陳鵬，楊海艷，李慧婧，楊龍雨，李學(xué)俊

西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，楊凌 712100

重組蛋白質(zhì)表達(dá)技術(shù)的成熟與發(fā)展為研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能提供了高效的研究手段，同時(shí)重組表達(dá)技術(shù)為眾多蛋白質(zhì)與酶的大規(guī)模制備和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。但目前在重組蛋白特別是醫(yī)用重組蛋白純化過程中還面臨諸多問題，如菌體釋放的核酸會(huì)產(chǎn)生高粘度的裂解液進(jìn)而影響下游的操作和層析純化，同時(shí)過量的核酸將導(dǎo)致純化產(chǎn)品的核酸污染等。核酸的污染也會(huì)影響到純化過程蛋白的定量以及活性分析甚至影響蛋白的結(jié)晶。現(xiàn)今最常用的核酸去除方法利用了核酸帶負(fù)電荷的特征，在初步純化時(shí)利用如STREAMLINE SP、SP Sepharose Big Beads、SP或CM Sepharose FF、SP Sepharose XL等離子交換介質(zhì)除去大量核酸，也有研究利用疏水層析介質(zhì)去除核酸。但以上方法成本較高，需要昂貴的儀器設(shè)備，不適合純化前期大規(guī)模的核酸去除。酶催化的高效性使酶法去除核酸成為理想的途經(jīng)，已有通過加入核酸酶去除蛋白樣品中核酸的研究實(shí)例。如商業(yè)化產(chǎn)品 Benzonase endonuclease、DNase和RNase A等，其中Benzonase endonuclease來源于靈桿菌。靈桿菌核酸酶 (Serratia marcescens nuclease，smNU) 是一種分泌至胞外的非特異性磷酸二酯酶，其在金屬陽離子存在下可以高效切割任意形式的核酸 (DNA和RNA，雙鏈和單鏈)[1-5]，其催化效率是葡萄球菌核酸酶的4倍，牛胰DNase I的34倍。靈桿菌是一種條件致病菌，致使大規(guī)模培養(yǎng)菌液用于核酸酶的分離純化存在潛在的危險(xiǎn)，因此有必要探索該酶安全高效的重組表達(dá)體系。由于核酸酶的胞內(nèi)表達(dá)可能造成重組表達(dá)宿主細(xì)胞自身核酸的降解而產(chǎn)生宿主細(xì)胞的強(qiáng)毒性，因此已報(bào)道的 smNU重組表達(dá)均采用胞外分泌的方式，但表達(dá)效率較低，每升僅可生產(chǎn)1.23×104U的酶[6]。本研究在成功克隆了 smNU基因的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了smNU的胞內(nèi)原核表達(dá)載體，實(shí)現(xiàn)了該酶的胞內(nèi)高效表達(dá)，并用Amylose resin純化該酶得到了理想的純化效果，為今后smNU的分子改造以及應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與質(zhì)粒

經(jīng)鑒定的靈桿菌為本實(shí)驗(yàn)室保存，大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。pMAL-c4X載體為New England Biolabs公司產(chǎn)品，其分子大小為6 645 bp，編碼麥芽糖結(jié)合蛋白的片段大小為1 388 bp。

1.1.2 工具酶和主要試劑

實(shí)驗(yàn)用到的限制性核酸內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、蛋白分子質(zhì)量Marker均購自Fermentas公司。Pfu Turbo DNA聚合酶為 Stratagene公司產(chǎn)品。DNA Marker購自大連寶生物工程有限公司。其他常用生化及分子生物學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。Amylose resin為NEB公司產(chǎn)品。引物合成及測(cè)序由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司完成。

