摘" 要： 旨在獲得梅花鹿鹿茸組織全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本和結(jié)構(gòu)信息，并進(jìn)一步挖掘出影響梅花鹿鹿茸產(chǎn)量的功能基因。本研究采取飼養(yǎng)管理?xiàng)l件一致的6頭2鋸齡健康雄性東大梅花鹿，取其相同部位鹿茸組織。根據(jù)茸重將鹿茸分為高、低產(chǎn)兩組，每組3個(gè)重復(fù)。利用PacBio Sequel平臺(tái)以及Illumina平臺(tái)分別對(duì)高、低產(chǎn)鹿茸混合樣品進(jìn)行全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。結(jié)合高、低產(chǎn)兩組二代測(cè)序技術(shù)，使用SUPPA、KOBOS-I、Cytoscape等工具對(duì)可變剪接、功能富集及Hub基因等預(yù)測(cè)分析。高、低產(chǎn)組測(cè)序分別獲得有效插入片段36 074 385 bp和32 413 962 bp；轉(zhuǎn)錄因子注釋顯示高產(chǎn)組中bHLH家族轉(zhuǎn)錄本數(shù)量要高于TF_bZIP家族，低產(chǎn)組中則相反。高產(chǎn)鹿茸組共存在6 644個(gè)可變剪接事件，而低產(chǎn)鹿茸組則為7 626個(gè)可變剪接事件；經(jīng)比對(duì)，COL1A1在多個(gè)融合基因中起主效作用；兩組樣品中共篩選出207個(gè)差異表達(dá)基因，KEGG富集顯示差異表達(dá)基因主要集中在甲狀旁腺激素的合成、分泌以及膽固醇代謝等通路；鑒定到11個(gè)Hub基因，分別是APOB、SH3GL2、SYT1、ANGPTL4、FGF21、CACNA1E、SERPINF2、CACNB4、KLK4、LRP2、KCNA1。本研究結(jié)果為進(jìn)一步的功能基因鑒定工作和分子育種策略的發(fā)展提供了新的理論基礎(chǔ)和研究路徑。

關(guān)鍵詞： 梅花鹿鹿茸；全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序；產(chǎn)茸性狀；功能基因；差異分析

中圖分類號(hào)：S813.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0366-6964（2024）12-5549-18

doi： 10.11843/j.issn.0366-6964.2024.12.020

開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

收稿日期：2024-03-14

基金項(xiàng)目：吉林省農(nóng)業(yè)關(guān)鍵核心技術(shù)示范推廣（產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系）項(xiàng)目（JARS-2024-0801-04）；吉林省畜禽遺傳資源開(kāi)發(fā)利用及科技提質(zhì)增效項(xiàng)目（202404-4）；吉林省自然科學(xué)基金（YDZJ202201ZYTS463）

作者簡(jiǎn)介：閔祥玉（1998-），女，山東濰坊人，碩士生，主要從事動(dòng)物繁育原理與技術(shù)研究，E-mail：mxy10504@163.com

*通信作者：王桂武，主要從事鹿遺傳育種研究，E-mail： wangguiwu2005@163.com；鄭軍軍，主要從事鹿遺傳育種研究，E-mail：zhengjunjun@caas.cn

Full-length Transcriptome Sequencing of Sika Deer Antler and Mining of Antler Yield-related Genes

MIN" Xiangyu， WEI" Jiali， XU" Biao， LIU" Huitao， ZHENG" Junjun*， WANG" Guiwu*

（Institute of Special Animal and Plant Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences， Changchun 130112，" China）

Abstract： The study aimed to obtain the full-length transcript and structure information of the antler tissue of Sika deer， and to further mine the functional genes that affect the antler production of Sika deer. In this study， six two-sained healthy male Dongda Sika deer with the same feeding and management conditions were used to collect antler tissues from the same parts of the deer. According to the antler weight， the antler was divided into 2 groups of high and low production with 3 replicates per group. The whole length transcriptome of antler with high and low production were sequenced using PacBio Sequel platform and Illumina platform， respectively. Combined with the next generation sequencing technology of high and low yield groups， the alternative splicing， functional enrichment and Hub genes were predicted and analyzed by SUPPA， KOBOS-I and Cytoscape tools. The effective insertion fragments of 36 074 385 bp and 32 413 962 bp were obtained in the high and low yield groups， respectively. Transcription factor annotation showed that the number of bHLH family transcripts in the high yield group was higher than that of TF_bZIP family， but the opposite was observed in the low yield group. There were 6 644 alternative splicing events in the high production group and 7 626 alternative splicing events in the low production group. COL1A1 played a major role in multiple fusion genes. A total of 207 differentially expressed genes were screened out from the two groups of samples. KEGG enrichment showed that the differentially expressed genes were mainly concentrated in the synthesis and secretion of parathyroid hormone and cholesterol metabolism pathways. Eleven Hub genes were identified， including APOB， SH3GL2， SYT1， ANGPTL4， FGF21， CACNA1E， SERPINF2， CACNB4， KLK4， LRP2， KCNA1. This study provides a new theoretical basis and research path for further functional gene identification and the development of molecular breeding strategies.

