李 超，鄭 義，王乃馨，莊 平

(1.徐州工程學院食品工程學院，江蘇徐州221008;2.徐州市金地杰農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，江蘇徐州221116)

牛蒡多酚氧化酶的特性及酶促襊變的抑制

李 超1，鄭 義1，王乃馨1，莊 平2

(1.徐州工程學院食品工程學院，江蘇徐州221008;2.徐州市金地杰農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，江蘇徐州221116)

采用制作丙酮粉的方法提取了牛蒡中的多酚氧化酶(PPO)，并對其酶學特性進行了研究。實驗結(jié)果表明，牛蒡多酚氧化酶最適溫度為40℃，最適pH為6.0，在40℃下熱穩(wěn)定性較好，而在70℃加熱3min即可使其完全失活。牛蒡PPO的米氏常數(shù)為0.1337mol/L，最大反應速率Vmax為7.387U/min。通過響應面實驗設計的方法對防止牛蒡酶促褐變的配方進行了優(yōu)化，結(jié)果表明當復合護色液中EDTA、L－半胱氨酸和檸檬酸亞錫二鈉的護色劑的濃度都為0.04%(w/v)時，牛蒡的褐變度最小。

牛蒡，多酚氧化酶，酶促褐變

牛蒡(Arctium Lappa L.)原產(chǎn)于北歐、西伯利亞和中國北部，屬于菊科牛蒡?qū)賰赡晟荼局参?，其肥大肉質(zhì)的根可供藥食兩用。牛蒡根含有豐富的菊糖及揮發(fā)油、牛蒡酸、多酚、纖維素等，具有清除體內(nèi)垃圾，改善體循環(huán)，尤其對糖尿病、性機能減退、肥胖癥、風濕、類風濕、解肝毒、便秘、內(nèi)外痔等病癥有明顯效果［1］。目前，我國已經(jīng)成為世界上最大的牛蒡生產(chǎn)大國，其產(chǎn)品主要用于保鮮出口，其它產(chǎn)品有牛蒡罐頭、牛蒡醬、牛蒡茶、牛蒡絲以及菊糖等。多酚氧化酶(PPO，E.C.1.14.18.1)是一種含有銅離子的酶，廣泛存在于植物、動物和一些微生物中。在果蔬加工過程中，多酚類物質(zhì)在PPO和氧氣的作用下，鄰位的酚氧化為醌，醌很快聚合成為褐色素而引起組織褐變。酶促褐變不僅有損于果蔬感官品質(zhì)，而且導致其營養(yǎng)價值下降，特別是在熱帶鮮果中，酶促褐變導致的直接經(jīng)濟損失達50%。采用抗壞血酸、L－半胱氨酸等護色劑處理可以減少蓮藕［2］、茭白［3］、蘋果［4］等果蔬的酶促褐變。抗壞血酸鈣［5］、4－己基間苯二酚［6］等對牛蒡的酶促褐變有較好的抑制作用，但是對牛蒡PPO的酶學特性研究較少。許多研究采用感官評定的方法對褐變度進行測定，可能造成人為的誤差。本文對牛蒡中的PPO部分酶學性質(zhì)進行研究，并采用色差計測定牛蒡的色反應褐變程度，通過響應面設計實驗的方法對防止酶促褐變的護色劑的配方進行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛蒡 購自徐州當?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場，貯存于－18℃?zhèn)溆?其它化學試劑 均為分析純。

TU－1810型紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;TGL－20M高速臺式冷凍離心機 長沙湘儀離心機有限公司;PHS－3CA型精密酸度計 上海世義精密儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 牛蒡PPO粗酶液的提取 將冷凍牛蒡清洗后去皮，切成小塊，稱取 50g與 100mL冷凍丙酮(－18℃)在組織搗碎機中勻漿1min，然后迅速抽濾得到丙酮粉。用冷風將丙酮粉吹干至無丙酮味，稱取1g分散于50mL在4℃預冷過的0.2mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH7.0)中，攪拌30min后用紗布過濾，濾液在4℃離心30min，離心力18000×g，上清液即為粗酶液。

1.2.2 PPO活力的測定 在比色皿中加入2mL緩沖液、0.5mL 0.01mol/L兒茶酚溶液以及0.5mL粗酶液，在420nm下2min內(nèi)每隔5s測吸光值隨時間的變化。以每分鐘增加吸光值0.001的酶量為一個酶活力單位(0.001ΔOD420/min/mL)。

多酚氧化酶酶活的計算公式:E=M×60/V

其中:M－每秒鐘增加的吸光值;V－粗酶液的體積，mL。

1.2.3 PPO最適pH的測定 配制不同pH的Britton－Robison緩沖溶液，在比色皿中分別加入2mL不同pH的緩沖溶液，0.01mol/L的鄰苯二酚溶液0.5mL，然后加入0.5mL粗酶液，迅速測定溶液的吸光值，以最高酶活力為100%，求得其它pH下的相對酶活。

