摘要：為探究不同氮營(yíng)養(yǎng)條件下煙草氮代謝特性的變化，以烤煙品種NC89和中煙100為試驗(yàn)材料，設(shè)置高氮（5.0 mmol·L?1）和低氮（0.1 mmol·L?1）2個(gè)氮素水平，通過(guò)測(cè)定2個(gè)氮素水平下各品種根系中硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因與葉片中氮代謝關(guān)鍵調(diào)控酶基因表達(dá)水平及氮代謝關(guān)鍵酶活性、氮素營(yíng)養(yǎng)狀況、碳氮元素含量、干物質(zhì)量、根系形態(tài)變化等指標(biāo)，探究不同氮效率烤煙品種間的氮素吸收與同化能力的差異。結(jié)果表明，低氮條件下，中煙100的NtNRT1.1 和NtNRT1.2 基因表達(dá)量顯著高于NC89，而NtNRT2.3 基因則相反，NC89葉片硝酸鹽（NO-3）和可溶性蛋白含量及地下部分碳氮比值均顯著高于中煙100；在2種氮素條件下，NC89葉片中NtNIA1、NtNIA2 和NtGS1 基因的表達(dá)水平顯著高于中煙100，谷氨酰胺合成酶活性以及根系NO-3 、葉綠素含量和根系形態(tài)指標(biāo)顯著優(yōu)于中煙100。綜上，NC89氮素營(yíng)養(yǎng)狀況優(yōu)于中煙100，且在碳物質(zhì)合成方面具有優(yōu)勢(shì)。以上研究結(jié)果為深入解析煙草氮代謝分子機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：煙草；氮營(yíng)養(yǎng)；氮代謝；基因表達(dá)；酶活性

doi：10.13304/j.nykjdb.2023.0426

中圖分類(lèi)號(hào)：S572 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：10080864（2024）11006613

氮素是植物生長(zhǎng)發(fā)育中必需的元素，也是需求量最大的礦質(zhì)元素[1]。植物氮代謝途徑包括氮素被植物根系吸收并在植物體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、同化利用等過(guò)程[2]。植物主要通過(guò)根系主動(dòng)吸收土壤中的氮素，除少部分氮素在植物根系被同化利用外，大部分氮素通過(guò)木質(zhì)部導(dǎo)管被轉(zhuǎn)運(yùn)到綠色組織，并被氮素同化酶還原利用[3]。王新超等[4]認(rèn)為，品種間的氮素利用效率差異是由地上部分葉片和根系共同決定的。因此，研究植物氮代謝需要協(xié)同考慮根系氮素吸收與地上氮素同化利用2個(gè)過(guò)程。

煙草是對(duì)氮素敏感的植物，煙葉品質(zhì)極易受氮素供給量的影響，因此，明確煙草品種在不同氮素條件下的生理代謝規(guī)律尤其是氮代謝規(guī)律，對(duì)提高煙草栽培水平、提升煙葉品質(zhì)具有重要意義。已有研究對(duì)不同品種的氮素利用特點(diǎn)主要從地上部分葉片中的氮代謝關(guān)鍵基因表達(dá)水平及其酶活性[56]、煙葉衰老特性[7]、葉片氮素狀況、烤后煙葉常規(guī)化學(xué)成分的含量等方面進(jìn)行，進(jìn)而確定煙草品種的適宜氮素條件[8]。對(duì)煙草品種間的氮代謝差異研究，就煙株地上部分氮素同化與再轉(zhuǎn)移利用研究較多，而地上部和地下部相結(jié)合進(jìn)行分子水平方面的研究較少，對(duì)硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因NRT1/2 在不同煙草品種根系中的差異表達(dá)研究也不全面。因此，本研究從地下氮素吸收、地上氮素同化2 個(gè)方面分析煙草硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因NtNRT1/2、氮代謝關(guān)鍵基因、酶活性及其他主要生理指標(biāo)間的差異，進(jìn)一步明確不同氮效率煙草品種間的氮代謝差異，旨在揭示煙草氮代謝分子機(jī)制，為煙草生產(chǎn)中氮素調(diào)控提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究以煙草品種NC89和中煙100（ZY100）為材料，由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院煙草育種實(shí)驗(yàn)室提供。