1.2 方法

1.2.1 靈桿菌核酸酶原核表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)smNU的基因序列設(shè)計(jì)并合成引物。上游引物 NU12-1: 5′-GCCGACACGCTCGAATCCAT C-3′，下游引物 NU12-2: 5′-AGTCGGATCC TCAG TTTTTGCAGCCCATCAACTCC-3′，下游引物引入BamHⅠ的酶切位點(diǎn) (下劃線所示)。以靈桿菌的基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為 (25 μL)：1×PCR緩沖液，2 mmol/L MgCl2，0.2 mmol/L dNTPs，75 ng靈桿菌基因組DNA，200 nmol/L上下游引物，1 U Pfu Turbo DNA聚合酶。PCR反應(yīng)參數(shù)為：95 ℃ 3 min；95 ℃ 20 s，61 ℃30 s，72 ℃ 1 min ，25個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min。 PCR產(chǎn)物采用 PCR產(chǎn)物回收試劑盒純化后進(jìn)行BamHⅠ酶切，質(zhì)粒 pMAL-c4X采用 XmnⅠ和BamHⅠ雙酶切，膠回收大片段后進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入E. coli BL21。經(jīng)菌落PCR驗(yàn)證為陽性的克隆，提取質(zhì)粒送北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司進(jìn)行測(cè)序鑒定。

1.2.2 序列分析

將測(cè)序所得的序列在 NCBI網(wǎng)站 (http://www. ncbi.nlm.nih.gov/blast)，采用 BLASTN軟件進(jìn)行相似性搜索，核酸序列同源性比較用ClustalX2程序進(jìn)行分析。

1.2.3 MBP-NU融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

將構(gòu)建正確的重組質(zhì)粒pMAL-c4X-NU轉(zhuǎn)入E. coli BL21，37 ℃培養(yǎng)7 h后，用于擴(kuò)大培養(yǎng)。

1) 誘導(dǎo)溫度和IPTG濃度對(duì)MBP-NU融合蛋白表達(dá)量的影響：將擴(kuò)大培養(yǎng)的菌液按1∶100接種于LB液體培養(yǎng)基中，分別置于24 ℃、28 ℃、37 ℃培養(yǎng)至菌濃度OD600值為1.0時(shí)，分別加入IPTG至終濃度為0.5、0.75、1.0 mmol/L，誘導(dǎo)培養(yǎng)3 h，收獲細(xì)菌培養(yǎng)物，SDS-PAGE分析表達(dá)情況，分離膠濃度為12.5%。

2) 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì) MBP-NU融合蛋白表達(dá)量的影響：將擴(kuò)大培養(yǎng)的菌液按1∶100接種于LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至菌濃度OD600值為1.0時(shí)，加入IPTG至終濃度為0.75 mmol/L，誘導(dǎo)時(shí)間分別為0.5、1.5、2.5和3.5 h，收獲細(xì)菌培養(yǎng)物，SDS-PAGE分析表達(dá)結(jié)果。

1.2.4 融合蛋白的純化

融合蛋白的純化參考NEB公司pMAL試劑盒說明進(jìn)行[7]。將擴(kuò)大培養(yǎng)的菌液按 1∶100接種于250 mL LB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至菌濃度OD600值為1.0時(shí)，加入IPTG至終濃度為0.75 mmol/L，誘導(dǎo)培養(yǎng)2 h后，8 000 r/min離心10 min并將收獲的菌體重懸于40 mL的裂解液 (10 mmol/L Tris-HCl，pH 7.2) 中，?20 ℃放置過夜后，冰浴條件下超聲破碎20 min，超聲功率為30 W，超聲間隔時(shí)間為10 s，裂解的菌液12 000 r/min離心10 min，收集上清備用。用8倍柱體積的平衡緩沖液 (10 mmol/L Tris-HCl，pH 7.2) 平衡Amylose resin親和層析柱，然后加入樣品并使其緩慢的流過層析柱以便樣品充分的結(jié)合，用 10倍柱體積的洗滌緩沖液 (10 mmol/L Tris-HCl，1 mol/L NaCl，pH 7.2) 洗去未結(jié)合的蛋白，最后用洗脫緩沖液 (10 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L麥芽糖，pH 7.2) 洗脫，洗脫蛋白用SDS-PAGE進(jìn)行分析，蛋白的純度采用Bandscan軟件進(jìn)行分析。

1.2.5 MBP-NU融合蛋白的活性檢測(cè)

以 10 kb的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為底物，不同單位的MBP-NU對(duì)其進(jìn)行水解反應(yīng)。酶活單位的定義：在37 ℃條件下30 min完全降解5 μg DNA的酶量為一個(gè)酶活單位。在冰浴上每支PCR管中加入3 μL緩沖液N (250 mmol/L pH 8.0 Tris-HCl，0.5 g/L BSA，5 mmol/L MgSO4)，過量的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，一定量的MBP-NU，用ddH2O補(bǔ)充至終體積為15 μL，混勻，37 ℃保溫30 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)反應(yīng)結(jié)果。MBP-NU的量分別為：0、0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0、10.0 U。

