（-1）-A（+1） （+1為成熟肽首位氨基酸），與切割位點距離無直接關(guān)聯(lián)。串聯(lián)形式的前導(dǎo)肽在豐度上更具優(yōu)勢，推測前導(dǎo)肽分子間存在相互作用，通過促進自身二級結(jié)構(gòu)形成提高蛋白成熟效率。這一結(jié)果再次肯定了前導(dǎo)肽在蛋白折疊成熟中的作用，同時也為加速蛋白成熟提供了一種全新的方法。但是較多中間體的出現(xiàn)降低了成熟酶的最終得率，前導(dǎo)肽表達方式的改變可能不是加速蛋白成熟的最優(yōu)措施。

2.4 前導(dǎo)肽氨基酸點突變對成熟酶活性的影響

為進一步探索前導(dǎo)肽氨基酸位點對蛋白成熟的影響，將保守基序N2及其臨近非保守基序且同屬前導(dǎo)肽二級結(jié)構(gòu)氨基酸位點的-44位氨基酸G與-48位氨基酸I分別突變?yōu)镈與V，并重組表達了相應(yīng)前體蛋白。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，處于保守與非保守基序的氨基酸殘基對蛋白成熟促進效果不明顯，前導(dǎo)肽釋放與酶活性顯示時間基本維持在200～220 min（ 圖4，G-44D 前體未顯示，需210～220min）。雖然這些突變對蛋白成熟影響有限，但卻改變了成熟酶的催化能力（表2），I-48V突變提高了酶與底物AAPF的結(jié)合能力（Km），此時酶的催化效率（kcat/Km）是野生型的1.3倍，而G-44D突變卻大幅降低了酶的催化效率。以上結(jié)果不僅再次證實了前導(dǎo)肽信息可以印記至成熟肽的結(jié)論[10]，還預(yù)示著酶活性的發(fā)揮與酶折疊成熟不存在明顯的相關(guān)性。與I-48V相比，-44位處于保守基序，且G-44D 突變將原來疏水性甘氨酸變?yōu)榱怂嵝园被?，這或許是催化效率降低的主要原因。

2.5 Y（-1）缺失顯著促進蛋白成熟

以上研究表明，前導(dǎo)肽保守與非保守基序中氨基酸殘基對蛋白成熟貢獻有限。研究發(fā)現(xiàn)，連接處氨基酸殘基折疊后處于成熟肽構(gòu)象結(jié)合口袋內(nèi)，其側(cè)鏈基團從空間位阻上可能影響前導(dǎo)肽釋放[5，20]。分析SprD前導(dǎo)肽發(fā)現(xiàn)，臨近連接處氨基酸序列是Q （-3）-A （-2）-Y （-1），即前導(dǎo)肽與成熟肽連接氨基酸為Y，上游氨基酸是A。因此，推測較大的Y側(cè)鏈基團或不利于蛋白成熟。觀察將Y缺失（用Y-1D’表示）的前體蛋白成熟過程發(fā)現(xiàn)，Y缺失使蛋白成熟時間縮短至80 min左右（圖5），比野生型前體蛋白縮短了近160 min，蛋白成熟效率提高了近2倍，表明前導(dǎo)肽與成熟肽連接處氨基酸對蛋白成熟效率的提升具有不可替代的作用。

雖然前導(dǎo)肽表達方式改變可以提高蛋白成熟效率，但是連接處氨基酸的轉(zhuǎn)變卻更能體現(xiàn)強大優(yōu)勢。這對于SprD蛋白可能存在一定偶然性，Y缺失使上游具有較小側(cè)鏈基團的A（-2） 成為連接氨基酸，恰為前導(dǎo)肽釋放提供了便利。此外，Y-1D’突變基本不影響成熟酶與底物的結(jié)合與催化效率（表2）。結(jié)合保守與非保守基序中氨基酸位點突變數(shù)據(jù)可知，酶成熟與酶活性發(fā)生是2個相對獨立的過程。

