陳鵬　胡立華　張艷杰　常英娟　張鑒穎

[摘要] 目的 通過研究γ-氨基丁酸（GABA）及其受體在便秘型腸易激綜合征（C-IBS）大鼠模型腸神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)的變化，探討GABA在腸易激綜合征（IBS）發(fā)病機(jī)制中的可能作用。 方法 通過0～4℃冰水灌胃方法建立C-IBS大鼠模型，分別取模型組和正常對(duì)照組大鼠的回盲部以及距肛門3cm處結(jié)腸的標(biāo)本，進(jìn)行灌注、固定、切片。用抗谷氨酸脫羧酶（GAD）、GABAA受體、GABAB受體抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，應(yīng)用病理圖像分析系統(tǒng)對(duì)不透光率密度值進(jìn)行半定量分析。 結(jié)果 與正常大鼠相比，C-IBS大鼠模型回盲部及距肛門3cm處結(jié)腸肌層中GAD免疫反應(yīng)性明顯降低（P < 0.05），GABAA受體免疫反應(yīng)性無明顯變化（P > 0.05），GABAB受體免疫反應(yīng)性明顯降低（P < 0.05）。 結(jié)論 GABA可能通過其受體間接地參與IBS的病理生理過程。

[關(guān)鍵詞] 腸易激綜合征；腸神經(jīng)系統(tǒng)；γ-氨基丁酸；γ-氨基丁酸受體

[中圖分類號(hào)] R574.4[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B[文章編號(hào)] 1673-9701（2012）21-0015-03

腸易激綜合征（irritable bowel syndrome，IBS）是由腹部不適或腹痛伴排便異常組成的一組腸功能障礙性綜合征，目前發(fā)病原因尚不清楚，缺乏有效的治療方法[1]。腸神經(jīng)系統(tǒng)（enteric nervous system，ENS）是胃腸壁內(nèi)的自主神經(jīng)系統(tǒng)，具有獨(dú)立于大腦而行使其功能的完整結(jié)構(gòu)。ENS中含有多種神經(jīng)遞質(zhì)，近年來的研究結(jié)果表明在IBS動(dòng)物模型的腸神經(jīng)元VIP、SP等神經(jīng)遞質(zhì)表達(dá)增強(qiáng)[2]，而IBS患者血中NO、5-HT、SP[3，4]等也發(fā)生了變化，提示ENS中的神經(jīng)遞質(zhì)與IBS的發(fā)病機(jī)制存在一定關(guān)系。γ-氨基丁酸（γ-amino butyric acid，GABA）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，通過受體（包括GABAA、GABAB、GABAC等亞型）發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。谷氨酸脫羧酶（glutamic acid decarboxylase， GAD）為GABA合成過程中的關(guān)鍵酶，被認(rèn)為是GABA能神經(jīng)元的特異性標(biāo)記酶。但迄今為止，關(guān)于GABA及其受體在腸易激綜合征中的表達(dá)變化尚不清楚。本研究利用冰水洗胃方法建立的便秘型腸易激綜合征（C-IBS）大鼠模型[5]，應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法及圖像分析系統(tǒng)半定量分析對(duì)正常及C-IBS大鼠ENS內(nèi)GAD、GABAA受體、GABAB受體的表達(dá)變化進(jìn)行研究，以探討GABA在IBS發(fā)病過程中的可能作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型的建立

SD大鼠10只，雌雄不拘，體重200～250 g，由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，隨機(jī)分為兩組，模型組5只，每日給予0～4℃冰水２ mL灌胃１次，共14 d，灌胃停止后正常飼養(yǎng)。正常對(duì)照組5只，每日正常進(jìn)食飲水飼養(yǎng)，第28天取材。

1.2 取材

動(dòng)物用戊巴比妥鈉（100 mg/kg體重）行腹膜腔深麻后，開胸經(jīng)左心室插管至升主動(dòng)脈，先以150 mL的0.025 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS，pH7.3）快速?zèng)_洗血液，再以500 mL含4%多聚甲醛和0.5%苦味酸的0.1mol/L磷酸緩沖液（PBS，pH7.3）灌注固定1.0～1.5 h。灌畢立即取回盲部、距肛門3 cm處的結(jié)腸各0.5 cm，并置入含25%蔗糖的0.05mol/L的PBS過夜（4℃），恒冷箱切片。