所用營(yíng)養(yǎng)液是對(duì)1/2改良霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液配方進(jìn)行改進(jìn)，改進(jìn)后的配方為：CaCl2 5.0 mmol·L?1，K2SO4 2.5 mmol·L?1，MgSO4·7H2O 2.5 mmol·L?1，KH2PO4 2.0 mmol·L?1，H3BO3 0.046 25 mmol·L?1，MnCl2·4H2O 0.006 722 mmol·L-1，ZnSO4·7H2O0.000 765 mmol·L?1，CuSO4·5H2O 0.000 316 mmol·L?1，NaMoO4·5H2O 0.000 5 mmol·L?1，EDTA-FeNa0.02 mmol·L?1。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2021年在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院煙草育種實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，采用漂浮育苗法培育煙苗，待幼苗長(zhǎng)至3葉期時(shí)將其移栽到小花盆中，基質(zhì)為煙草專(zhuān)用培養(yǎng)基質(zhì)，每3 d使用含有不同氮素水平的營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行澆灌。試驗(yàn)采用雙因素隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，設(shè)置高氮（5.0 mmol·L?1，T1）和低氮（0.1 mmol·L?1，T2）2個(gè)氮水平。其中氮素由NaNO3提供，培養(yǎng)條件是：光周期為12 h夜/12 h晝，溫度控制在22～25 ℃，濕度為60%左右。在處理培養(yǎng)21 d后，將各處理煙株分為兩部分：一部分沿莖基部切下，在108 ℃烘箱中殺青20 min，65 ℃下烘干至恒重，分別稱(chēng)量地上部分和地下部分的干重；然后研磨過(guò)60目篩，用于測(cè)定根系和地上部分的硝酸鹽（NO?3）含量；另一部分煙苗分別取根系和葉片，于?80 ℃液氮中速凍，并于超低溫冰箱中保存，用于測(cè)定根系和葉片中的硝酸還原酶（nitrate reductase， NR）和谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase， GS）的基因表達(dá)量和酶活性、硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因NtNRT1/2 的相對(duì)表達(dá)水平、葉片的可溶性蛋白和色素含量。每個(gè)處理重復(fù)3次，所有指標(biāo)進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 氮代謝相關(guān)基因表達(dá)量測(cè)定 參考周健飛等[6]、Liu等[9]的方法，采用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)引物，引物由擎科生物科技有限公司（北京）合成。所有引物都通過(guò)了特異性檢驗(yàn)，引物信息如表1所示。使用植物總RNA提取試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）提取根系和葉片的總RNA。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒R223-01（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）、qRT-PCR（quantitative realtime，qRT）試劑盒Q711-02/03（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）進(jìn)行cDNA反轉(zhuǎn)錄和基因表達(dá)水平測(cè)定。qRT-PCR 反應(yīng)體系為20 μL：2× TaqPro Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μl，上游引物（10 μmol·L?1）0.4 μl，下游引物（10 μmol·L?1）0.4 μl，模板 1 μl，ddH2O 8.2 μl。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性10 s， 60 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，40 個(gè)循環(huán)。溶解曲線：使用QuantStudio 5實(shí)時(shí)熒光定量PCR 系統(tǒng)[賽默飛世爾科技（中國(guó)）]的默認(rèn)融解曲線采集程序。采用2?△△CT方法[10]計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

1.3.2 氮代謝相關(guān)酶活性的測(cè)定 NR、GS 活性使用硝酸還原酶試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）、谷氨酰胺合成酶試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）根據(jù)說(shuō)明書(shū)步驟測(cè)定。

1.3.3 硝酸鹽含量的測(cè)定 采用水楊酸?濃硫酸比色法[11]測(cè)定各處理地上部分和地下部分的硝酸鹽（NO-3）含量。

1.3.4 葉片葉綠素含量測(cè)定 參照昌夢(mèng)雨等[12]方法，采用90%丙酮乙醇（體積比為1∶1）浸泡提取法提取葉片組織中的葉色素。

1.3.5 葉片可溶性蛋白含量測(cè)定 參照《植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》[11]中的考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定葉片中的可溶性蛋白含量。

