常銀子，楊亦文，任其龍，張子安

1(浙江農(nóng)林大學(xué)農(nóng)學(xué)院，浙江臨安，311300)2(浙江大學(xué)材料與化工學(xué)院，浙江杭州，310027)

硅膠柱層析分離純化TPGS的工藝*

常銀子1，楊亦文2，任其龍2，張子安1

1(浙江農(nóng)林大學(xué)農(nóng)學(xué)院，浙江臨安，311300)2(浙江大學(xué)材料與化工學(xué)院，浙江杭州，310027)

采用硅膠層析法對(duì)自制的聚乙二醇1 000 VE琥珀酸酯(TPGS)進(jìn)行分離純化，考察了柱溫、上樣量、上樣濃度和流量等因素對(duì)TPGS分離效果的影響，優(yōu)選出TPGS分離的工藝條件，并對(duì)其進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果表明:隨著柱溫、上樣量或流量的增加，TPGS分離純度和回收率均表現(xiàn)為“先增后降”趨勢(shì);TPGS分離適宜工藝條件為40℃柱溫、4 g上樣量、0.3 g/mL上樣濃度和3mL/min流量，在此條件下，TPGS分離的平均純度和回收率可達(dá)93.13%和97.72%。

TPGS，水溶性VE，分離，硅膠柱

聚乙二醇1 000VE琥珀酸酯(TPGS)是由VE琥珀酸酯(VES)與聚乙二醇 (PEG)1 000酯化反應(yīng)生成的一種VE水溶性衍生物，結(jié)構(gòu)上含有VE親脂基團(tuán)和聚乙二醇長(zhǎng)鏈的親水基團(tuán)，親水親油平衡值(HLB)約為13～17，具備表面活性劑的性質(zhì)和良好的水溶性［1］。TPGS為淡黃色的蠟狀固體，近乎無(wú)味，熔點(diǎn)約39℃，能穩(wěn)定存在于高溫(200℃以下)和空氣環(huán)境中［2］。鑒于TPGS的兩性特性(親水性與親脂性)、良好的水溶性以及熱穩(wěn)定性等理化性質(zhì)，該物質(zhì)可作為增溶劑、乳化劑、吸收增強(qiáng)劑、可塑劑以及脂溶性藥物載體等的理想材料。目前，TPGS在國(guó)外已被廣泛應(yīng)用于制藥和營(yíng)養(yǎng)品添加劑等領(lǐng)域［3］，但國(guó)內(nèi)對(duì)TPGS的研究甚少，主要集中于TPGS的制備和性能方面［4］。作者前期研究發(fā)現(xiàn)［5］，TPGS 合成產(chǎn)物中存在一定量的VES，而VES和TPGS在極性上有很大差別，有必要對(duì)TPGS進(jìn)行精制。本文采用硅膠柱層析法對(duì)自制的TPGS進(jìn)行分離純化，考察其影響因素，進(jìn)而運(yùn)用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法優(yōu)化出層析分離TPGS的最佳工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

TPGS，實(shí)驗(yàn)室自制;TPGS標(biāo)準(zhǔn)品(含量99%)，美國(guó)Eastman公司;硅膠(粗孔硅膠Ⅱ號(hào))100目，青島海洋化工廠;乙酸乙酯、石油醚、氯仿、甲醇、無(wú)水乙醇:均為分析純，中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司;常壓帶夾套層析柱(玻璃，φ20 mm×500 mm);RE52－99型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠;BS400S型電光分析天平，北京賽多利斯天平有限公司;DZF-6050型真空干燥箱:上海一恒科技有限公司;SC－15型數(shù)控超級(jí)恒溫箱，寧波天恒儀器廠;LC-10AT型高效液相色譜儀，717型Plus型自動(dòng)進(jìn)樣器，1525型泵，2487雙波長(zhǎng)吸收檢測(cè)器(均為Waters公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 預(yù)試驗(yàn)

通過(guò)梯度洗脫后，發(fā)現(xiàn)硅膠柱可以對(duì)TPGS實(shí)現(xiàn)提純，采用純?nèi)燃淄闀r(shí)，無(wú)法洗脫吸附在硅膠上的TPGS，溶劑V(石油醚)∶V(三氯甲烷)=9∶2洗脫出來(lái)的基本上是前面合成反應(yīng)后過(guò)量的PEG，而用V(石油醚)∶V(三氯甲烷)∶V(乙酸乙酯)=6∶2∶1 混合溶劑剛洗脫出來(lái)的產(chǎn)品，通過(guò)HPLC分析檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在292 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)有2個(gè)峰，可能是VES琥珀酸單酯(VES)和聚乙二1 000VE琥珀酸雙酯，同時(shí)出現(xiàn)3個(gè)峰可能是VS、TPGS雙酯和TPGS單酯，并且VES的峰面積逐漸變小。后面出現(xiàn)1個(gè)峰可能是TPGS雙酯和單酯，只有1個(gè)峰的可能是TPGS單酯。由于目前尚未對(duì)TPGS雙酯和單酯進(jìn)行研究，實(shí)驗(yàn)中未把TPGS單酯和雙酯分離出，因此在之后的實(shí)驗(yàn)分析中均以TPGS單酯和雙酯混合物的純度和回收率作為指標(biāo)，而以TPGS單酯和雙酯混合物作為產(chǎn)品。