Key words： sika deer antler; full-length transcriptome sequencing; anlter producing characters; functional gene; difference analysis

*Corresponding authors： WANG Guiwu， E-mail： wangguiwu2005@163.com; ZHENG Junjun， E-mail：zhengjunjun@caas.cn

梅花鹿是一種重要的特種畜禽，而鹿茸自古以來(lái)都是梅花鹿最重要的經(jīng)濟(jì)性狀。鹿茸作為一種重要的動(dòng)物藥材，具有抗疲勞、增強(qiáng)免疫力、壯腎陽(yáng)以及改善部分婦科疾病等功效［1-4］。目前市場(chǎng)中，鹿茸仍處于供不應(yīng)求的局面，所以通過(guò)測(cè)序等方法深入挖掘控制鹿茸產(chǎn)量的相關(guān)基因具有重要意義。

為深入挖掘梅花鹿產(chǎn)茸性狀相關(guān)基因，目前已進(jìn)行了部分研究。梅花鹿和馬鹿鹿茸生長(zhǎng)與血液IGF1濃度之間存在正相關(guān)性，GH及IGF1基因是促進(jìn)鹿茸生長(zhǎng)的主要調(diào)控因子［5］；COL1A1基因在快速生長(zhǎng)期以及在間充質(zhì)組織、前軟骨組織、軟骨組織中對(duì)鹿茸生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用［6］；KGF基因在鹿茸生長(zhǎng)及組織修復(fù)中扮演關(guān)鍵角色［7］；RXFP2基因作為雄激素受體的下游靶基因，參與角柄發(fā)生，是鹿茸再生生長(zhǎng)的關(guān)鍵信號(hào)［8］。MTNR1A基因的多態(tài)性和突變位點(diǎn)在梅花鹿的生茸性狀中起著重要作用［9］；YWHAE基因及其編碼的14-3-3ε蛋白在梅花鹿生茸過(guò)程中可能扮演著重要角色［10］。Park等［11］鑒定到了130個(gè)蛋白，其中MAPK1、SMUBP2和ZFP28等可能與鹿茸生長(zhǎng)密切相關(guān)。即使目前已經(jīng)對(duì)梅花鹿鹿茸進(jìn)行了相關(guān)研究，但并未完全闡明鹿茸生長(zhǎng)機(jī)制，鹿茸產(chǎn)量調(diào)控機(jī)制仍需深入探究。

二代基因組測(cè)序、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序等已經(jīng)廣泛應(yīng)用到鹿茸相關(guān)研究中［12-14］，但仍未對(duì)控制鹿茸產(chǎn)量的機(jī)制做出合理的解釋。可變剪接（alternative splicing）已經(jīng)在牛、羊等畜禽中廣泛研究［15-18］，而在鹿科動(dòng)物中鮮見(jiàn)報(bào)道。目前，三代轉(zhuǎn)錄組測(cè)序是檢測(cè)可變剪接事件最準(zhǔn)確、有效的方法［19］，而主流的三代轉(zhuǎn)錄組測(cè)序平臺(tái)包括PacBio Sequel平臺(tái)和Nanopore平臺(tái)。在本研究中，利用PacBio Sequel及Illumina平臺(tái)進(jìn)行混合測(cè)序，對(duì)梅花鹿高產(chǎn)茸以及低產(chǎn)茸的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行對(duì)比，對(duì)兩組可變剪接事件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。以期為深入理解梅花鹿產(chǎn)茸機(jī)制以及相關(guān)功能基因挖掘奠定基礎(chǔ)。

1" 材料與方法

1.1" 材料、試劑與儀器

梅花鹿二杠茸采購(gòu)自長(zhǎng)春市東大鹿業(yè)有限公司。

Trizol試劑、RNA 6000 Nano試劑盒、SMARTerTM PCR cDNA Synthesis試劑盒、TB Green Premix Ex TaqTM Ⅱ試劑盒、PrimeSTAR GXL DNA 聚合酶、SMRTbell Template Prep試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

電泳儀（Eppendorf公司）、熒光定量PCR儀（Thermo fisher scientific公司）、超微量分光光度計(jì)（天根生化有限公司）、凝膠成像儀（Bio-Rad公司）、Agilent 2100生物分析儀（Agilent公司）、Pacbio 測(cè)序平臺(tái)（Pacific Bio sciences 公司）、Illumina 測(cè)序平臺(tái)（Illumina公司）。