以含 RNA的 10 kb標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為底物，進(jìn)行MBP-NU降解 RNA的定性實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)體系：3 μL緩沖液N，過量的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，適量的MBP-NU，再加入ddH2O至終體積15 μL，混勻，37 ℃保溫30 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)反應(yīng)結(jié)果。MBP-NU的量分別為：0、8、16、24、32、40、48、56 U。

1.2.6 EDTA和PMSF對(duì)MBP-NU活性的影響

在下述反應(yīng)體系中分別加入不同濃度的抑制劑EDTA或PMSF，混勻，37 ℃保溫30 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)反應(yīng)結(jié)果。EDTA的濃度分別為：0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mmol/L。PMSF的濃度分別為：0、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0 mmol/L。反應(yīng)體系為：3 μL緩沖液N，過量的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，7.5 U的MBP-NU，適量的抑制劑，再加入ddH2O至終體積15 μL。

1.2.7 溫度、pH和鹽濃度對(duì)MBP-NU活性的影響

參考1.2.5的方法，分別在0 ℃、4 ℃、16 ℃、24 ℃、37 ℃、52 ℃、67 ℃、82 ℃條件下檢測(cè)MBP-NU的水解活性，分析溫度對(duì)MBP-NU水解活性的影響。用pH分別為3.7、4.5、5.6、7.0、8.0、9.0、10.0的緩沖液替代緩沖液N，在37 ℃條件下檢測(cè)MBP-NU的水解活性，分析pH對(duì)MBP-NU水解活性的影響。

為探討鹽濃度對(duì)MBP-NU水解活性的影響，參考1.2.5的方法，在反應(yīng)體系中加入終濃度分別為0、50、100、150、200、250、300 mmol/L KCl或NaCl，37 ℃條件下檢測(cè)酶的水解效率。

1.2.8 純化MBP-NU中蛋白酶活性的檢測(cè)

純化蛋白中蛋白酶活性的測(cè)定參考 Cupp-Enyard[8]的方法。滅菌試管加入5 mL 0.65% (W/V)酪蛋白溶液，37 ℃水浴中保溫10 min，加入2 000 U的純化酶液，搖勻后，37 ℃精確反應(yīng)1 h，然后立即向管內(nèi)加入5 mL 0.4 mol/L三氯乙酸溶液以終止反應(yīng)。37 ℃水浴中繼續(xù)保溫30 min，12 000 r/min離心20 min，取上清在275 nm波長(zhǎng)處測(cè)定光吸收。以含有高溫滅活酶液的測(cè)定管作為對(duì)照，每次測(cè)定重復(fù)3次。

另外分別以商品化的牛血清白蛋白 (Bovine Serum Albumin，BSA) 和本實(shí)驗(yàn)室純化的無機(jī)焦磷酸酶 (pyrophosphatase，PPA) 作為反應(yīng)底物，與10 000 U高劑量的MBP-NU在37 ℃條件下反應(yīng)24 h后，SDS-PAGE分析BSA和PPA電泳帶型的變化。

1.2.9 純化MBP-NU與商品化Benzonase的活性比較

為了比較MBP-NU與商品化的Benzonase的水解效率，參考1.2.5的方法，在反應(yīng)體系中分別加入終濃度為1.0、10 U的酶，37 ℃條件下檢測(cè)酶的水解效率。

1.2.10 純化MBP-NU的去核酸效果檢測(cè)

采用內(nèi)標(biāo)法檢測(cè)MBP-NU對(duì)核酸的水解效果。本實(shí)驗(yàn)室在無機(jī)焦磷酸酶的重組表達(dá)與純化實(shí)驗(yàn)中，6 g誘導(dǎo)表達(dá)的菌體用15 mL裂解液 (25 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L KCl，0.5% Tween20，pH 8.0)進(jìn)行裂解，取裂解液加入1.2.1中的PCR產(chǎn)物至終濃度為100 ng/μL，再分別添加終濃度為0、1、5、10、15、20 U/mL的MBP-NU，37 ℃條件下反應(yīng)5 min，置于冰上。取2 μL做模板參考1.2.1擴(kuò)增參數(shù)及體系檢測(cè)內(nèi)標(biāo)水解程度。

2 結(jié)果

2.1 靈桿菌核酸酶原核表達(dá)載體的構(gòu)建

圖1 NU基因的PCR擴(kuò)增 (A) 和重組質(zhì)粒的PCR鑒定 (B)Fig. 1 PCR amplification of NU gene (A) and identification of recombinant vector pMAL-c4X-NU (B). M: DNA marker DL2000; 1: PCR product of NU gene.