1.3 免疫組織化學(xué)染色

切片經(jīng)0.05 mol/L PBS（pH7.3）洗3次后，分別進(jìn)行GAD、GABAA受體、GABAB受體免疫組織化學(xué)染色。首先分別用小鼠抗GAD IgG（1：500，Chemicon）、羊抗GABAA受體α3 IgG （1：500，Alamone Labs）、小鼠抗GABAB受體IgG（1：500，Chemicon）抗體在室溫下孵育切片過夜，然后分別將切片移入生物素標(biāo)記的羊抗小鼠IgG（1：100，Vector）、生物素標(biāo)記的驢抗羊IgG（1：100，Vector）和生物素標(biāo)記的羊抗小鼠IgG（1：100，Vector）中孵育4 h，最后移入ABC復(fù)合物（1：100，Vector）室溫下孵育4 h。其中一抗和二抗用含5%驢血清、0.05%疊氮鈉、0.5% Triton X-100和0.25%角叉菜膠的0.05 mol/L的PBS稀釋，ABC用含0.3% Triton X-100的0.05 mol/L的PBS稀釋。上述反應(yīng)完成后的切片進(jìn)行DAB和H2O2呈色，然后裱片，脫水透明，DPX封片。

1.4 染色結(jié)果分析

應(yīng)用計(jì)算機(jī)病理圖像分析系統(tǒng)，對(duì)切片中各抗體不透光率密度（opacity density， OD）進(jìn)行半定量分析。OD值代表組織染色強(qiáng)度，即OD值越大，染色越強(qiáng) 。每張切片隨機(jī)取兩個(gè)視野進(jìn)行分析，取平均值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)以（x±s）表示，采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行多組間比較，采用單因素方差分析，各組間兩兩之間的多重比較采用t檢驗(yàn)，P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

①正常大鼠和IBS模型大鼠回盲部及結(jié)腸肌層中GAD主要陽性部位是肌間神經(jīng)叢，呈較強(qiáng)的棕黃色反應(yīng)，其中神經(jīng)纖維染色比神經(jīng)元胞漿染色更濃，GAD樣陽性神經(jīng)元胞體約占肌間神經(jīng)叢神經(jīng)元的10%左右。IBS模型組回盲部及距肛門3 cm處結(jié)腸的GAD免疫反應(yīng)性均較正常對(duì)照組明顯降低（P < 0.05）。②正常大鼠和IBS模型大鼠回盲部及結(jié)腸肌層中GABAA受體主要陽性部位是肌間神經(jīng)叢，呈較強(qiáng)的棕黃色反應(yīng)，其中大部分為神經(jīng)纖維染色。IBS模型組回盲部及距肛門3 cm處結(jié)腸的GABAA受體免疫反應(yīng)性均與正常對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。③正常大鼠和IBS模型大鼠回盲部及結(jié)腸肌層中GABAB受體主要陽性部位是肌間神經(jīng)叢，呈較強(qiáng)的棕黃色反應(yīng)，其中大部分為神經(jīng)纖維染色。IBS模型組回盲部及距肛門3 cm處結(jié)腸的GABAB受體免疫反應(yīng)性均較正常對(duì)照組明顯降低（P < 0.05）。見表1。

3 討論

IBS是一種臨床最常見的慢性腸功能紊亂疾病，該病缺乏可解釋癥狀的形態(tài)學(xué)改變和生化異常，其發(fā)病率全球約15%～20%，且多見于女性[1，6]。IBS臨床表現(xiàn)復(fù)雜，呈多樣性，常以結(jié)腸癥狀為主，也可表現(xiàn)為其他消化道癥狀甚至軀體癥狀。目前IBS的病因尚未完全明了，其涉及因素較多，如腸道運(yùn)動(dòng)異常、內(nèi)臟感覺異常、腦腸相互作用、神經(jīng)免疫機(jī)制等。