1.2.2 單因素影響試驗(yàn)程序

試驗(yàn)選取純度和回收率作為T(mén)PGS分離純化效果的衡量指標(biāo)，依次考察柱溫、上樣量、上樣濃度和流量等分離條件對(duì)TPGS分離效果的影響［6－7］。

(1)裝柱:稱取50 g左右硅膠，150℃下活化2 h，濕法裝柱。

(2)上樣:取1～5.5 g已制備好的TPGS，用甲醇溶解，濃度控制在0.1～0.4 g/mL。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 預(yù)試驗(yàn)結(jié)果

(3)硅膠柱層析:以石油醚-三氯甲烷-乙酸乙酯梯度洗脫，先后用 V(石油醚)∶V(三氯甲烷)=9∶2、V(石油醚)∶V(三氯甲烷)∶V(乙酸乙酯)=6∶2∶1、V(三氯甲烷)∶V(乙酸乙酯)=7∶2依次以2～5mL/min的流量進(jìn)行洗脫。每組梯度分別為550、600和450mL，直至無(wú)TPGS流出時(shí)停止。

(4)流分收集:每份50mL，旋蒸法蒸干，稱重，取樣，定容。V(石油醚)∶V(三氯甲烷)=9∶2、V(石油醚)∶V(三氯甲烷)∶V(乙酸乙酯)=6∶2∶1 處流分收集作為產(chǎn)品，并依次標(biāo)號(hào)。

(5)含量檢測(cè):采用高效液相色譜法，雙波段檢測(cè)。分析方法按TPGS的合成工藝中檢測(cè)方法進(jìn)行［7］。

(6)計(jì)算純度和收率:根據(jù)HPLC分析結(jié)果，以標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度為橫坐標(biāo)，峰面積坐標(biāo)，得到一直線，擬和得到擬和的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，得到回歸方程y=3×106－684 072，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 4。將待測(cè)產(chǎn)物的峰面積值相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程內(nèi)，得出相應(yīng)產(chǎn)物濃度［8～9］。

TPGS的純度(x)/%=n×100/m

TPGS的收率(y)/%=n* ×100/n

其中:m為1 050mL流分旋蒸蒸干后的質(zhì)量，g;n為原料中PEG的量，g;n*為分離后TPGS的量，g。

1.2.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取對(duì)TPGS分離效果影響較大的因素進(jìn)行多因素正交試驗(yàn)(表1)。

表1 正交試驗(yàn)所考察因素及其水平

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 柱溫對(duì)分離效果的影響

柱溫考察范圍為20～50℃。具體反應(yīng)條件為:上樣量4 g，上樣濃度為0.3 g/mL，流量3mL/min。柱溫對(duì)于分離的影響結(jié)果如圖3和表2所示。

圖3 不同柱溫的洗脫曲線

表2 柱溫對(duì)純度和回收率影響

由表2可以看出，柱溫對(duì)TPGS分離效果影響較大，當(dāng)柱溫由20℃升至40℃，純度和回收率均呈現(xiàn)增加趨勢(shì)。但進(jìn)一步升高溫度至50℃，2個(gè)標(biāo)值明顯下降。圖3和表2均表明，在40℃柱溫條件下可分離出最大量的TPGS，且對(duì)TPGS單酯和雙酯分離效果最佳，此時(shí)純度和回收率分別高達(dá)92.97%和95.62%。因此以下試驗(yàn)采用40℃柱溫進(jìn)行TPGS分離。

2.1.2 上樣量對(duì)分離效果影響

控制40℃柱溫、3mL/min流量和0.3 g/mL的上樣濃度，考察上樣量在1～5.5 g內(nèi)對(duì)TPGS分離效果的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4和表3。