1.2" 方法

1.2.1" 樣本采集

試驗(yàn)選取同一鹿圈、飼養(yǎng)管理?xiàng)l件一致、2鋸齡的6頭健康東大梅花鹿，根據(jù)茸重分為高產(chǎn)茸組（H）和低產(chǎn)茸組（L），樣品重量信息見(jiàn)表1。兩組樣品的重量在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著差異（P≤0.01）（圖1）。在鹿茸生長(zhǎng)50天時(shí)，取茸頭同一部位樣品切割后，PBS沖洗，并對(duì)樣品進(jìn)行編號(hào)分裝，－80℃保存待測(cè)。

1.2.2" 總RNA提取

取高產(chǎn)組和低產(chǎn)組樣品分別置于1.5 mL無(wú)RNase離心管中，按照Trizol試劑說(shuō)明書(shū)提取各樣本的總RNA，使用電泳儀、凝膠成像儀和生物分析儀評(píng)估RNA質(zhì)量，合格者保留備用。

1.2.3" 三代全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組PacBio Sequel 測(cè)序

根據(jù)SMARTerTM PCR cDNA Synthesis試劑盒參照說(shuō)明書(shū)對(duì)高產(chǎn)組及低產(chǎn)組RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增富集。隨后根據(jù)SMRTbell Tem-plate Prep試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行修復(fù)擴(kuò)增純化，獲得測(cè)序文庫(kù)。測(cè)序工作主要由北京諾禾致源科技股份有限公司完成。

1.2.4" 二代高通量Illumina 測(cè)序

RNA樣品檢測(cè)合格后，用帶有Oligo（dT）的磁珠富集真核生物mRNA。隨后將mRNA打斷成短片段，以mRNA為模板，用六堿基隨機(jī)引物合成一鏈cDNA，然后合成二鏈cDNA，隨后利用AMPure XP beads純化雙鏈cDNA。純化的雙鏈cDNA先進(jìn)行末端修復(fù)、加A尾并連接測(cè)序接頭，再用AMPure XP beads進(jìn)行片段大小選擇。最后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并用AMPure XP beads純化PCR產(chǎn)物，得到最終的測(cè)序文庫(kù)。測(cè)序工作主要由北京諾禾致源科技股份有限公司完成。

1.2.5" 熒光定量PCR

從Hub基因中隨機(jī)找6個(gè)基因采用熒光定量PCR儀對(duì)兩組樣品進(jìn)行熒光定量PCR驗(yàn)證，每組3個(gè)重復(fù)，且每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔，根據(jù)NCBI中基因的序列設(shè)計(jì)引物（表2），以GAPDH作為內(nèi)參基因進(jìn)行矯正計(jì)算，結(jié)果采用2-ΔΔCT方法進(jìn)行分析。

1.3" 數(shù)據(jù)處理

1.3.1" 全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)處理

采用PacBio官方軟件包SMRTlink處理PacBio測(cè)序原始下機(jī)數(shù)據(jù)，獲得高質(zhì)量的consensus序列進(jìn)行分析。利用獲得的Illumina高質(zhì)量數(shù)據(jù)對(duì)三代reads進(jìn)行測(cè)序錯(cuò)誤校正，同時(shí)采用GMAP（genomic mapping and alignment program）軟件［20］將Polished consensus序列比對(duì)到梅花鹿參考基因組［21］上，并對(duì)未比對(duì)到參考基因組的轉(zhuǎn)錄本序列進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)功能注釋；采用軟件SMRTlink v8.0對(duì)輸出數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾和處理；使用下機(jī)數(shù)據(jù)中subreads.bam文件經(jīng)過(guò)CCS算法，即對(duì)單分子多次測(cè)序序列進(jìn)行自我糾錯(cuò)，得到CCS序列；通過(guò)檢測(cè)CCS是否包含5'-primer、3'-primer、poly-A對(duì)CCS進(jìn)行分類找出FLNC序列和nFL序列；將同一轉(zhuǎn)錄本的FLNC序列使用hierarchical n*log（n）算法聚類，得到consensus序列；最后對(duì)得到的全長(zhǎng)序列進(jìn)行polish，終獲得Polished consensus序列進(jìn)行后續(xù)分析。

1.3.2" 新基因的功能注釋

為了研究新基因的注釋信息，將新基因進(jìn)行基因本體論（gene ontology，GO）、東京基因與基因組百科全書(shū)（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）、非冗余數(shù)據(jù)庫(kù)（nonredundant protein database，NR）、蛋白質(zhì)序列（swiss-port protein database，Swiss-Prot）、蛋白質(zhì)真核同源（clusters of eukaryotic orthologous groups，KOG）、蛋白質(zhì)家族數(shù)據(jù)庫(kù)（protein families database，PFAM）和核苷酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)（nucleotide sequene database，NT）7個(gè)公共數(shù)據(jù)庫(kù)的功能注釋。

