張 菁，姜建國，高燕霞

（河北省藥品檢驗所，河北 石家莊 050011）

呋芐西林鈉為氨基青霉素的脲基衍生物，是廣譜半合成青霉素，主要用于綠膿桿菌感染。目前，其原料藥及制劑質(zhì)量標準中含量測定方法為剩余酸堿滴定法[1]，但操作煩瑣，專屬性差，影響因素多，而且一些無生物活性物質(zhì)也參與反應，不能真實反映其抑菌活性。筆者采用高效液相色譜（HPLC）法[2]測定呋芐西林鈉的有關物質(zhì)，并對其抗菌活性進行研究，旨在為改進生產(chǎn)工藝和提高產(chǎn)品質(zhì)量提供依據(jù)。

1 儀器與材料

Agilent 1100型色譜系統(tǒng)；CZB-1抗生素比濁法測定儀；玻璃培養(yǎng)杯（厚度 1 cm）。金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26 003]由中國藥品生物制品檢定所提供；呋芐西林鈉標準品（批號為070301，含量902 U/mg，本所標定）；呋芐西林鈉原料（批號分別為 060104，20060105，20070106，國內(nèi)藥廠提供）；抗生素檢定用培養(yǎng)基Ⅲ號（pH=7.9±0.1，中國藥品生物制品檢定所提供）；滅菌生理鹽水和磷酸鹽緩沖液（pH=6.0）均按2005年版《中國藥典（二部）》附錄[3]配制；磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸為國產(chǎn)分析純；乙腈為色譜純。

2 方法與結(jié)果

2.1 濁度法的建立與評價

菌液配制：取金黃色葡萄球菌新鮮斜面培養(yǎng)物，接種于營養(yǎng)瓊脂斜面上，置35～37℃培養(yǎng)18～23 h，用滅菌生理鹽水洗下菌苔，加生理鹽水稀釋，使之在580 nm波長處的吸光度約為1.0。取菌液2～3.3mL，加至培養(yǎng)基100 mL中，搖勻。

溶液配制：取呋芐西林鈉標準品適量，精密稱定，用適量水溶解并稀釋成1 000 μg/mL的溶液，作為標準品貯備液；精密量取貯備液適量，用磷酸鹽緩沖液（pH=6.0）稀釋至試驗質(zhì)量濃度，作為標準品溶液。取呋芐西林鈉，精密稱取適量，用適量水溶解并稀釋成1 000 μg/mL的溶液，作為供試品貯備液；精密量取貯備液適量，用磷酸鹽緩沖液（pH=6.0）稀釋至試驗質(zhì)量濃度，作為供試品溶液。

培養(yǎng)與測定：取標準品溶液1.0 mL，置滅菌培養(yǎng)管中，再加試驗菌液9.0 mL，置抗生素比濁法測定儀內(nèi)，于（37±1）℃下培養(yǎng)；另取稀釋溶劑1.0 mL，加至9.0 mL空白培養(yǎng)基中，混勻，作為空白對照。于530 nm波長處測定各管金黃色葡萄球菌對數(shù)生長期內(nèi)不同培養(yǎng)時間的吸光度值（A）。根據(jù)量反應平行線原理計算供試品的效價值。

試驗菌、培養(yǎng)基選擇：呋芐西林鈉為廣譜半合成青霉素，對大多數(shù)革蘭陽性菌與部分革蘭陰性菌有殺滅作用，因此選擇金黃色葡萄球菌和大腸桿菌作為試驗菌；在Ⅲ號液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，加菌量分別為1%，2%，3%；抗生素質(zhì)量濃度為0.1～1.0 μg/mL。繪制菌株在不同加菌量及不同抗生素濃度的生長曲線。根據(jù)菌生長曲線及在不同抗生素濃度下菌液吸光度值的變化，發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌在Ⅲ號液體培養(yǎng)基中生長對不同質(zhì)量濃度的抗生素敏感，抗生素的線性質(zhì)量濃度范圍寬。以大腸桿菌為試驗菌時，各抗生素質(zhì)量濃度不呈線性，故選擇金黃色葡萄球菌作為試驗菌。

測定時間選擇：對不同加菌量（2% ～3%）及菌的不同傳代次數(shù)進行比較，以不同抗生素質(zhì)量濃度下的吸光度 A為縱坐標、培養(yǎng)時間 t為橫坐標繪制菌生長曲線（圖1）?？梢?，不同抗生素質(zhì)量濃度下的金黃色葡萄球菌培養(yǎng)約2 h進入對數(shù)生長期；比較不同抗生素質(zhì)量濃度下的菌液 A-t生長曲線發(fā)現(xiàn)，傳代次數(shù)不同及加菌量不同的菌平穩(wěn)生長時間均在4～6 h，因此選擇測定時間4～6 h。比較4～6 h不同時間點的 A-lgC曲線（圖2），發(fā)現(xiàn)菌液的吸光度值A在0.4～0.8時便于測定，據(jù)此可確定抗生素質(zhì)量濃度的測定范圍。