以靈桿菌的基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增編碼靈桿菌核酸酶的 DNA片段，電泳分析顯示在750 bp左右有一特異DNA帶 (圖1A)，大小與預(yù)期結(jié)果一致。將擴(kuò)增產(chǎn)物酶切純化后連接到 pMAL-c4X載體上，得到重組表達(dá)載體pMAL-c4X-NU。提取重組表達(dá)載體，質(zhì)粒PCR擴(kuò)增得到約750 bp的基因片段 (圖1B)，與目的序列大小一致，并經(jīng)測(cè)序證實(shí)載體構(gòu)建完全正確。

2.2 靈桿菌核酸酶的序列分析

用BLASTN在線軟件對(duì)所測(cè)NU序列進(jìn)行同源基因檢索顯示其與 S. marcescens 核酸酶基因的同源性為97%，與Serratia proteamaculans 568的核酸酶基因的同源性為 85%。應(yīng)用 ClustalX2軟件對(duì)其核酸序列進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)其與S. marcescens核酸酶基因 (GenBank Accession No. M19495.1) 有22個(gè)堿基不同，編碼的氨基酸僅在第12位不同，其他均為同義密碼子的變化 (圖2)。

圖2 靈桿菌核酸酶NU和與其同源的核酸序列比對(duì)Fig. 2 Alignment of nucleic acids between NU and its homologous sequences. The reading frame of the maturation protein was highlighted by gray coating.

2.3 MBP-NU融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

SDS-PAGE結(jié)果顯示，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的含重組表達(dá)載體的細(xì)菌可大量表達(dá)大小約為 78 kDa的新蛋白，而分別含有 pMAL-c4X、pMAL-c4X-NU (未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)) 載體的宿主菌及不含表達(dá)載體的宿主菌均不表達(dá)該蛋白 (圖 3)。新蛋白的分子量約為78 kDa，與預(yù)期值大小一致，說明MBP-NU融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)成功。

2.3.1 誘導(dǎo)溫度和IPTG濃度對(duì)MBP-NU融合蛋白表達(dá)量的影響

SDS-PAGE結(jié)果顯示 (圖4)，在IPTG濃度相同的條件下，融合蛋白的相對(duì)表達(dá)量隨溫度的升高而增加；在溫度相同的條件下，融合蛋白的相對(duì)表達(dá)量隨IPTG濃度的不同出現(xiàn)了不同的變化，24 ℃時(shí)表達(dá)量基本相同，28 ℃時(shí)濃度為1.0 mmol/L時(shí)的表達(dá)量最大，37 ℃時(shí)濃度為0.75 mmol/L時(shí)的表達(dá)量最大。其中在37 ℃時(shí)IPTG濃度為0.75 mmol/L的條件下，融合蛋白的相對(duì)表達(dá)量最高。

圖3 MBP-NU誘導(dǎo)表達(dá)的SDS-PAGE分析Fig. 3 SDS-PAGE analysis of the induced expression of recombinant MBP-NU. M: protein marker; 1,3,5: induced BL21/pMAL-c4X-NU, BL21/pMAL-c4X and BL21, respectively; 2,4,6: uninduced BL21/pMAL-c4X-NU, BL21/ pMAL-c4X and BL21, respectively.

圖4 不同誘導(dǎo)溫度和IPTG濃度對(duì)MBP-NU表達(dá)量的影響Fig. 4 Effects of temperature and IPTG concentration on the expression of MBP-NU. M: protein marker; 1: uninduced; 2,3,4: induced at 24 °C; 5,6,7: induced at 28 °C; 8,9,10: induced at 37 °C; 2,5,8: induced with 0.5 mmol/L IPTG; 3,6,9: induced with 0.75 mmol/L IPTG; 4,7,10: induced with 1.0 mmol/L IPTG.