1.3.6 根系形態(tài)指標(biāo)測(cè)定 選取不同處理煙苗各3株，沿莖基部切下完整根系后，使用數(shù)字化掃描儀（Epson Perfection V37）掃描根系，用WinRHIZO根系分析軟件測(cè)定煙苗根系形態(tài)指標(biāo)。

1.3.7 不同部位干物質(zhì)重和碳氮元素含量測(cè)定 將煙苗沿莖基部切開(kāi)，在105 ℃中殺青20 min，65 ℃下烘干至恒重，分別稱(chēng)量地上部分和地下部分的干重后，研磨過(guò)60目篩，用于測(cè)定根系和地上部分的NO-3 含量、碳氮元素含量。使用EuroVector EA3000/1F 型全自動(dòng)元素分析儀（意大利Euro Vector 公司）測(cè)得樣品中的總氮和總碳含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 22 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，使用Origin 2018軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 NtNRT1/2 家族基因在不同煙草品種和氮素條件下的表達(dá)分析

由圖1可知，低氮條件下，NtNRT1.1 在NC89根系中的表達(dá)量顯著低于ZY100；高氮條件下，NtNRT2.1 在NC89 根系中的表達(dá)水平顯著高于ZY100。在2 種氮素條件下，NC89 根系中NtNRT1.2 的基因表達(dá)水平均顯著低于ZY100，而NtNRT2.3 的基因表達(dá)水平顯著高于ZY100。另外，ZY100在T2條件下NtNRT1.1、NtNRT2.3 的基因表達(dá)水平顯著高于T1條件下的表達(dá)水平，說(shuō)明低氮環(huán)境誘導(dǎo)ZY100 根系中NtNRT1.1 和NtNRT2.3 基因表達(dá)上調(diào)，而NtNRT1.2 基因在T2條件下幾乎不表達(dá)。2種氮素條件下，NtNRT2.1在2個(gè)品種根系中的表達(dá)特點(diǎn)不一致，NC89根系中NtNRT2.1 基因在低氮條件下表達(dá)量極顯著降低，而ZY100根系中NtNRT2.1 基因在2種氮素條件下無(wú)顯著差異。以上結(jié)果表明，NtNRT1/2 基因表達(dá)水平在不同品種間存在差異。

2.2 氮代謝關(guān)鍵基因在不同煙草品種不同氮素條件下的差異表達(dá)情況

煙草NR 基因和GS 基因是煙草氮代謝途徑中的2類(lèi)關(guān)鍵基因，在氮素同化與再轉(zhuǎn)移利用過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。由圖2可知，NO-3 還原基因NtNIA1 和NtNIA2、氮素轉(zhuǎn)移基因NtGS1 在2種氮素條件下均表現(xiàn)為NC89顯著高于ZY100，表明煙草葉片組織中的氮代謝關(guān)鍵基因表達(dá)水平在品種間存在顯著差異。另外，氮代謝關(guān)鍵基因的表達(dá)水平明顯受到NO-3 水平的影響。2個(gè)煙草品種葉片中的NtNIA1、NtNIA2 和NtGS2 基因在T2條件下的表達(dá)水平均顯著低于T1，說(shuō)明NR 基因和質(zhì)體型GS 基因表達(dá)水平與NO-3 水平呈正相關(guān)，與品種差異不相關(guān)。

2.3 不同氮素水平下煙草品種的葉片NR 和GS活性

由圖3 可知，在同一氮素水平下NC89 葉片中的GS 活性顯著高于ZY100，氮代謝酶活性在品種之間表現(xiàn)出的規(guī)律與前面基因表達(dá)量的規(guī)律一致，表明NC89 與ZY100 相比在氮素同化利用方面具有明顯優(yōu)勢(shì)。同一煙草品種，T1 條件下葉片中的NR和GS活性都極顯著高于T2條件下的酶活性，這可能與NR和GS活性都受到NO-3誘導(dǎo)有關(guān)，外界高水平的NO-3 可以提高氮代謝關(guān)鍵酶活性。