1.2.4 PPO最適溫度的測定 不同溫度下PPO的活力在最適pH下測定。取2mL的緩沖溶液、0.5mL 0.01mol/L的鄰苯二酚溶液，在20～80℃范圍內(nèi)，每隔10℃保溫 5min，加入 0.1mL粗酶液，然后迅速在420nm處測定各PPO的活力。

1.2.5 PPO的熱穩(wěn)定性 酶的熱穩(wěn)定性在40、50、60、70℃時測定。取10mL酶液在相應溫度下加熱一定時間后，在冰浴中迅速冷卻，在室溫下測定殘余酶活。

1.2.6 底物濃度與 PPO活力的關(guān)系 以濃度為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08mol/L的鄰苯二酚作為底物，在室溫下測定PPO的活性。根據(jù)Lineweaver－Burk作圖法得米氏常數(shù)Km和最大反應速率Vmax值。

1.2.7 護色劑對PPO活性的影響 分別用最適pH的緩沖溶液配制濃度為2mmol/L和10mmol/L的檸檬酸、異維生素C鈉、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、L－半胱氨酸和檸檬酸亞錫二鈉溶液，測定各種護色劑對PPO活力的抑制率。

1.2.8 護色劑配方優(yōu)化 根據(jù)酶學特性的研究結(jié)果，選擇顯示較高抑制率的護色劑作為防止牛蒡酶促褐變的護色劑。將牛蒡切成2mm的薄片浸泡于護色液中30min后，撈出瀝干水分，置于室溫下12h后測定其褐變度。采用Box－Behnken實驗設計，對護色劑的濃度進行優(yōu)化。

1.2.9 褐變度測定 采用全自動測色色差儀通過反射法測定牛蒡片的色澤。儀器的標準白板L* =93.53，a*=－0.82，b* =0.10。用L*值表示牛蒡的褐變度，L*值越大，表明牛蒡的褐變度越小。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH對PPO活力的影響

圖1反映采用鄰苯二酚為底物時pH對牛蒡PPO活力的影響。由圖1可知，牛蒡中PPO最適pH為6.0。眾多的研究表明，多數(shù)水果中的PPO在接近中性pH時顯示最大的活力。由圖1還可以看出，在極端酸性和堿性時酶活力急劇降低，當pH＜6.0或pH>6.0時，PPO相對活性顯著下降，pH小于3.0或者大于9.0時，PPO幾乎完全失活。在pH低于3.0的酸性環(huán)境中，酶中的銅離子被解離出來，與酶蛋白脫離，使酶失活。在強堿條件下，銅會解離成氫氧化銅，從而使酶活性顯著降低［2］。但是根據(jù)Lee等［7］的研究，在極端堿性環(huán)境下PPO的失活也可能是由于酶蛋白的構(gòu)象改變、或者迅速與美拉德反應、Strecker降解的產(chǎn)物發(fā)生反應。因此，在果蔬加工中，通過調(diào)節(jié)pH可有效抑制PPO活力。

圖1 pH對牛蒡PPO的影響

2.2 溫度對PPO活力的影響

溫度對牛蒡PPO活力的影響如圖2所示。由圖可見，PPO活性先隨溫度升高而上升，在40℃時達到最大值，而后又隨溫度的升高而下降，在低于20℃、高于50℃時，PPO相對活力比較小，這是因為隨著溫度升高，酶反應速度加快，當溫度高于50℃時，酶蛋白發(fā)生變性失活。因此在牛蒡加工中可采用低溫處理來抑制其PPO活性，延緩褐變。

圖2 溫度對牛蒡PPO活力的影響

2.3 PPO的熱穩(wěn)定性

將牛蒡PPO在不同溫度下(40～70℃)保溫后，立即冰浴冷卻測定其殘余活力，結(jié)果如圖3所示。由圖3可見，PPO在40℃較為穩(wěn)定，但是當溫度高于50℃時酶活隨著保溫時間的增加，殘余酶活力迅速下降，90℃保溫5min后，殘余活力只有原始的10%，10min后完全失活。因此在牛蒡加工中，可采用熱燙的方法來鈍化PPO，抑制褐變。但是如果采用熱處理的方法不當，會使其品質(zhì)受到一定的影響。

圖3 牛蒡PPO的熱穩(wěn)定性

2.4 牛蒡PPO的動力學特性

圖4是鄰苯二酚底物濃度對牛蒡PPO反應速度

圖4 底物濃度對牛蒡PPO活力的影響

圖5 牛蒡PPO的Lineweaer－Burk圖

2.5 護色劑對PPO活力的影響

不同護色劑對牛蒡多酚氧化酶的抑制效果如表1所示。由表1可見，L－半胱氨酸對牛蒡PPO的抑制作用最強，EDTA和檸檬酸亞錫二鈉次之，而異維生素C鈉的抑制作用較小。抑制酶促褐變的物質(zhì)很多，但是對不同來源的PPO，抑制作用并不相同。