2.3.2 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)MBP-NU融合蛋白表達(dá)量的影響

SDS-PAGE結(jié)果顯示 (圖5)，誘導(dǎo)時(shí)間在1.5 h時(shí)融合蛋白的相對(duì)表達(dá)量較高。誘導(dǎo)時(shí)間超過2.5 h，表達(dá)量有所下降。

2.4 融合蛋白的純化

將誘導(dǎo)表達(dá)的菌體進(jìn)行超聲破碎后離心，上清液用 Amylose resin進(jìn)行純化。純化蛋白經(jīng)SDS-PAGE和 Bandscan軟件分析其純度為 93.8% (圖 6)，表明與 MBP融合的靈桿菌核酸酶可通過Amylose resin進(jìn)行高效的純化，從而避免了多次純化對(duì)核酸酶穩(wěn)定性及回收率的影響。

2.5 MBP-NU融合蛋白的活性檢測(cè)

研究考察了不同活性濃度的 MBP-NU對(duì)DNA、RNA的水解能力，如圖7所示。隨著MBP-NU的濃度增加，DNA的濃度由于酶解而減少。當(dāng)MBP-NU濃度達(dá)到10.0 U時(shí)，DNA已完全被降解。由圖7B可知，MBP-NU可以完全降解RNA。純化的MBP-NU的比活力為1.11×106U/mg。

圖5 不同誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)MBP-NU表達(dá)量的影響Fig. 5 Effect of induction duration on the expression of MBP-NU. M: protein marker; 1?4: induced for 3.5, 2.5, 1.5, 0.5 h, respectively; 5: uninduced.

圖6 純化MBP-NU融合蛋白的SDS-PAGE分析Fig. 6 SDS-PAGE analysis of purified MBP-NU. M: protein marker; 1: induced; 2: uninduced; 3: purified MBP-NU.

圖7 MBP-NU的DNase活性 (A) 和RNase活性 (B) 檢測(cè)Fig. 7 Assay of the DNase (A) and RNase (B) activity of MBP-NU. (A) 1?12: different concentration of MBP-NU(U): 0, 0.25, 0.5, 0.75, 1.0, 1.25, 1.5, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 10.0. (B) 1?9: different concentration of MBP-NU (U): 0, 8, 16, 24, 32, 40, 48, 56; M: DNA marker DL2000.

2.6 EDTA和PMSF對(duì)MBP-NU活性的影響

研究考察了不同濃度的 EDTA和 PMSF對(duì)MBP-NU活性的影響，如圖 8所示，0.5 mmol/L EDTA或1 mmol/L PMSF對(duì)MBP-NU的活性幾乎無影響，但EDTA濃度達(dá)到1 mmol/L時(shí)，約80%的 MBP-NU活性受到抑制。

2.7 溫度、pH和鹽濃度對(duì)MBP-NU活性的影響

圖8 EDTA (A) 和PMSF (B) 對(duì)MBP-NU活性的影響Fig. 8 Effects of EDTA (A) and PMSF (B) on the MBP-NU activity. (A) 1?7: different concentration of EDTA (mmol/L): 0, 0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0; 8. control. (B) 1: control; 2?9: different concentration of PMSF (mmol/L): 0, 0.25, 0.5, 1.0, 2.0, 4.0, 8.0, 12.5; M: DNA marker DL2000.

圖9 溫度 (A)、pH (B) 和不同濃度KCl (C) 對(duì)MBP-NU活性的影響Fig. 9 Effect of temperature (A), pH (B) and different KCl concentration (C) on the MBP-NU activity. (A) 1: control; 2?9: different temperatures (°C): 0, 4, 16, 24, 37, 52, 67, 82. (B). 1: control; 2?8: different pH: 3.7, 4.5, 5.6, 7.0, 8.0, 9.0, 10.0. (C) 1: control; 2?8: different KCl concentration (mmol/L): 0, 50, 100, 150, 200, 250, 300; M: DNA marker DL2000.