1.3.3" 可變剪接（AS）及融合基因分析

利用SUPPA軟件［22］對(duì)AS進(jìn)行分析，將鑒定的AS事件分為7類：外顯子跳躍（SE）、外顯子互斥（MX）、5'端可變剪接（A5）、3'端可變剪接（A3）、內(nèi)含子滯留（RI）、起始外顯子可變剪接（AF）、終止外顯子可變剪接（AL）。融合基因是指兩個(gè)或多個(gè)基因的編碼區(qū)首尾相連，置于同一套調(diào)控序列（包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、核糖體結(jié)合序列、終止子等）控制之下構(gòu)成的嵌合基因。本研究將獲得的融合基因序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中進(jìn)行序列比對(duì)。

1.3.4" 差異表達(dá)基因篩選

利用DESeq軟件的readcount數(shù)據(jù)分析組間基因表達(dá)差異。用DEGseq軟件進(jìn)行組間差異表達(dá)分析。P ≤0.05和|Fold change|gt;1作為差異表達(dá)基因的篩選閾值。

1.3.5" GO和KEGG功能富集分析

本研究使用KOBAS-I （http：//bioinfo.org/kobas/）在線軟件對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO、KEGG功能富集分析，P≤0.05 時(shí)，則表明該通路顯著富集。

1.3.6" 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析（PPI）

在STRING數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)所有差異表達(dá)基因進(jìn)行蛋白互作分析，結(jié)果導(dǎo)入到Cytoscape3.7.1軟件中進(jìn)行可視化。然后用CytoNCA插件進(jìn)行Hub基因分析，參數(shù)為默認(rèn)值。

1.3.7" 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用excel進(jìn)行數(shù)據(jù)錄入，采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，多組比較采用單因素方差分析，以P≤0.05表示統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異顯著，柱形圖采用GraphPad Prism 8.0繪制。

2" 結(jié)" 果

2.1" 全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用PacBio Sequel測(cè)序平臺(tái)分別對(duì)高、低產(chǎn)組梅花鹿鹿茸進(jìn)行全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，高產(chǎn)組共獲得了148.46 GB的Subreads，有效插入片段數(shù)目36 074 385 bp，平均長(zhǎng)度為4 116 bp，N50為4 548 bp；低產(chǎn)組共獲得了135.06 GB的Subreads，有效插入片段數(shù)目32 413 962 bp，平均長(zhǎng)度4 167 bp，N50為4 534 bp。

2.2" 轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)庫(kù)注釋

高產(chǎn)組鹿茸共檢測(cè)到16 133條全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本，其中已知轉(zhuǎn)錄本數(shù)目1 620條，已知基因新轉(zhuǎn)錄本數(shù)目13 834條，新基因的新轉(zhuǎn)錄本數(shù)目679條，低產(chǎn)組鹿茸共檢測(cè)到19 742條全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本，其中已知轉(zhuǎn)錄本數(shù)目1 790條，已知基因新轉(zhuǎn)錄本數(shù)目17 001條，新基因的新轉(zhuǎn)錄本數(shù)目951條。本研究對(duì)對(duì)應(yīng)物種信息的NR數(shù)據(jù)庫(kù)、蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)KOG注釋信息、劃分基因功能的GO數(shù)據(jù)庫(kù)以及分析基因通路的KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)一步分析。

2.2.1" NR功能注釋

在本研究中，高產(chǎn)組中共有15 895條Unigenes被注釋到NR數(shù)據(jù)庫(kù)中，其中有12.61%的新基因被注釋到綿羊（Ovis aries）上、12.02%的新基因被注釋到黃牛（Bos taurus）上、11.01%的新基因被注釋到山羊（Capra hircus）上。低產(chǎn)組中共有19 380條Unigenes被注釋到NR數(shù)據(jù)庫(kù)中，其中有12.33%的新基因被注釋到黃牛（Bos taurus）上、12.00%的新基因被注釋到綿羊（Ovis aries）上、11.23%的新基因被注釋到山羊（Capra hircus）上。對(duì)比可知，高、低產(chǎn)組在物種相似度上差異不顯著（圖2）。

2.2.2" KOG功能注釋

高產(chǎn)組在KOG數(shù)據(jù)庫(kù)中共有12 561條Unigenes被注釋，分別注釋到26個(gè)小類中，其中被注釋到的Unigenes最多的是一般功能小類（2 084條），隨后是信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制（1 907條）以及細(xì)胞外結(jié)構(gòu)（1 289條），而未命名蛋白被注釋到的Unigenes最少（11條），其次是次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和分解代謝（47條）；而低產(chǎn)組共有15 268條Unigenes被注釋，同樣注釋到26個(gè)小類中，被注釋到較多的小類同高產(chǎn)組相同分別為一般功能小類（2 642條）、信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制（2 421條）以及細(xì)胞外結(jié)構(gòu)（1 421條），被注釋到較少的與高產(chǎn)組略有不同，分別是未命名蛋白（17條）以及細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性功能（47條）（圖3）。