表3 上樣量對(duì)TPGS的影響

從表3可以看出，上樣量對(duì)TPGS的分離也有較大影響，隨上樣量的增加，回收率也表現(xiàn)為“先增后降”的趨勢(shì)。上樣量為4.0 g時(shí)，回收率達(dá)到最大值(96.74%)。而純度在上樣量較小時(shí)變化不大，均在90% 以上，但當(dāng)上樣量增至5.5 g，純度下降明顯。圖4也同樣反映出高上樣量條件下TPGS的分離效果欠佳。原因可能是上樣量過(guò)高，超過(guò)了硅膠柱所能達(dá)到的吸附量，因而反應(yīng)后期難以分離出雜質(zhì)，導(dǎo)致TPGS洗脫效果下降。以下試驗(yàn)上樣量控制在4 g。

圖4 不同上樣量的洗脫曲線

2.1.3 上樣濃度對(duì)分離效果的影響

上樣濃度可能會(huì)影響到硅膠柱的吸附效果，由此對(duì)分離效果產(chǎn)生一定影響。本試驗(yàn)考察了上樣濃度于0.1～0.4 g/mL內(nèi)變化對(duì)分離效果的影響。試驗(yàn)在柱溫為30℃、上樣量為4 g、流量為3mL/min的條件下進(jìn)行，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖5和表4。

圖5 不同上樣濃度的洗脫曲線

表4 上樣濃度對(duì)TPGS的影響

從圖5和表4可以看出，上樣濃度較低時(shí)(0.1～0.3 g/mL)，TPGS純度較高且穩(wěn)定。但上樣濃度增至0.4 g/mL時(shí)，TPGS純度急劇下降?；厥章适苌蠘訚舛鹊挠绊懴鄬?duì)小，當(dāng)上樣濃度為0.3 g/mL時(shí)，TPGS回收率最大，達(dá)到93.18%。以下試驗(yàn)選擇0.3 g/mL上樣濃度。

2.1.4 流量對(duì)分離效果的影響

試驗(yàn)控制柱溫為30℃，上樣量為4 g，上樣濃度為0.3 g/mL。調(diào)節(jié)流量由2mL/min梯度遞增至5mL/min，考察流量對(duì)分離效果的影響，結(jié)果見(jiàn)圖6和表5。從圖6和表5看出，隨著流量的增加，TPGS分離純度及其回收率為先增后降。流量增大TPGS的各項(xiàng)指標(biāo)都會(huì)減少，當(dāng)流量在4mL/min時(shí)，產(chǎn)品量為3.139 2 g，同時(shí)純度為90.59%，比低流量的TPGS量要低，之后純度、回收率都降到最低點(diǎn)。產(chǎn)生這種結(jié)果的原因可能是由于當(dāng)流量過(guò)大時(shí)，TPGS與硅膠的接觸時(shí)間要短，在這種情況下TPGS在硅膠柱上可能無(wú)法達(dá)到吸附平衡，導(dǎo)致TPGS伴隨洗脫劑的流出而流出，因此達(dá)不到分離的效果。但流量太少會(huì)導(dǎo)致分離過(guò)程太過(guò)漫長(zhǎng)，耗費(fèi)大量的人力物力，因此本實(shí)驗(yàn)的流量選擇3mL/min。

圖6 不同流量的洗脫曲線

表5 流量對(duì)TPGS總的影響

2.2 分離條件的優(yōu)化

單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，柱溫、上樣量、上樣濃度和流量對(duì)TPGS的分離效果均產(chǎn)生一定影響。為優(yōu)化出硅膠柱層析分離TPGS的理想工藝條件，并區(qū)分出主次影響因素，本研究在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，借助不完全多因素試驗(yàn)方法與理論，安排了4因素3水平的正交試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖7與表6。

對(duì)比表6中純度和回收率數(shù)值可知，2號(hào)(A1B2C2D2)和8號(hào)(A3B2C2D3)分離效果相對(duì)較好。而圖7顯示出在不同分離條件下的TPGS分理效果差異比較顯著，其中 2號(hào)(A1B2C2D2)和 5號(hào)(A2B2C3D1)分離效果具有明顯優(yōu)勢(shì)。

表6中k值為各因素在相應(yīng)水平下的試驗(yàn)結(jié)果之和與水平數(shù)的比值，其值排除了其他因素的干擾，可反映該因素的水平效應(yīng)。比較表6中k值大小可以看出，若以純度為考察指標(biāo)，因素A(柱溫)對(duì)應(yīng)的k2與k3值相差很小，因而可取 A2－3B2C2D2為最大程度提高TPGS純度的理想工藝條件組合;而若以回收率為考察指標(biāo)，考慮到因素A對(duì)應(yīng)的各k值無(wú)明顯差別，而因素C(上樣濃度)對(duì)應(yīng)的k1與k2值相差甚微，故認(rèn)為A1-2-3B3C1-2D2組合為回收TPGS的較佳工藝條件。