表1 護色劑對牛蒡PPO酶活的影響

2.6 護色劑配方優(yōu)化

2.6.1 不同護色劑濃度對牛蒡酶促褐變的影響 根據(jù)PPO酶學特性中護色劑對酶活的抑制作用，選擇L－半胱氨酸、EDTA和檸檬酸亞錫二鈉作為防止酶促褐變的護色劑。不同護色劑濃度對牛蒡褐變的影響如圖6所示。由圖6可見，隨著護色劑濃度的增加，牛蒡的褐變度減小。0.03%(w/v)的L－半胱氨酸對牛蒡的護色效果較好，濃度進一步增加，對褐變不再有顯著性影響。而EDTA和檸檬酸亞錫二鈉濃度都為0.05%(w/v)時，牛蒡的褐變度最小。

圖6 護色劑濃度對牛蒡褐變的影響

2.6.2 護色劑配方的優(yōu)化 由單因素實驗的結(jié)果，選取EDTA、L－半胱氨酸和檸檬酸亞錫二鈉等三種護色劑復配，采用Box－Behnken正交回歸實驗設計對護色劑的濃度進行優(yōu)化。以L*值為指標，EDTA濃度的水平選擇0.04%、0.05%和0.06%，L－半胱氨酸濃度水平選擇0.02%、0.03%和0.04%，檸檬酸亞錫二鈉濃度的水平選擇0.04%、0.05%和0.06%。實驗設計與結(jié)果見表2。

表2 Box－Behnken實驗設計和結(jié)果

對表2中的實驗結(jié)果進行方差分析，結(jié)果見表3。由方差分析可知，回歸模型高度顯著(p=0.0098＜0.01)。由于模型的失擬項不顯著(p=0.8526>0.05)，Adeq Precision等于10.799，遠大于4，可知回歸方程擬合度和可信度均很高，能夠很好地對牛蒡的褐變度進行預測。

由回歸模型系數(shù)顯著性檢驗結(jié)果可知，三種護色劑對牛蒡褐變都有顯著性影響，L－半胱氨酸與EDTA、L－半胱氨酸與檸檬酸亞錫二鈉之間有協(xié)同增效的護色效果。

表3 二次正交回歸方程模型方差分析

2.6.3 響應面分析與優(yōu)化 根據(jù)回歸方程所作的響應面圖直觀反映了各個因素對牛蒡褐變度的影響(圖7)。由圖7可見，檸檬酸亞錫二鈉對牛蒡褐變度L*值的影響是線性的，而L－半胱氨酸和EDTA對褐變的影響是非線性的，與表3中的方差分析結(jié)果一致。為進一步確定最佳點，在模型范圍內(nèi)選擇出發(fā)點，按照模型使用快速上升法進行優(yōu)化，當EDTA、L－半胱氨酸和檸檬酸亞錫二鈉的濃度都為0.04%(w/v)時，牛蒡的褐變度最小。

圖7 EDTA、檸檬酸、L－半胱氨酸及其相互作用對牛蒡L*值的影響

3 結(jié)論

由于PPO的作用，牛蒡在加工過程中容易發(fā)生酶促褐變。實驗結(jié)果表明，牛蒡 PPO酶反應遵循Michaelis－Menten動力學，最適溫度為40℃，最適pH為6.0。因此要盡量避免在此溫度和pH下進行牛蒡加工。檸檬酸亞錫二鈉、EDTA和L－半胱氨酸對牛蒡的酶促褐變有較好的抑制作用，將牛蒡切片浸泡于由0.04%(w/v)的檸檬酸亞錫二鈉、EDTA和L－半胱氨酸組成的復合護色劑中30min，可以在12h內(nèi)防止其發(fā)生褐變。作為一種新的酶促褐變的護色劑，檸檬酸亞錫二鈉可以有效地防止牛蒡的酶促褐變，可以作為除抗壞血酸、EDTA等傳統(tǒng)抗褐變劑之外的新型添加劑。

［1］李丹丹.牛蒡菊糖的制備、結(jié)構(gòu)與特性［D］.無錫:江南大學博士畢業(yè)論文，2007.

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Characterization of polyphenoloxidase
and inhibition of enzymatic browning in burdock

LI Chao1，ZHENG Yi1，WANG Nai－xin1，ZHUANG Ping2
(1.College of Food Engineering，Xuzhou Institute of Technology，Xuzhou 221008，China;2.Xuzhou Excellent Land Agriculture Development Co.，Ltd.，Xuzhou 221116，China)

An acetone powder was prepared from burdock for extracting polyphenoloxidase(PPO)，and the characterization of PPO was studied.The results indicated that burdock PPO had a optimum pH of 6.0，showing maximum activity at 40℃.Heated for 3min，PPO of burdock would been inactivated completely，though it showed very stable at 40℃.The Km of burdock PPO was 0.1337mol/L，while its Vmax was 7.387U/min.Response surface methodology was adopted to optimize the combination of antibrowning agents.When the concentration of EDTA，L－cystine and distannous citrate in antibrowning solution was 0.04%，the browning degree of burdock was the lest.

burdock;polyphenoloxidase;enzymatic browning

TS201.2

A

1002－0306(2011)06－0121－04

2010－04－19

李超(1978－)，男，講師，博士，研究方向:天然產(chǎn)物化學。

蘇北科技發(fā)展計劃(SBN200910087);徐州工程學院青年項目(XKY2010208)。