2.2.3" KEGG功能注釋

高、低產(chǎn)組在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中分別注釋到15 757條Unigenes和19 188條Unigenes，其中均包含新陳代謝、基因信息處理、環(huán)境信息處理、細(xì)胞進(jìn)程、生物系統(tǒng)以及人類疾病6個(gè)一級(jí)通路。在兩組數(shù)據(jù)中均為信號(hào)傳導(dǎo)通路占比最高分別為2 443條和2 866條，耐藥性、抗菌性占比最低，均為1條（圖4）。

2.2.4" GO功能注釋

在本研究中，高產(chǎn)組在GO數(shù)據(jù)庫(kù)中被注釋到的Unigenes為12 180條，而低產(chǎn)組為14 519條，均可分為生物過(guò)程、細(xì)胞組分、分子功能3個(gè)大類。在高產(chǎn)組生物過(guò)程的24個(gè)小類中以細(xì)胞過(guò)程（5 110條）定位的較多，以行為（1條）、定位的較少；在細(xì)胞組分的18個(gè)小類中以細(xì)胞（3 348條）定位的最多，以突觸（11條）定位的最少；在分子功能的11個(gè)小類中以結(jié)合活性（8 346條）定位的居多，以金屬合酶活性（1條）、定位的較少。低產(chǎn)組生物過(guò)程的23個(gè)小類中以細(xì)胞過(guò)程（6 156條）、定位的較多，以節(jié)律過(guò)程（6條）定位的較少；在分子功能的10個(gè)小類以結(jié)合活性（9 904條）定位的居多，以抗氧化活性（58條）定位的較少；在細(xì)胞組分的18個(gè)小類中以細(xì)胞組成（3 994條）定位的較多，以突觸（10條）定位的最少（圖5）。

2.3" 轉(zhuǎn)錄因子注釋分析

根據(jù)注釋結(jié)果，將注釋到轉(zhuǎn)錄本數(shù)目最多的前30個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族進(jìn)行記錄。其中高產(chǎn)組注釋較多的家族有zf-C2H2（262個(gè)）、ZBTB（110個(gè)），而zf-GATA、HSF、IRF、CG-1家族注釋較少，均只有3個(gè)。低產(chǎn)組注釋較多的家族有zf-C2H2（358個(gè)）、ZBTB（114個(gè)），而CG-1、NF-YA、ESR-like家族注釋較少，均為4個(gè)。值得一提的是高產(chǎn)組中bHLH家族注釋數(shù)量（39個(gè)）要高于TF_bZIP家族（38個(gè)），而低產(chǎn)組中則相反，TF_bZIP家族注釋數(shù)量（46個(gè)）高于bHLH家族（40個(gè)）（圖6）。

2.4" AS分析

在發(fā)生可變剪接的基因比例中，高產(chǎn)組SE、AF占比較高，分別為20.48% 和15.13%，MX占比最低，為1.85%。低產(chǎn)組占比最高的同樣為SE和AF占比較高20.47% 和15.26%，最低為MX，占比為1.63%（表3）。

2.5" 融合基因分析

在融合基因檢測(cè)中，高產(chǎn)組共檢測(cè)到26個(gè)融合基因，其中7個(gè)融合基因來(lái)自同一個(gè)染色體，占比約為26.92%，19個(gè)來(lái)自不同染色體，占比約為73.08%；低產(chǎn)組共檢測(cè)到28個(gè)融合基因，其中9個(gè)融合基因來(lái)自同一個(gè)染色體，占比約為32.14%， 19個(gè)來(lái)自不同染色體，占比約為67.86%。通過(guò)對(duì)兩組融合基因的對(duì)比，發(fā)現(xiàn)即使是不同染色體來(lái)源的融合基因中兩組仍有相似，但是高產(chǎn)組中有5個(gè)融合基因?yàn)槠洫?dú)有，而低產(chǎn)組中有7個(gè)融合基因?yàn)槠洫?dú)有，通過(guò)進(jìn)一步對(duì)這12個(gè)融合基因進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)發(fā)現(xiàn)，COL1A1基因在3個(gè)融合基因中均起到主要作用。

2.6" 差異表達(dá)基因分析

將每個(gè)樣品測(cè)序數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)DESeq標(biāo)準(zhǔn)化后進(jìn)行差異分析，以Plt;0.05和|Fold change|gt;1為篩選閾值，兩組樣品中共篩選到207個(gè)差異表達(dá)基因，其中59個(gè)上調(diào)基因，148個(gè)下調(diào)基因（圖7）。

