【摘 要】 優(yōu)化三七、天麻、水蛭、燈盞乙素抗血栓作用的組方配比，為深入研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。采用四因素六水平均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)考察三七、天麻、水蛭、燈盞乙素組方中各劑量的最佳配比，并通過測定小鼠出血時(shí)間及ADP誘導(dǎo)小鼠急性肺血栓模型，觀察藥物對(duì)小鼠抗血栓作用的影響。研究結(jié)果初步確定三七總皂苷、天麻提取物、水蛭凍干及燈盞花乙素改善血栓形成的最佳劑量配比為 10∶10∶150∶30 mg/kg。

【關(guān)鍵詞】 血栓；三七；天麻；水蛭；燈盞乙素

【中圖分類號(hào)】R285.5"" 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A""" 【文章編號(hào)】1007-8517（2024）15-0024-05

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2024.15.zgmzmjyyzz202414007

Optimization of the Ratio of Four Traditional Chinese Medicines for Antithrombotic Effect by Uniform Design Method

Abstract：To optimize the composition ratio of the anti-thrombotic effect of Panax notoginseng，Erigeron breviscapus，leech and Scutellarin，providing the experimental basis for in-depth study.A experimental design of four-factors，six-levels was used to investigate the optimal ratio of the doses of Panax notoginseng，Erigeron breviscapus，leech and Scutellarin，and the effect of the herbs on the antithrombotic effect on mice was observed by measuring the bleeding time and ADP-induced acute pulmonary thrombosis model.The results of the study initially determined that the optimal dose ratio of Panax notoginseng，Erigeron breviscapus，leech and Scutellarin，providing for improving thrombosis was 10∶10∶150∶30 mg/kg.

Key words：Thrombus; Panax Notoginseng; Erigeron Breviscapus; Leech; Scutellarin

冠心病、缺血性腦卒中和靜脈血栓等多種疾病合稱血栓性疾病，主要是由于血栓的形成及栓塞兩種病理過程所引起［1］。據(jù)統(tǒng)計(jì)，心血管疾病持續(xù)數(shù)十年呈上升趨勢，冠心病及缺血性腦卒中是造成全球死亡率的主要原因［2］。卒中是我國位居首位的致殘及致死原因［3］，嚴(yán)重影響著人們的健康。然而三七、天麻、水蛭和燈盞花已有多年抗血栓研究報(bào)道且已成為臨床中的常用藥。前期，課題組也對(duì)這四種中藥進(jìn)行單味藥抗血栓作用對(duì)比研究，結(jié)果顯示，各樣品均有顯著抗凝、抗血栓作用，但側(cè)重點(diǎn)有所差異。因此本實(shí)驗(yàn)是在之前的研究上增加對(duì)四種中藥抗血栓作用配比研究，以期將療效側(cè)重點(diǎn)不同的抗血栓藥物進(jìn)行科學(xué)的組方配伍，為臨床用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 DENVER INSTRUMENT電子分析天平［賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司］；HX602Z型電子天平（慈溪市大東衡器廠）；248WBJV型海爾冰箱（青島市海爾股份有限公司）；容量瓶、量筒、燒杯、剪刀、秒表、小鼠固定器、玻璃毛細(xì)管及其它耗材均為國產(chǎn)。

1.2 材料 二磷酸腺苷（C10H15N5O10P2，ADP，批號(hào)：N31M8W37078，上海源葉生物科技有限公司），存貯：-20 ℃，規(guī)格：5 g。使用時(shí)生理鹽水配制成250 mg/kg體重，按10 mL/kg尾靜脈注射。三七總皂苷（代號(hào)A，含量＞90%）；燈盞花素（代號(hào)B，含燈盞乙素＞90%）；天麻提物（代號(hào)C，提取率0.583%，每克約相當(dāng)于生藥171.5 g）；水蛭凍干粉（代號(hào)D，每克約相當(dāng)于鮮品3.7 g），均由云南中醫(yī)藥大學(xué)周志宏教授提供。復(fù)方丹參片（批號(hào)ZFA1504，云南白藥集團(tuán)股份有限公司）遮光、密封、陰涼處保存，實(shí)驗(yàn)時(shí)，用0.5%的CMC-Na配制成一定濃度的混懸液供小鼠灌胃用。阿司匹林（批號(hào)：8J14974，100 mg/片，30片/盒拜耳醫(yī)藥保健有限公司）按1.5 mg/mL的濃度灌胃給藥。羧甲基纖維素鈉（批號(hào)：F20200909，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）用純凈水配置成0.5%CMC-Na。