2.4 不同氮素水平下煙草品種的氮素營(yíng)養(yǎng)狀況

對(duì)相關(guān)氮化合物含量的測(cè)定發(fā)現(xiàn)，NO-3 含量、葉綠素含量和可溶性蛋白含量在不同氮素水平不同煙草品種間都存在明顯差異。由圖4可知，在同一氮素水平下，NC89根系中的NO-3 含量均顯著高于ZY100，尤其是在T1條件下，二者根系中的NO-3 含量達(dá)到了極顯著差異。在同一煙草品種中，隨著氮素水平的降低，根系和葉片中的NO-3 含量也隨之降低，這種趨勢(shì)在2個(gè)煙草品種中表現(xiàn)一致。NO-3 含量在2個(gè)品種間的變化差異與氮代謝關(guān)鍵基因及酶活在品種間的差異相一致。葉綠素含量可以作為評(píng)價(jià)植物氮素營(yíng)養(yǎng)狀況的重要依據(jù)[13]。由圖5可知，在同一氮素水平下，NC89的葉綠素含量均顯著高于ZY100；另外，隨著氮素水平的降低，NC89葉綠素含量也隨之降低。

葉片可溶性蛋白是包含磷酸烯醇丙酮酸（phosphoenolpyruvate，PEP）羧化酶、1，5-二磷酸核酮糖（ribulose-1，5-bisphosphate，RuBP）羧化酶在內(nèi)的一些酶蛋白，其中固碳酶RuBP羧化酶約占葉片可溶性蛋白總量的50%，可溶性蛋白含量的變化可以反映此類(lèi)酶的活性變化[1415]。由圖6可知，在T2條件下，NC89葉片可溶性蛋白含量顯著高于與ZY100。在同一煙草品種中，葉片中可溶性蛋白含量隨著氮素水平的降低而顯著降低。上述結(jié)果表明，NC89氮素營(yíng)養(yǎng)狀況優(yōu)于ZY100，NC89在氮物質(zhì)合成方面具有優(yōu)勢(shì)。

2.5 不同氮素水平下烤煙品種的根系形態(tài)指標(biāo)差異

由表2可知，氮素水平對(duì)煙草根系形態(tài)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生顯著影響。與T1條件下的根系形態(tài)指標(biāo)相比，NC89和ZY100在T2條件下的總根長(zhǎng)和根尖數(shù)都顯著增加，根系體積和根系平均直徑則顯著降低，表明低氮脅迫不利于煙株根系發(fā)育。為應(yīng)對(duì)低氮脅迫，植物通過(guò)增加根系長(zhǎng)度和根尖數(shù)量來(lái)獲得更多的氮素以達(dá)到生存的目的。在同一氮素水平下，不同煙草品種之間的根系形態(tài)也有明顯差異。2 種氮素條件下，NC89 的各項(xiàng)根系形態(tài)指標(biāo)均優(yōu)于ZY100，表明NC89 根系更發(fā)達(dá)，在獲取水分、礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素方面具有顯著優(yōu)勢(shì)。

2.6 不同氮素水平下烤煙品種的干物質(zhì)積累與碳氮分配特點(diǎn)

由圖7可知，隨著氮素水平的降低，NC89地上部分的干物質(zhì)積累量顯著減少，而ZY100地下部分干物質(zhì)積累量顯著增加。同時(shí)，2個(gè)品種根冠比也出現(xiàn)了極顯著增加，并且在T2 條件下，NC89的根冠比極顯著大于ZY100。以上結(jié)果說(shuō)明，氮素水平對(duì)煙草干物質(zhì)積累具有顯著影響。

由圖8可知，同一煙草品種中，與T1條件下的碳氮比相比，2個(gè)煙草品種地上和地下部分的碳氮比在T2條件下都出現(xiàn)極顯著提高。在同一氮素水平下，NC89地下部分在T1條件下的碳氮比極顯著小于ZY100；而在T2條件下，NC89地下部分的碳氮比卻極顯著大于ZY100，NC89地上部分的碳氮比顯著小于ZY100。