為了深入了解高、低產(chǎn)鹿茸中差異基因的表達(dá)模式，本研究對(duì)篩選出的差異表達(dá)基因進(jìn)行了聚類分析。KEGG富集結(jié)果顯示：差異表達(dá)基因主要與甲狀旁腺激素的合成、分泌和作用相關(guān)通路（parathyroid hormone synthesis， secretion and action）、鈣信號(hào)通路（calcium signaling pathway）、膽固醇代謝通路（cholesterol metabolism）、精、脯氨酸代謝（arginine and proline metabolism）等通路相關(guān)（圖8）。GO富集結(jié)果顯示：差異表達(dá)基因主要與生物生長(zhǎng)的負(fù)調(diào)控（negative regulation of multicellular organism growth）、細(xì)胞外空間（extracellular space）、鈣離子調(diào)節(jié)的胞吐作用（calcium-ion regulated exocytosis）等條目相關(guān)（圖9）。

對(duì)篩選出的207個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行PPI蛋白互作分析（圖10）。以BC（betweenness centrality）值為主要篩選條件，篩選出11個(gè)Hub基因，依次是APOB、SH3GL2、SYT1、ANGPTL4、FGF21、CACNA1E、SERPINF2、CACNB4、KLK4、LRP2、KCNA1。隨機(jī)選取APOB、SYT1、ANGPTL4、FGF21、SERPINF2、CACNB4六個(gè)基因?qū)ζ溥M(jìn)行熒光定量PCR驗(yàn)證。結(jié)果與測(cè)序結(jié)果相吻合（圖11）。

3" 討" 論

長(zhǎng)期以來(lái)，鹿茸一直是梅花鹿生產(chǎn)過(guò)程中的首要經(jīng)濟(jì)性狀［23］。為了獲得更加準(zhǔn)確的梅花鹿鹿茸轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，以及對(duì)高、低產(chǎn)鹿茸轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行對(duì)比，深入挖掘鹿茸生長(zhǎng)相關(guān)基因。在本研究中，利用PacBio Sequel測(cè)序以及Illumina測(cè)序相結(jié)合的方法，共獲得了高、低產(chǎn)鹿茸約283.52 Gb的數(shù)據(jù)。同

內(nèi)圈為11個(gè)Hub基因

The 11 Hub genes in the inner circle

時(shí)，高、低產(chǎn)組分別共檢測(cè)到16 133、19 742條全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本，在數(shù)據(jù)庫(kù)注釋中，兩組轉(zhuǎn)錄組在KOG數(shù)據(jù)庫(kù)存在明顯差異。測(cè)序數(shù)據(jù)經(jīng)DESeq標(biāo)準(zhǔn)化后進(jìn)行差異分析共得到207個(gè)差異表達(dá)基因，這些基因可能與鹿茸產(chǎn)量有關(guān)。

Zhang等［24］將生長(zhǎng)階段以及骨化階段的鹿茸分別進(jìn)行測(cè)序，以期深入了解鹿茸快速生長(zhǎng)和骨化的相關(guān)機(jī)制。其中，該研究對(duì)7大數(shù)據(jù)庫(kù)注釋顯示NT數(shù)據(jù)庫(kù)占比最高，其次為NR數(shù)據(jù)庫(kù)；在NR數(shù)據(jù)庫(kù)和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中兩組差異并不明顯。但在KOG數(shù)據(jù)庫(kù)中，在次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和分解代謝小類中的注釋略有差別，可能是因?yàn)槟承┐x產(chǎn)物影響著鹿茸生長(zhǎng)，但仍需進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證；GO數(shù)據(jù)庫(kù)注釋顯示，高、低產(chǎn)兩組在結(jié)合活性注釋到的基因均最多，這與在小尾寒羊中的結(jié)果一致［25］，這說(shuō)明結(jié)合活性在影響鹿茸產(chǎn)量的過(guò)程中可能發(fā)揮了重要作用。