圖1 不同抗生素質(zhì)量濃度下1.5%的金黃色葡萄球菌在新制培養(yǎng)基中的 A-t生長曲線

圖2 2%金黃色葡萄球菌在培養(yǎng)基中不同培養(yǎng)時間的 A-lg C曲線

一劑量法（標準曲線法）：精密量取質(zhì)量濃度為1 000 μg/mL的標準品溶液，用磷酸鹽緩沖液（pH=6.0）稀釋成 0.1，0.2，0.4，0.8，1.0 μg/mL 的標準曲線溶液；用磷酸鹽緩沖液（pH=6.0）將供試品溶液稀釋至約4.0 μg/mL，按上述測定方法測定。計算標準曲線，并計算供試品的效價，當連續(xù)5點供試品的效價值誤差（RSD）小于2%時終止試驗?？股刭|(zhì)量濃度在0.1～1.0 μg/mL范圍內(nèi)與吸光度值A線性關系良好，線性回歸方程為 A=384.448 C+588.816，r=0.999 8（n=5）。

二劑量法：根據(jù)一劑量法試驗結(jié)果，選擇0.4μg/mL和0.8μg/mL為二劑量法測定質(zhì)量濃度；用磷酸鹽緩沖液（pH=6.0）分別稀釋標準品與供試品溶液；按2005年版《中國藥典（二部）》附錄ⅩⅣ中的2.2法計算供試品的效價；當連續(xù)5點供試品的效價值誤差（RSD）小于2%時終止試驗。

回收率試驗：精密稱取已知含量的樣品與呋芐西林鈉標準品適量，配制成含呋芐西林80%，100%，120%的溶液，分別按一劑量法、二劑量法試驗，計算回收率。結(jié)果見表1。

表1 回收率試驗結(jié)果（n=9）

精密度及重現(xiàn)性試驗：取同一供試品溶液在1d內(nèi)連續(xù)測定2次，日內(nèi)精密度 RSD為0.72%（n=2）；取同一供試品溶液連續(xù)測定5 d，每日1次，日間精密度 RSD為1.13%（n=5）。

2.2 HPLC法

色譜條件：以C18柱為試驗用柱。參考本類物質(zhì)的HPLC法，在確保所有雜質(zhì)峰與主峰完全分離的情況下，采用線性梯度洗脫（見表2）。流動相A為磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L磷酸二氫鉀溶液，用磷酸調(diào)pH至3.5）-乙腈（80∶20），流動相 B 為磷酸鹽緩沖液 -乙腈（75∶25），流速為1.0 mL/min。

測定法：取本品適量，用水溶解并稀釋成4.0 mg/mL的溶液，作為供試品溶液；精密量取1.0 mL，置100 mL量瓶中，加水至刻度，作為對照品溶液。取供試品溶液和對照品溶液各20μL，分別注入色譜儀，記錄色譜圖（圖3）。結(jié)果見表3。

2.3 樣品測定

分別采用HPLC法、容量法和濁度法對3批呋芐西林鈉原料的含量和有關物質(zhì)進行測定。結(jié)果見表3。

表2 流動相梯度洗脫表

圖3 呋芐西林鈉有關物質(zhì)色譜圖

表3 呋芐西林鈉有關物質(zhì)、含量測定結(jié)果

3 討論

從圖3可見，不同批號原料的有關物質(zhì)存在很大差異。其中批號為060104的樣品呈單個主色譜峰；而批號為20060105和20070106的樣品呈2個較大色譜峰，最大雜質(zhì)峰（B）與主峰面積的比值高達0.73，說明不同批次間質(zhì)量存在較大差異。從表3可知，3種方法測定結(jié)果存在很大差異。濁度法測定結(jié)果顯示呈單個主色譜峰的生物活性較高，呈2個較大色譜峰的生物活性較低。

呋芐西林分子中有β-內(nèi)酰胺結(jié)構(gòu)，不穩(wěn)定，在偏酸或偏堿條件下會發(fā)生水解。剩余酸堿滴定法就是利用這一原理，但不能真實反映抑菌活性。采用濁度法測定效價可克服此不足，能正確反映樣品的生物活性。

[1]WS1-C2-0021-89，衛(wèi)生部藥品標準抗生素藥品（第一冊）[S].

[2]張 菁，王金龍，姜建國.高效液相色譜法測定呋布西林鈉的含量及有關物質(zhì)[J]. 中國藥業(yè)，2008，17（16）：29-30.

[3]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（二部）[M].北京：化學工業(yè)出版社，2005：附錄Ⅺ A.