碳氮比與含碳化合物和含氮化合物的含量有關(guān)，其比值大小可以反映不同組織部位的碳氮代謝強(qiáng)度以及碳氮化合物含量之間的協(xié)調(diào)程度。在2種氮素水平下，NC89和ZY100地上和地下部分的干物質(zhì)重和碳氮比的變化結(jié)果表明，不同部位的碳氮元素積累量及其分配比例也受到了影響。由表3可知，在同一煙草品種中，隨著氮素水平降低，NC89和ZY100的單株氮素積累量、地上部分的氮素積累量和碳素的積累量及其分配比例均出現(xiàn)顯著降低，在T1條件下，NC89的氮素和碳素積累量、地上部分的氮素積累量和碳素積累量均顯著高于ZY100。地下部分根系中的碳、氮元素分配比例則表現(xiàn)為隨著氮素水平降低而升高，但在低氮素水平下NC89 地下部分根系中的碳素分配比例高于ZY100。說(shuō)明在低氮脅迫下，植株向地上部分轉(zhuǎn)移氮素和向地下部分轉(zhuǎn)移碳物質(zhì)的能力受到了影響，但轉(zhuǎn)移碳、氮元素的能力受到煙草品種的影響。與T1條件下相比，NC89地下部分的碳、氮元素分配比例在T2條件下分別升高12.33%、14.51%，而ZY100地下部分的碳、氮元素分配比例在T2條件下則分別升高8.49%、6.65%，說(shuō)明NC89在應(yīng)對(duì)低氮脅迫時(shí)具出更優(yōu)異的物質(zhì)調(diào)配能力。

3 討論

3.1 不同煙草品種的氮素吸收能力差異

本研究發(fā)現(xiàn)，在吸收NO-3 的過(guò)程中發(fā)揮重要作用的NtNRT1/2 家族基因，其表達(dá)情況受基因型和氮素條件的影響，NtNRT1.2 在ZY100根系中的表達(dá)量顯著高于NC89，而NtNRT2.3 在ZY100 根系中的表達(dá)量顯著低于NC89。梁太波等[16]從氮素吸收效率方面將NC89 歸為低氮高效型，將ZY100歸類(lèi)為雙低效型，NtNRT1/2 在2個(gè)品種根系中的差異表達(dá)可能與二者氮素吸收效率差異有關(guān)。與氮高效型NC89相比，ZY100屬于氮低效品種，其地上部分的氮素同化能力與氮素轉(zhuǎn)運(yùn)再利用能力弱于NC89，這與周健飛等[17]研究結(jié)果相似。根據(jù)“源庫(kù)流”理論，根系是煙草吸收輸出氮素的最大“源”，葉片組織是最大的代謝“庫(kù)”。由于ZY100地上部分的代謝“源”對(duì)氮素的同化利用能力低，在“源”與“庫(kù)”相互作用的過(guò)程中，ZY100地下部分的“庫(kù)”在低氮條件下需要增強(qiáng)對(duì)氮素的吸收能力，導(dǎo)致ZY100在同等氮素條件下尤其是低氮條件下，需要比NC89表達(dá)更多的硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因NtNRT1/2，以增強(qiáng)其對(duì)NO-3 的吸收能力。但由于ZY100根系中NtNRT2.3 表達(dá)量遠(yuǎn)低于NC89，向地上部分轉(zhuǎn)移NO-3 的能力低，根系活力弱[16]，故ZY100 對(duì)氮素的吸收效率相對(duì)低于NC89，導(dǎo)致ZY100 植物組織中的NO-3 含量低于NC89。Orsel等[18]發(fā)現(xiàn)，AtNRT2.1 缺失突變可以使硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)能力減少75%，導(dǎo)致葉片中的NO-3 含量降低。OsNRT2.3 基因在NO-3 的攝取和從地下向地上的長(zhǎng)距離運(yùn)輸過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[19-21]。由于NC89 根系中NtNRT2.1 和NtNRT2.3 表達(dá)量在高氮條件下顯著高于ZY100，將氮素從“庫(kù)”轉(zhuǎn)移至“源”的能力強(qiáng)，加上“源”的氮代謝旺盛，因此從煙葉碳氮代謝平衡、內(nèi)在化學(xué)成分協(xié)調(diào)方面考慮，相比于ZY100，NC89適合種植在低氮素土壤中，這也與實(shí)際生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)相符。