本研究中，高、低鹿茸產(chǎn)組分別注釋到718、907個(gè)轉(zhuǎn)錄因子。其中兩組中轉(zhuǎn)錄因子注釋最多的家族均為zf-C2H2，該家族是人類最大的一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族，也是哺乳動(dòng)物最大的家族之一［26］。其次均為ZBTB家族，該家族具有基因轉(zhuǎn)錄功能，對(duì)于細(xì)胞的增殖、分化、凋亡和功能調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮著重要的作用［27］。而兩組在bHLH與TF_bZIP兩個(gè)家族的注釋中略有差別，高產(chǎn)組中bHLH家族數(shù)量要高于TF_bZIP家族，低產(chǎn)組中則相反。在bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族中，有16個(gè)成員僅在高產(chǎn)組中被發(fā)現(xiàn)，而另外17個(gè)成員則僅存在于低產(chǎn)組中。這些轉(zhuǎn)錄因子很有可能與鹿茸生長(zhǎng)相關(guān)。目前，在鹿科動(dòng)物中，并沒(méi)有對(duì)該類轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行深入研究，但在牦牛中［28］，bHLH轉(zhuǎn)錄因子參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、DNA結(jié)合、神經(jīng)元分化以及肌肉器官發(fā)育等多個(gè)生物學(xué)過(guò)程。而在山羊中［29］，該家族廣泛參與肌肉細(xì)胞生成與器官發(fā)生、細(xì)胞增殖與分化以及晝夜節(jié)律等相關(guān)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程。由此可知，該家族或許與發(fā)育和增殖有關(guān)，因此可為研究梅花鹿鹿茸生長(zhǎng)提供重要依據(jù)。

本研究?jī)山M樣本中檢測(cè)到的可變剪接事件均為SE占比最高，這與山羊［30］、伊拉兔［31］等的分析結(jié)果一致，這或許可以說(shuō)明SE事件在動(dòng)物體中最為普遍，發(fā)揮的功能更加廣泛。車隆等［32］的研究發(fā)現(xiàn)，SE可能與骨骼肌細(xì)胞的分化、橫紋肌組織發(fā)育調(diào)節(jié)等密切相關(guān)，這些數(shù)據(jù)說(shuō)明SE可能與分化、發(fā)育調(diào)節(jié)等生物過(guò)程相關(guān)，所以可能在鹿茸生長(zhǎng)中發(fā)揮作用。此外，兩組發(fā)生可變剪接時(shí)間的比例雖然相似，但仍存在較多差異基因，這些發(fā)生相同可變剪接事件的不同基因很可能與鹿茸生長(zhǎng)相關(guān)。

在融合基因檢測(cè)中，低產(chǎn)組中不同染色體上融合的基因相較于高產(chǎn)組來(lái)說(shuō)占比更高，更容易引起基因表達(dá)異常以及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變。同時(shí)在不同染色體來(lái)源的融合基因中，高產(chǎn)組中有5個(gè)融合基因?yàn)槠洫?dú)有，而低產(chǎn)組中有7個(gè)融合基因?yàn)槠洫?dú)有。通過(guò)對(duì)兩組特有的融合基因序列進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)發(fā)現(xiàn)，COL1A1基因在3個(gè)融合基因均發(fā)揮主效作用。COL1A1基因編碼的I型膠原蛋白α1鏈?zhǔn)羌?xì)胞外基質(zhì)（ECM）的主要結(jié)構(gòu)蛋白，在多個(gè)組織中發(fā)揮作用。該基因不僅作為結(jié)構(gòu)蛋白起到物理支撐作用，還作為關(guān)鍵因子參與多種細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)。COL1A1通過(guò)與細(xì)胞表面的整合素受體結(jié)合，可以激活多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑，如MAPK/ERK、PI3K/Akt等，這些信號(hào)途徑參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和生存［33］。在腫瘤細(xì)胞相關(guān)的研究中，過(guò)表達(dá)COL1A1基因，能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，并影響其侵襲［34］。COL1A1還可能通過(guò)影響細(xì)胞凋亡相關(guān)信號(hào)途徑，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的生存和死亡。綜上所述，COL1A1基因可能通過(guò)影響細(xì)胞增殖、分化和凋亡等過(guò)程，來(lái)對(duì)鹿茸生長(zhǎng)發(fā)揮作用，該基因可以作為影響茸重性狀的候選基因。融合基因可以加速遺傳物質(zhì)的重組和傳遞，從而縮短育種周期，為梅花鹿育種工作提供新思路。

GO和KEGG富集分析顯示，與鹿茸產(chǎn)量相關(guān)的差異基因主要與鈣離子調(diào)節(jié)的胞吐作用、甲狀旁腺激素的合成、分泌和作用相關(guān)通路、膽固醇代謝通路以及精、賴氨酸通路等生物過(guò)程相關(guān)。目前，甲狀腺激素、甲狀旁腺激素已被證實(shí)可以與其他激素共同調(diào)控骨骼的生長(zhǎng)［35］。由膽固醇轉(zhuǎn)化而成的1，25-二羥基維生素D3能夠促進(jìn)破骨細(xì)胞分化，調(diào)節(jié)鈣的重吸收［36］，研究證實(shí)，破骨細(xì)胞對(duì)于鹿茸生長(zhǎng)有著密切關(guān)系。鹿茸生長(zhǎng)過(guò)程中鈣離子調(diào)節(jié)和膽固醇代謝發(fā)揮著不可或缺的作用，這與Van Der Eems等［37］的研究結(jié)果一致。張然然等［38］提出精氨酸在鹿茸生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中會(huì)有顯著變化。以上結(jié)果表明，甲狀旁腺激素的合成、分泌和作用相關(guān)通路、膽固醇代謝通路和精賴氨酸代謝通路等可以作為影響鹿茸產(chǎn)量的關(guān)鍵通路。