1.3 動(dòng)物 SPF級(jí)雄性ICR小鼠，4～6周齡，體重20～24 g，由昆藥集團(tuán)股份有限公司動(dòng)物室提供，生產(chǎn)許可證：SCXK（滇）2014-0001，發(fā)證機(jī)關(guān)：昆明市科學(xué)技術(shù)局。飼養(yǎng)于IVC動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，溫度20～25 ℃（日溫差≤3 ℃），濕度40%～70%，照明12 h∶12 h明暗交替，照度150～300 lx，噪音≤60 dB，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證：SYXK（滇）2013-0004，發(fā)證單位：昆明市科學(xué)技術(shù)局。PVC透明塑料盒群養(yǎng)，每箱≤6只，每日喂飼鼠用配合飼料，自由飲水，視情況更換籠具和墊料，飼料來源于昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證：SCXK（滇）K2015-0002，發(fā)證單位：昆明市科學(xué)技術(shù)局。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 四因素六水平均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)

2.1.1 劑量水平及組方設(shè)計(jì) 按前期藥材得率和用量確定組方的君、臣、佐、使分別為燈盞花、天麻、三七、水蛭。本研究按均勻設(shè)計(jì)原則選用U6（64）表，以四味藥材的有效組分燈盞乙素（X4）、天麻提取物（X2）、三七總皂苷（X1）、水蛭凍干（X4）作為考察因子，每個(gè)因子分別取6個(gè)水平（即呈梯度遞增的6種不同劑量）。根據(jù)三七總皂苷、天麻提取物、水蛭凍干、燈盞花乙素口服制劑的臨床使用劑量，得出小鼠的等效劑量分別為50 mg/kg（300 mg/60×10）、10 mg/kg（10 g/60×10×0.583%）、150 mg/kg（3 g/60×10×27.1%）、20 mg/kg（120 mg/60×10），并以此為基礎(chǔ)確定三七總皂苷小鼠的劑量范圍10～60 mg/kg、天麻提取物劑量范圍5～30 mg/kg、水蛭凍干劑量范圍50～300 mg/kg、燈乙素劑量范圍5～30 mg/kg，從低到高選取6個(gè)劑量水平，見表1、表2、表3。

2.2 藥效篩選試驗(yàn)研究

2.2.1 對(duì)小鼠出血時(shí)間的影響［4］ 選用21～24 g雄性ICR小鼠108只，按體重隨機(jī)分為9組：溶媒對(duì)照；陽性對(duì)照阿司匹林30 mg/kg、復(fù)方丹參480 mg/kg；實(shí)驗(yàn)1～6號(hào)組；每組12只。各組動(dòng)物每日分別按劑量經(jīng)口灌胃給藥1次，連續(xù)5 d，溶媒對(duì)照組給予0.5%CMC-Na，容積均為20 mL/kg。末次給藥后30 min，將小鼠尾尖5 mm處剪斷，從出血開始（濾紙上出現(xiàn)血跡）計(jì)時(shí)，每30 s用濾紙吸去血滴一次，直到出血自然停止（濾紙上無血跡）的時(shí)間即為出血時(shí)間。結(jié)果見表4。

由表4可見，各給藥組均能不同程度延長斷尾小鼠的出血時(shí)間，以實(shí)驗(yàn)1號(hào)、2號(hào)、4號(hào)及ASP、復(fù)方丹參片組作用最為顯著，實(shí)驗(yàn)3號(hào)組、5號(hào)組、6號(hào)組與溶媒對(duì)照組相比有作用趨勢但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。各組作用順序?yàn)椋篈SP＞復(fù)方丹參＞實(shí)驗(yàn)1號(hào)＞實(shí)驗(yàn)4號(hào)＞實(shí)驗(yàn)2號(hào)＞實(shí)驗(yàn)3號(hào)＞實(shí)驗(yàn)6號(hào)＞實(shí)驗(yàn)5號(hào)。

2.2.2 對(duì)ADP誘導(dǎo)小鼠肺血栓的影響 分組及給藥同2.2.1試驗(yàn)。于末次給藥后1 h，按文獻(xiàn) ［5］方法于小鼠尾靜脈注射200 mg/kg的ADP-Na生理鹽水溶液10 mL/kg，小鼠隨即發(fā)生偏癱、呼吸喘促、不能活動(dòng)。記錄注射誘導(dǎo)劑后至小鼠呼吸正常、四肢恢復(fù)自主活動(dòng)所需的時(shí)間。結(jié)果如圖1。