低氮脅迫時(shí)，NC89和ZY100根系中的NRT1/2基因表達(dá)情況基本一致。為了應(yīng)對(duì)缺氮脅迫，此時(shí)雙親和力硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因NtNRT1.1、高親和力硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因NtNRT2.3 開(kāi)始大量表達(dá)，在氮素吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)中開(kāi)始發(fā)揮主要作用，以增強(qiáng)煙株對(duì)低氮環(huán)境的適應(yīng)能力。而低親和力硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因NtNRT1.2 主要在氮素水平高于1 mmol·L?1時(shí)發(fā)揮作用，因此在T2條件下的基因表達(dá)水平極顯著降低。此外，在T2條件時(shí)，2個(gè)試驗(yàn)品種根系中的NtNRT2.1 基因要么下調(diào)表達(dá)，要么與T1時(shí)的表達(dá)水平持平，該結(jié)果與Liu等[9]的結(jié)果相似，但與一般認(rèn)為NtNRT2.1 基因?qū)儆诟哂H和力硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，在低氮素條件下應(yīng)高表達(dá)的認(rèn)識(shí)有所不同，這可能與NRT1.1 影響NRT2.1 和NAR2.1 的表達(dá)，而且NRT2.1 又受到NAR2.1 的調(diào)控表達(dá)有關(guān)[22]，因此還需進(jìn)一步研究NtNRT2.1 基因在不同煙草品種和氮素條件下的表達(dá)機(jī)制。

NRT 基因除了參與NO-3 的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)外，還直接或間接參與根系生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，影響根系主根、側(cè)根與根毛的發(fā)育，在這個(gè)過(guò)程中受到外源NO-3水平的調(diào)節(jié)[3]，即外界NO-3 通過(guò)調(diào)節(jié)NRT 基因來(lái)影響植物根系形態(tài)結(jié)構(gòu)[24-27]。本研究發(fā)現(xiàn)，煙草品種間根系形態(tài)指標(biāo)的優(yōu)劣與組織中的NO-3 含量存在密切聯(lián)系，這與汪曉麗等[28]、劉巧真等[29]的研究結(jié)果一致，說(shuō)明在外界氮素調(diào)節(jié)下，不同氮效率煙草品種間NRT1/2 基因的差異表達(dá)導(dǎo)致根系構(gòu)型產(chǎn)生差異。NtNRT1/2 基因在2個(gè)品種根系中的差異表達(dá)是造成煙草品種NC89和ZY100氮素吸收能力和氮效率差異的重要原因之一。

3.2 不同煙草品種的氮素同化能力差異

本研究發(fā)現(xiàn)，NC89與ZY100葉片中的氮代謝基因表達(dá)存在顯著差異。無(wú)論是在高氮還是低氮條件下，NC89的NtNIA1、NtNIA2、NtGS1 的基因表達(dá)均顯著高于ZY100，這與周健飛等[56]的研究結(jié)果一致，表明NtNIA1、NtNIA2、NtGS1 基因的表達(dá)水平可以反映煙草品種的氮代謝特征，與品種的氮效率類(lèi)型密切相關(guān)。此外，NtNIA1、NtNIA2、NtGS1、NtGS2 基因表達(dá)量與NR和GS活性具有同增同減的趨勢(shì)，與周健飛等[5]發(fā)現(xiàn)NR 基因和GS基因的表達(dá)豐度與NR和GS活性呈正相關(guān)的結(jié)果基本一致。

當(dāng)受到氮素脅迫，煙葉中的NtNIA1、NtNIA2、NtGS2 的基因表達(dá)水平顯著降低，這與煙葉中的NO-3 含量降低有關(guān)。氮代謝關(guān)鍵基因NIA 與GS 的表達(dá)受到NO-3 離子的誘導(dǎo)[30]，在低氮脅迫下，根系從外界吸收的氮素減少，葉片中的氮代謝關(guān)鍵基因表達(dá)水平降低，因而導(dǎo)致轉(zhuǎn)運(yùn)至地上組織中的氮素大幅減少。隨著氮素水平降低，NC89 和ZY100 的NR 和GS 活性降低，該結(jié)果也說(shuō)明了NIA 和GS 基因表達(dá)水平與NR 和GS活性呈正相關(guān)[5]。但由于NC89獲得來(lái)自地下部分供給的氮素多，氮代謝基因表達(dá)量和NR、GS酶活性高，因此NC89煙株能夠比ZY100固定更多的氮素，擁有更強(qiáng)的耐低氮能力。