2.6 前體蛋白對成熟酶活性的影響

前導(dǎo)肽釋放是成熟肽激活的重要標(biāo)志[8‐9]。在前體蛋白折疊前期階段，前導(dǎo)肽以非共價鍵形式與成熟肽結(jié)合并抑制成熟肽酶活發(fā)生是對宿主的一種保護。激活后的成熟酶被釋放到胞外呈現(xiàn)功能，而在此之前，前導(dǎo)肽通過抑制酶活發(fā)生可以防止細(xì)胞膜或周質(zhì)空間蛋白降解[11，19]。因此，不同來源前導(dǎo)肽對成熟酶抑制作用有一定差異[21]。檢測前體蛋白對成熟酶的作用可以從側(cè)面說明前導(dǎo)肽對成熟酶的作用。由加入前體蛋白的成熟酶反應(yīng)曲線，計算初始反應(yīng)速率，與加入野生型前體蛋白pro-sprD反應(yīng)速率比較，可以比較各前體蛋白對成熟酶的相對抑制能力。由圖6知，不同前體蛋白對成熟酶活性發(fā)揮均有不同程度抑制作用；G-44D抑制作用最強，約為pro-SprD、I-48V 等前體蛋白的12.5倍；pro-pro-SprD因前導(dǎo)肽串聯(lián)而比pro-SprD抑制作用更強；Y-1D’在前280 s呈現(xiàn)抑制，而后則顯著促進酶活發(fā)生。這些數(shù)據(jù)支持了前導(dǎo)肽對成熟酶具有抑制作用的結(jié)果[8‐9]，更證明了-1位氨基酸Y缺失顯著促進蛋白成熟的這一結(jié)論。

3 討論

以前體蛋白形式合成的蛋白質(zhì)在細(xì)菌中廣泛存在，尤其是枯草桿菌蛋白酶類，因其具有極高應(yīng)用與轉(zhuǎn)化價值而備受重視。但是，這類蛋白即使在前導(dǎo)肽介導(dǎo)下折疊為成熟酶仍需較長時間。本研究中，SprD蛋白釋放前導(dǎo)肽、完全成熟需230～240 min，與已報道枯草桿菌蛋白酶[22-24]基本一致。提高蛋白成熟效率是酶產(chǎn)量提升的必要條件。本研究發(fā)現(xiàn)，成熟肽中氨基酸殘基改變導(dǎo)致蛋白成熟時間延長或成熟失敗，前導(dǎo)肽中保守和非保守區(qū)域單個氨基酸殘基突變對蛋白成熟貢獻有限，僅有前導(dǎo)肽串聯(lián)表達、前導(dǎo)肽與成熟肽連接處氨基酸位點改變才能大幅提升蛋白成熟效率。本研究還發(fā)現(xiàn)，蛋白成熟效率提高與酶催化能力提升呈非正相關(guān)，是2個相對獨立的過程。因此，前導(dǎo)肽表達方式改變及氨基酸位點優(yōu)化是從不同機制對酶成熟與催化效率提升發(fā)揮作用。

研究顯示，優(yōu)化前導(dǎo)肽氨基酸位點是提高成熟酶在原宿主體內(nèi)活性的通用途徑[25‐26]。結(jié)合本研究結(jié)果可知，體內(nèi)研究只能通過評估酶活性表明研究效果，無法從蛋白折疊機制上解釋酶活性提升的主要原因。此外，體內(nèi)研究還存在成熟酶表達量低、純化難度大、宿主生長受影響等問題[27‐28]。本研究利用大腸桿菌系統(tǒng)使前體蛋白以包涵體形式表達，表達量受限較少，結(jié)合體外復(fù)性可以為酶適時應(yīng)用提供一種方法，也為酶產(chǎn)量提升提供一些體外篩選方案。

參 考 文 獻

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基金項目：國家重點研發(fā)計劃項目（2018YFE0127400）；四川省教育廳科研項目（18ZB0366）。