考察了不同溫度、pH和鹽濃度對(duì)MBP-NU活性的影響。如圖9A所示，隨著處理溫度的升高，剩余DNA的量由于酶解而呈現(xiàn)先降低后增加的變化趨勢(shì)，其中 37 ℃時(shí)的濃度最低，說明 MBP-NU的最適溫度為37 ℃；圖9B顯示MBP-NU的最適pH為8.0；圖9C說明，低于150 mmol/L的KCl對(duì) MBP-NU的活性幾乎沒有影響，當(dāng)KCl濃度為250 mmol/L時(shí)開始出現(xiàn)抑制現(xiàn)象，并隨鹽濃度的增加抑制程度也增加。NaCl對(duì)MBP-NU的活性影響與KCl相同 (結(jié)果未顯示)。

2.8 純化MBP-NU中蛋白酶活性的檢測(cè)

以酪蛋白為底物未檢測(cè)到純化的MBP-NU中存在蛋白酶活性。分別以一定純度的BSA和PPA為底物，與10 000 U大劑量純化的MBP-NU長(zhǎng)時(shí)間保溫后的電泳結(jié)果顯示，BSA和PPA樣品的電泳帶型無變化 (圖 10)，進(jìn)一步證明本實(shí)驗(yàn)純化的 MBP-NU中沒有蛋白酶活性。

2.9 純化MBP-NU與商品化Benzonase的活性比較

純化的MBP-NU與商品化的Benzonase進(jìn)行核酸的水解比較顯示，在相同的酶量下，兩種酶對(duì)核酸的水解效率相同 (圖11)。

圖10 純化MBP-NU與PPA和BSA保溫24 h對(duì)電泳譜帶的影響分析Fig. 10 Effect of co-incubation of MBP-NU with PPA or BSA for 24 h on the SDS-PAGE bands patterns. M: protein marker; 1,2: PPA; 3,4: BSA; 1,3: control; 2,4: MBP-NU treatment. Arrows indicated the added MBP-NU.

圖11 純化MBP-NU與商品化Benzonase的活性比較Fig. 11 Activity comparison between MBP-NU and Benzonase. M: DNA marker DL2000; 1: control; 2: Benzonase 1.0 U; 3: MBP-NU 1.0 U; 4: Benzonase 10 U; 5: MBP-NU 10 U.

2.10 純化的MBP-NU除核酸效果檢測(cè)

結(jié)合靈敏的PCR檢測(cè)技術(shù)，采用內(nèi)標(biāo)法對(duì)加入的內(nèi)標(biāo)片段的水解程度進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示 (圖12)，伴隨MBP-NU濃度的增加，目標(biāo)產(chǎn)物的擴(kuò)增量逐漸降低，當(dāng)酶量超過20 U/mL時(shí)，目的條帶完全消失，說明MBP-NU對(duì)于菌體裂解液中的模板有很高的水解效率。

圖12 不同濃度MBP-NU對(duì)菌體裂解液中內(nèi)標(biāo)基因NU PCR擴(kuò)增的影響Fig. 12 Effect of MBP-NU treatment on the PCR amplification of internal reference gene NU in cell lysis. M: DNA marker DL2000; 1?6: different concentration of MBP-NU (U): 0, 1, 5, 10, 15, 20; 7: PCR product from 1.2.1.

3 討論

對(duì)靈桿菌核酸酶的分泌途經(jīng)、進(jìn)化和作用機(jī)制已有較多的研究報(bào)道[9-12]。靈桿菌核酸酶的催化高效性使其在生物技術(shù)和實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用價(jià)值不斷凸顯，特別是該酶在消除核酸污染方面的顯著效果[13]。由于核酸酶本身對(duì)宿主細(xì)胞會(huì)造成強(qiáng)的毒害作用，從而給該酶的重組表達(dá)帶來了很大困難。已有研究報(bào)道利用大腸桿菌分泌表達(dá)該酶，但由于原核分泌系統(tǒng)的局限性，使其表達(dá)量?jī)H達(dá)到1.23×104U/L[6]。本研究克隆了靈桿菌的核酸酶基因，序列分析表明，其與報(bào)道的S. marcescens 核酸酶基因、Serratia proteamaculans 568的核酸酶的同源性分別為97%和85%。嘗試?yán)梅置谛驮吮磉_(dá)載體pLLP-OmpA和pET22b表達(dá)該基因，但由于微量的胞內(nèi)本底表達(dá)使菌體生長(zhǎng)嚴(yán)重受抑或者死亡。