由圖1可見，除ASP陽性對(duì)照組造模死亡6只動(dòng)物外，其余所有給藥組均能不同程度縮短ADP-2Na誘導(dǎo)急性肺血栓小鼠癱瘓和呼吸喘促的時(shí)間，以實(shí)驗(yàn)1號(hào)組、2號(hào)組、3號(hào)組、4號(hào)組、6號(hào)組作用最為顯著，實(shí)驗(yàn)5號(hào)及復(fù)方丹參片組僅有作用趨勢而無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。各組作用順序?yàn)閷?shí)驗(yàn)3號(hào)gt;實(shí)驗(yàn)2號(hào)gt;實(shí)驗(yàn)1號(hào)gt;實(shí)驗(yàn)4號(hào)gt;實(shí)驗(yàn)6號(hào)gt;復(fù)方丹參gt;實(shí)驗(yàn)5號(hào)gt;ASP。

2.3 對(duì)均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化分析 將以上藥效學(xué)試驗(yàn)的結(jié)果分別輸入計(jì)算機(jī)，采用DPS v8.01統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行均勻設(shè)計(jì)回歸分析，得出相關(guān)指標(biāo)的回歸方程和最優(yōu)結(jié)果。見表5。

2.4 最佳配比 當(dāng)三七總皂苷、天麻提取物、水蛭凍干及燈盞花乙素的劑量配比為10∶10∶150∶30 mg/kg（實(shí)驗(yàn)1號(hào)）時(shí)，小鼠出血時(shí)間最長（365.7 s） （表4），與溶媒對(duì)照組相比延長35.81%；由回歸方程得出最佳配比為10∶5∶136∶30，出血時(shí)間361.2 s；以出血時(shí)間計(jì)算，四味中藥材配比與設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)1號(hào)組方配比最接近，兩組劑量配比基本相當(dāng)。當(dāng)三七總皂苷、天麻提取物、水蛭凍干及燈盞花乙素的劑量配比為30∶30∶100∶20 mg/kg（實(shí)驗(yàn)3號(hào)）時(shí)，小鼠癱瘓持續(xù)時(shí)間最短（459.3 s） （圖1），與溶媒對(duì)照組相比縮短28.86%；由回歸方程得出最佳配比為60∶5∶50∶5，癱瘓持續(xù)時(shí)間453.6 s；以癱瘓時(shí)間計(jì)算出的藥物劑量配比與效果最佳的實(shí)驗(yàn)3號(hào)組方劑量配比差異較大。對(duì)以上2個(gè)指標(biāo)的回歸方程表明，當(dāng)三七總皂苷、天麻提取物、水蛭凍干及燈盞花乙素的劑量配比為10∶5∶190∶30 mg/kg時(shí)，小鼠出血時(shí)間為360.0 s，癱瘓時(shí)間為458.7 s。同樣與實(shí)驗(yàn)1號(hào)組方劑量配比相似。

綜合以上分析，初步確定三七總皂苷、天麻提取物、水蛭凍干及燈盞花乙素改善血栓形成的最佳劑量配比為1號(hào)組方，即10∶10∶150∶30 mg/kg。

3 討論

本文按君、臣、佐、使來確定組方中燈盞花、天麻、三七、水蛭的用量，確認(rèn)了組方的優(yōu)效性及最佳配比，為后續(xù)研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但目前只做了小鼠出血時(shí)間和肺血栓時(shí)間兩個(gè)實(shí)驗(yàn)，后續(xù)還應(yīng)增加更多模型來支撐該組方的改善血栓形成作用。目前已發(fā)現(xiàn)的多種植物中藥有效成分具有明顯的抗血栓作用，如黃酮類的槲皮素能減少血小板聚集以及膠原激活的血栓形成［6］，小檗堿可以抑制血小板聚集［7］，二萜醌類化合物丹參酮IIA具有明顯的抗凝血作用［8］，這對(duì)于進(jìn)一步將中藥防治血栓性疾病應(yīng)用于臨床具有重要意義。如今血栓性疾病席卷全球，對(duì)于抗血栓藥物的開發(fā)是一個(gè)熱點(diǎn)。而我國中藥資源豐富多樣，更應(yīng)該以中醫(yī)藥傳統(tǒng)理論為基點(diǎn)，對(duì)組方的配伍規(guī)律進(jìn)行研究，并通過對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析與綜合評(píng)價(jià)，探討復(fù)方中藥配伍與藥理效應(yīng)變化的相關(guān)規(guī)律。

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