值得注意的是，在T2 條件下，NC89 葉片中NtGS1 基因表達(dá)量大幅上升，ZY100中NtGS1 基因表達(dá)量卻大幅下降，NtGS1 在2個(gè)煙草品間的表達(dá)趨勢(shì)表現(xiàn)相反，這可能與煙草品種自身的氮代謝特性不同有關(guān)。當(dāng)處于低氮脅迫環(huán)境時(shí)，葉片衰老速度加快，為了發(fā)育新生組織，衰老葉片會(huì)更加頻繁地向頂部幼嫩葉片轉(zhuǎn)移氮素，在氮素再轉(zhuǎn)移過(guò)程中NtGS1 基因發(fā)揮主要作用。相比于ZY100，NC89葉片中NtGS1 基因表達(dá)量在低氮條件下增多，GS活性高，因此NC89可以更高效地利用氮素，避免氮素以氨氣的形式通過(guò)氣孔被無(wú)謂地?fù)]發(fā)掉[3132]，這也是NC89 耐低氮能力強(qiáng)、氮效率高的原因。

3.3 不同烤煙品種低氮脅迫的適應(yīng)性差異

當(dāng)外界生長(zhǎng)條件不適宜時(shí)，植物通常需要改變自身性狀以適應(yīng)惡劣的外部環(huán)境。本研究發(fā)現(xiàn)，在低氮條件下，植物從外界吸收的氮素減少，合成的葉綠素和可溶性蛋白下降，導(dǎo)致煙株地上部分的干物質(zhì)積累量減少。為了適應(yīng)低氮環(huán)境，煙株改變體內(nèi)碳氮物質(zhì)分配比例，將更多的碳氮物質(zhì)分配至根系中，同時(shí)氮素同化中心由地上部分移至地下部分的根系中，更多的氮素在地下根系中同化，用以?xún)?yōu)先維持根系生長(zhǎng)發(fā)育[33]，這導(dǎo)致NC89和ZY100的根冠比極顯著增加。增加根冠比有利于吸收氮素，這是植物適應(yīng)低氮環(huán)境的一種適應(yīng)性手段[34]。但NC89在低氮條件下的根冠比極顯著大于ZY100，說(shuō)明NC89對(duì)低氮環(huán)境的適應(yīng)能力強(qiáng)于ZY100。

碳氮代謝是煙草生長(zhǎng)發(fā)育最基本的生理代謝過(guò)程，包括碳代謝和氮代謝2個(gè)方面[35]。碳氮比可以反映當(dāng)前植株體內(nèi)碳氮代謝的相對(duì)強(qiáng)弱，反映植物對(duì)逆境的適應(yīng)能力[36]。本研究發(fā)現(xiàn)，在高低氮條件下，NC89 地上部分的碳氮比值都小于ZY100，說(shuō)明NC89地上組織中的蛋白質(zhì)合成居于優(yōu)勢(shì)，其代謝類(lèi)型主要是氮素代謝，而且氮代謝強(qiáng)度相對(duì)強(qiáng)于ZY100，體現(xiàn)了NC89在低氮條件下仍能維持較強(qiáng)的氮素同化能力的特點(diǎn)。低氮脅迫時(shí)，NC89和ZY100地上部分的碳氮比極顯著大于高氮條件，這與低氮條件下地上部分氮素積累量的下降幅度遠(yuǎn)大于地上部分有關(guān)，說(shuō)明當(dāng)?shù)毓?yīng)被限制時(shí)，氮素水平對(duì)碳氮比的影響主要由氮含量差異引起，這與楊鐵釗等[37]的研究結(jié)果一致。同時(shí)，碳氮比的顯著增加也表明植物的抗逆能力增強(qiáng)。對(duì)地下部分的碳氮比分析發(fā)現(xiàn)，NC89在高氮條件下的碳氮比顯著低于ZY100，在低氮條件下的碳氮比顯著高于ZY100，表明在低氮脅迫下，與ZY100相比NC89可以向地下根系分配更多的碳物質(zhì)以發(fā)育出更發(fā)達(dá)的根系，可以更快速地適應(yīng)低氮環(huán)境，具體表現(xiàn)在NC89的總根長(zhǎng)、根系體積、根系總表面積等根系形態(tài)指標(biāo)都優(yōu)于氮低效品種ZY100，這一結(jié)果也與楊鐵釗等[37]的結(jié)果一致，這也是NC89在低氮條件下比ZY100更耐低氮的原因之一。

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