ENS由腸道肌間神經(jīng)叢和黏膜下神經(jīng)叢組成， 肌間神經(jīng)叢主要控制胃腸道運(yùn)動(dòng)，而黏膜下神經(jīng)叢主要控制胃腸分泌和局部血流[3，4]。目前發(fā)現(xiàn)人腸神經(jīng)元的總數(shù)達(dá)到8～10億個(gè)，相當(dāng)于整個(gè)脊髓內(nèi)所含神經(jīng)元的總數(shù)，稱之為腸腦。ENS內(nèi)含有多種神經(jīng)遞質(zhì)，包括經(jīng)典的神經(jīng)遞質(zhì)和腦腸肽等，已經(jīng)證實(shí)的多達(dá)數(shù)十種。有些遞質(zhì)與其他遞質(zhì)共存，有些遞質(zhì)還以胃腸激素的形式發(fā)揮作用，腸神經(jīng)遞質(zhì)的多樣性決定了功能的復(fù)雜性。目前認(rèn)為主要的興奮性遞質(zhì)有乙酰膽堿（acetylcholine，Ach）、P物質(zhì)、阿片肽和5-羥色胺等[7]，主要的抑制性遞質(zhì)為一氧化氮（nitric oxide，NO）和血管活性腸肽（vasoactive intestinal peptide，VIP）等[8]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，在IBS患者和動(dòng)物模型的ENS內(nèi)，一些神經(jīng)遞質(zhì)的含量發(fā)生了變化[2～4，9]，提示ENS可能通過這些神經(jīng)遞質(zhì)參與了腸道功能失調(diào)的發(fā)生。

我們既往的研究證實(shí)，GABA在ENS內(nèi)分布的數(shù)量要少于Ach、NO和VIP，并且與上述三種神經(jīng)遞質(zhì)均有共存（待發(fā)表）。在ENS中Ach被認(rèn)為是主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，而NO和VIP則為主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，GABA這種既與興奮性神經(jīng)遞質(zhì)共存又與抑制性神經(jīng)遞質(zhì)共存的形式提示GABA可能不是直接作用于效應(yīng)器，而是通過促進(jìn)或抑制其他遞質(zhì)而對(duì)胃腸動(dòng)力的興奮和抑制發(fā)揮協(xié)調(diào)作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大鼠ENS內(nèi)GABA及其受體主要分布在肌間神經(jīng)叢，與正常大鼠相比，C-IBS大鼠模型回盲部及距肛門3 cm處結(jié)腸肌層中GAD免疫反應(yīng)性明顯降低（P < 0.05），GABAA受體免疫反應(yīng)性無明顯變化（P > 0.05），GABAB受體免疫反應(yīng)性明顯降低（P < 0.05）。GABA在大鼠IBS模型中表達(dá)的減少，提示了參與IBS發(fā)病的可能。由于GABA主要存在內(nèi)在神經(jīng)元中，而且其在胃腸動(dòng)力過程中發(fā)揮間接地協(xié)調(diào)作用，因而我們推測GABA在協(xié)調(diào)腸道興奮性和抑制性作用方面發(fā)生了失衡，而參與了IBS的發(fā)病過程。GABAA受體是配體門控的氯離子通道，而GABAB受體屬于G蛋白偶聯(lián)受體，激活后可通過胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)調(diào)制離子通道的活動(dòng)，二者在ENS中均有表達(dá)，說明了GABA調(diào)控作用的復(fù)雜性。在IBS動(dòng)物模型中GABAA受體沒有明顯變化，而GABAB受體則表達(dá)減少，提示GABA參與IBS發(fā)病過程可能主要通過GABAB受體這一途徑實(shí)現(xiàn)的。綜合我們的實(shí)驗(yàn)和其他研究[2，10，11]，我們推測在正常腸道中GABA通過不同受體調(diào)節(jié)不同共存遞質(zhì)的釋放而在胃腸動(dòng)力的興奮與抑制中發(fā)揮協(xié)調(diào)作用，在IBS動(dòng)物模型中，由于GABA及GABAB受體的減少，使GABA在協(xié)調(diào)腸道興奮性和抑制性作用方面發(fā)生失衡，從而參與了IBS的發(fā)病過程。對(duì)于GABA在IBS發(fā)病機(jī)制中的具體過程尚需大量的研究工作來證實(shí)。

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（收稿日期：2012-05-21）