2018年，Hu等［39］采用PacBio公司的RS系統(tǒng)對(duì)梅花鹿三杈茸高產(chǎn)、低產(chǎn)兩組混合RNA進(jìn)行全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，同時(shí)高產(chǎn)、低產(chǎn)兩組共6個(gè)樣品進(jìn)行Illumina測(cè)序。獲得了ACTN1、BAG6、COL1A2等26個(gè)與鹿茸生長(zhǎng)相關(guān)的基因，與本研究并沒(méi)有重合基因，這可能是由于基因表達(dá)在鹿茸不同生長(zhǎng)期會(huì)存在差異而二杠茸與三杈茸生長(zhǎng)期不同，發(fā)揮作用的基因不同所導(dǎo)致的。本研究對(duì)差異基因進(jìn)行蛋白互作分析獲得了11個(gè)Hub基因。其中，LRP2作為一種多配體內(nèi)吞受體，在脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)中起著至關(guān)重要的作用，它通過(guò)介導(dǎo)多種脂質(zhì)成分的細(xì)胞攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)，維持脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)［40］。APOB是血液中脂質(zhì)運(yùn)輸?shù)年P(guān)鍵蛋白，同時(shí)可以參與脂蛋白的代謝過(guò)程。吉琳等［41］研究結(jié)果同樣表明APOB在脂類代謝中發(fā)揮重要作用且鹿茸蠟片中脂質(zhì)代謝產(chǎn)物含量最高［42］。ANGPTL4基因可以通過(guò)影響甘油三酯和高密度脂蛋白的水平，參與調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝［43］。FGF21可以通過(guò)促進(jìn)脂肪酸氧化、抑制脂肪酸合成、調(diào)節(jié)脂蛋白代謝和抗動(dòng)脈粥樣硬化作用，在脂質(zhì)代謝中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)功能［44］。LRP2、APOB、ANGPTL4和FGF21通過(guò)不同的機(jī)制協(xié)同工作，維持脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)，并影響脂質(zhì)的攝取、轉(zhuǎn)運(yùn)、合成和代謝過(guò)程。在本研究中，這些基因共同富集到膽固醇代謝通路，膽固醇代謝可以調(diào)節(jié)IGF1，IGF1刺激膽固醇合成，故這些基因可能通過(guò)調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝來(lái)影響鹿茸生長(zhǎng)。KLK4可以通過(guò)釋放細(xì)胞外基質(zhì)中的生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子，從而影響細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和遷移［45］。CACNB4基因編碼的CaMKIIβ亞基是細(xì)胞內(nèi)鈣離子信號(hào)通路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，通過(guò)感應(yīng)和響應(yīng)鈣離子濃度變化，激活并參與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)多種生理過(guò)程和信號(hào)傳導(dǎo)［46］。KLK4與CACNB4可能是通過(guò)調(diào)節(jié)鈣離子相關(guān)功能在鹿茸生長(zhǎng)中發(fā)揮作用。鹿茸的再生是包括神經(jīng)、血管等組織的完全再生［47］，SYT1基因編碼的突觸結(jié)合蛋白1作為一種鈣離子感受器，在神經(jīng)遞質(zhì)釋放和突觸小泡停泊過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用［48］。SH3GL2在神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛存在［49］，因此，SH3GL2和SYT1可能通過(guò)影響神經(jīng)組織調(diào)節(jié)鹿茸的再生。通過(guò)進(jìn)一步比對(duì)發(fā)現(xiàn)，KEGG富集結(jié)果與11個(gè)Hub基因具有一致性。主要富集在甲狀旁腺激素的合成、分泌和作用相關(guān)通路、鈣離子相關(guān)通路以及膽固醇代謝通路等相關(guān)通路。

4" 結(jié)" 論

本研究基于三代全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組以及二代高通量混合測(cè)序，更加準(zhǔn)確地挖掘出與梅花鹿茸重相關(guān)的bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族、SE可變剪接、融合基因中的主效基因COL1A1以及207個(gè)候選差異基因。11個(gè)樞紐基因均富集在甲狀旁腺激素、鈣離子調(diào)節(jié)以及膽固醇代謝等通路，可能通過(guò)與IGF1互作調(diào)控鹿茸的生長(zhǎng)。但與IGF1的互作機(jī)制還需進(jìn)一步探究。本研究為探索茸重基因提供了新的見(jiàn)解，為后續(xù)的功能基因驗(yàn)證和分子育種指明了方向。

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（編輯" 郭云雁）