圖7 不同分離條件組合的TPGS洗脫曲線

表6 TPGS分離正交試驗(yàn)結(jié)果

R值可反映出相應(yīng)因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響的顯著性。由表6可看出，各因素對(duì)純度指標(biāo)的影響主次順序?yàn)锽＞C＞A＞D，對(duì)回收率指標(biāo)的影響主次順序?yàn)镃＞B＞D＞A。

綜合考慮上述分析結(jié)果，衡權(quán)純度和回收率兩項(xiàng)指標(biāo)，并結(jié)合實(shí)際物耗與能耗等因素，可取A2B2C2D2組合(柱溫30℃、上樣量4 g、上樣濃度0.3 g以及流量3mL/min)為硅膠柱層析分離TPGS最佳工藝條件。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

按上述正交試驗(yàn)最佳水平組合進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，考察優(yōu)化結(jié)果的穩(wěn)定性與重現(xiàn)性，結(jié)果見(jiàn)表7所示。由表7可知，該最優(yōu)分離條件下，TPGS平均純度和回收率分別達(dá)到97.72%和93.13%。3次試驗(yàn)結(jié)果差異較小，說(shuō)明該工藝條件組合穩(wěn)定可靠。

表7 合成條件的驗(yàn)證結(jié)果

3 結(jié)論與展望

(1)單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，各考察因素對(duì)分離效果均產(chǎn)生不同程度地影響。試驗(yàn)條件下，隨著柱溫、上樣量或流量的增加，TPGS分離純度及其回收率均表現(xiàn)為“先增后降”的趨勢(shì)，表明TPGS分離過(guò)程中該三因素存在著最佳值。上樣濃度對(duì)兩項(xiàng)考察指標(biāo)影響規(guī)律各異。

(2)正交化化試驗(yàn)結(jié)果表明，硅膠柱層析分離TPGS的最佳工藝條件為:柱溫30℃，上樣量4 g，上樣濃度0.3 g和流量3mL/min。各因素對(duì)純度指標(biāo)的影響主次順序?yàn)?上樣量 ＞上樣濃度 ＞柱溫 ＞流量，對(duì)回收率指標(biāo)的影響主次順序?yàn)?上樣濃度 ＞上樣量 ＞流量 ＞柱溫。

(3)驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明，硅膠層析法分離純化TPGS具有較好的穩(wěn)定性與重現(xiàn)性。在最佳工藝條件下，TPGS平均純度和回收率分別可達(dá)93.13%和97.72%。

預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TPGS的產(chǎn)品非單一物質(zhì)，至少存在TPGS單酯和雙酯兩種成分，因此下一步擬開(kāi)展TPGS單酯和雙酯分離條件的影響規(guī)律及其優(yōu)化等方面的研究。

［1］于永新，俞紅凱，王中彥.聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯應(yīng)用進(jìn)展［J］.沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，23(6):407－412.

［2］伍林，王艷，魯亮，等.維生素E琥珀酸酯的研究［J］.食品科學(xué)，2005，26(9):320－322.

［3］許牡丹，湯木紅，王小燕.硅膠柱層析法分離純化甘露低聚糖［J］.食品工業(yè)技術(shù)，2008(9):188－190.

［4］Weber T，Lu M，Andera L，et al.Vitamin E succinate is a potent novel antineoplastic agent with high selectivity and cooperativity with tumor necrosis factor-related apoptosisinducing ligand(Apo2 ligand)in vivo［J］.Clinieal Cancer Researech，2002－8:863－869.

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［9］樊明濤，吳守一，馬海樂(lè).維生素E測(cè)定方法的研究進(jìn)展［J］.江蘇大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2002，23(1):54－57，74.

Separation and Purification of TPGS by Silica Gel Column Chromatography

Chang Yin-zi1，Yang Yi-Wen2，Ren Qi-long2，Zhang Zi-an1
1(College of and Food Food and Agriculture，Zhejiang Forestry University，Lin＇an 311300，China)2(College of Materials Science and Chem ical Engineering，Zhejiang University，Hangzhou 310027，China)

We purified the TPGS though Silica gel column chromatography.In order to improve separation conditions，chromatography temperature，load of sample，concentration of sample and flow rate factors were tested to see the influence to the separation.The optimal conditions of silica gel column chromatography were as follows:Chloroform，Petroleum ether and Acetic ether were used as mobile phases，the chromatography temperature is 40℃，the load of sample is 4g，the concentration of sample is 0.3g/mL，and the flow rate is 3ml/min.Finally the average purity is 93.13%，and the average yield is 97.72% .

TPGS，water-soluble vitamin E，separation，silica gel column chromatography

碩士，講師。

*2009年浙江省高等學(xué)校青年骨干教師國(guó)內(nèi)訪問(wèn)學(xué)者項(xiàng)目

2010－04－03，改回日期:2010－06－25