本研究構(gòu)建了MBP-NU融合蛋白胞內(nèi)原核表達(dá)載體，在對(duì)多個(gè)菌種進(jìn)行篩選的基礎(chǔ)上，實(shí)現(xiàn)了其在大腸桿菌胞內(nèi)的成功表達(dá)和表達(dá)條件優(yōu)化，菌體生長(zhǎng)正常，表達(dá)量高達(dá) 1.21×107U/L。對(duì)于該酶在胞內(nèi)的可溶性表達(dá)為何沒有造成宿主細(xì)胞的死亡，推測(cè)原因主要有以下兩個(gè)方面：一是靈桿菌核酸酶與麥芽糖結(jié)合蛋白融合表達(dá)，有助于減少其在菌體內(nèi)對(duì)宿主菌的毒害；二是已有研究通過點(diǎn)突變的方式證明二硫鍵是靈桿菌核酸酶發(fā)揮催化活性所必需的[14]，由于胞內(nèi)的氧化還原條件抑制了二硫鍵的形成，使酶在胞內(nèi)無水解活性，因此不影響細(xì)胞的正常生長(zhǎng)，當(dāng)細(xì)胞破碎后，外界的氧化條件促使其向有活性的形式轉(zhuǎn)化。另外本研究中曾轉(zhuǎn)化構(gòu)建的表達(dá)載體于有利于二硫鍵形成的菌株 Rosetta gami2 (DE3)，未有轉(zhuǎn)化菌落形成，同時(shí)發(fā)現(xiàn)該酶僅在個(gè)別的菌株中表達(dá)，推測(cè)可能是由于不同菌株細(xì)胞內(nèi)部氧化還原狀態(tài)的差異使二硫鍵的形成存在巨大的差異，其內(nèi)在的真正原因有待進(jìn)一步揭示和證實(shí)。

重組酶對(duì)核酸的水解實(shí)驗(yàn)證明重組核酸酶在不切除MBP的情況下仍具有降解DNA和RNA的活性，最適反應(yīng)條件為37 ℃、pH 8.0，蛋白純化時(shí)緩沖液中常用的添加物0.5 mmol/L EDTA、1 mmol/L PMSF對(duì)MBP-NU的活性幾乎無影響，低于150 mmol/L 的KCl或NaCl (結(jié)果未顯示) 對(duì)融合蛋白MBP-NU的活性亦無影響。純化的MBP-NU中未檢測(cè)到蛋白酶活性，且該酶具有很好的儲(chǔ)存穩(wěn)定性，4 ℃條件下儲(chǔ)存2個(gè)月酶活性幾乎沒有變化，其水解效率與商品化Benzonase相同。Marcin等報(bào)道細(xì)菌裂解液中添加 25 U/mL (約 25 ng/mL) 的Benzonase即可滿足蛋白質(zhì)純化中核酸去除的需要，在濃度為9 U/mL時(shí)，4 h可使99%的放射性標(biāo)記的核酸完全水解，可滿足FDA對(duì)重組蛋白藥物每次使用劑量不得超過10 pg核酸污染的需求[15]。本研究中發(fā)現(xiàn)表達(dá)MBP-NU菌體的裂解液粘稠度明顯低于對(duì)照菌。本實(shí)驗(yàn)室在無機(jī)焦磷酸化酶的重組表達(dá)與純化實(shí)驗(yàn)中，向含有6 g菌體的15 mL裂解液中添加終濃度為10 U/mL (約10 ng/mL) 的MBP-NU，裂解菌體的粘度在5 min內(nèi)明顯下降，結(jié)合PCR高靈敏度的檢測(cè)極限，采用內(nèi)標(biāo)法證明，當(dāng)酶濃度達(dá)到20 U/mL時(shí)，在5 min內(nèi)即可使作為內(nèi)標(biāo)的DNA模板降解至PCR無法檢測(cè)到的水平。以上結(jié)果說明該酶具有極高的核酸水解效率，在核酸去除中具有添加酶蛋白量少的顯著特征。

本研究建立了靈桿菌核酸酶的高效胞內(nèi)重組表達(dá)體系，其表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于已有的分泌重組表達(dá)系統(tǒng)，融合MBP的核酸酶具有很高的水解效率，這些結(jié)果為在蛋白純化中利用酶法低成本地去除核酸奠定了基礎(chǔ)。

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