王勝軍， 趙秀鶴， 劉學(xué)伍， 張同霞， 陳學(xué)蘭， 遲兆富△

(山東大學(xué)齊魯醫(yī)院1神經(jīng)內(nèi)科，2藥劑科，山東濟(jì)南250012)

聚腺苷二磷酸核糖［poly(adenosine diphosphate ribose)，PAR］廣泛存在于細(xì)胞中，參與細(xì)胞DNA的修復(fù)及基因組穩(wěn)定［1］。聚腺苷二磷酸核糖聚合酶［poly(adenosine diphosphate ribose)polymerase，PARP］和聚腺苷二磷酸核糖糖苷水解酶［poly(adenosine diphosphate ribose)glycohydrolase，PARG］是細(xì)胞內(nèi)聚腺苷二磷酸核糖基化［poly(ADP－ribosyl)ation］的重要調(diào)節(jié)酶［1］，細(xì)胞內(nèi)PAR通常由PARP利用煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD)合成，然后被PARG迅速降解為腺苷二磷酸核糖。在心力衰竭、腦缺血再灌注及神經(jīng)元興奮毒性損傷等過程中，都發(fā)現(xiàn)PARP過度激活，PAR合成增加，伴有NAD耗竭，細(xì)胞死亡信號(hào)激活，炎癥因子表達(dá)等，最終發(fā)生細(xì)胞死亡［2－5］。

癲癇發(fā)作可引起海馬神經(jīng)元死亡及炎癥反應(yīng)，而癲癇發(fā)作的反復(fù)發(fā)生也很可能與之有關(guān)［6］。我們發(fā)現(xiàn)，癲癇大鼠海馬組織中PARP被過度活化，并通過激活凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis－inducing factor，AIF)及炎癥因子等造成神經(jīng)元損傷［4－5］。近來研究提示，PARG參與調(diào)節(jié)PAR代謝，抑制PARG活性可減少NAD+消耗，減少炎癥因子表達(dá)和細(xì)胞凋亡，具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用［7－8］。但到目前為止，PARG是否參與癲癇發(fā)作引起的神經(jīng)元損傷仍未見報(bào)道，相關(guān)分子機(jī)制亦不清楚。本研究將應(yīng)用海藻氨酸(kainic acid，KA)誘發(fā)的癲癇大鼠模型，探討PARG與癲癇后海馬神經(jīng)元損傷及AIF、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor－α，TNF－α)、白細(xì)胞介素1β(interleukin－1β，IL－1β)表達(dá)的關(guān)系。

材料和方法

1 材料

成年雄性Wistar大鼠，質(zhì)量(250±50)g，由山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。KA、PARP抑制劑3－氨基苯甲酰胺(3－aminobenzamide，3－AB)和 PARG抑制劑單寧酸(gallotannin，GT)購自 Sigma，抗 PAR多克隆抗體購自Alexis Biochemichals，抗AIF單克隆抗體、抗TNF－α單克隆抗體、抗IL－1β多克隆抗體、抗β－actin單克隆抗體、抗組蛋白H1單克隆抗體和HRP標(biāo)記Ⅱ抗購自Santa Cruz，細(xì)胞色素C氧化酶IV亞基(cytochrome C oxidase subunit IV，COX－IV)多克隆抗體購自Biovision。

2 動(dòng)物模型的制作

腹腔注射苯巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉實(shí)驗(yàn)大鼠，在立體定位儀上，用微量注射器將KA(0.5 μg溶于1 μL生理鹽水中)緩慢注射入大鼠側(cè)腦室(前囟后0.85 mm，側(cè)旁 1.5 mm，深 4.3 mm)，應(yīng)用腦電圖機(jī)描記顳葉(前囟后4 mm，左、右側(cè)旁 2 mm)腦電，并觀察大鼠行為變化。對(duì)照組采用等量生理鹽水代替KA。藥物干預(yù)組大鼠在注射KA 30 min前后都給予腹腔注射3－AB 40 mg/kg或單寧酸30 mg/kg。對(duì)照組亦采用等量生理鹽水代替相應(yīng)藥物。

3 動(dòng)物分組

實(shí)驗(yàn)(一):癲癇發(fā)作后PAR表達(dá)的研究，24只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、KA致癇6 h組(KA 6h)、KA致癇+3－氨基苯甲酰胺干預(yù)組(KA+3－AB)、KA致癇+單寧酸干預(yù)組(KA+GT);實(shí)驗(yàn)(二):單寧酸對(duì)癲癇后海馬神經(jīng)元保護(hù)的研究，18只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、KA致癇72 h組(KA 72h)、KA致癇+單寧酸干預(yù)組(KA+GT);實(shí)驗(yàn)(三):單寧酸調(diào)節(jié)AIF的研究，18只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、KA致癇24 h組(KA 24h)、KA致癇+單寧酸干預(yù)組(KA+GT);實(shí)驗(yàn)(四):單寧酸調(diào)節(jié)炎癥因子表達(dá)的研究，18只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、KA致癇24 h組(KA 24h)、KA致癇+單寧酸干預(yù)組(KA+GT)。

4 大鼠海馬組織Nissl染色及組織學(xué)分析

大鼠經(jīng)10%水合氯醛腹腔麻醉，4%多聚甲醛灌注固定后取腦。組織浸蠟包埋，連續(xù)冠狀切片，切片厚度為10 μm，保存?zhèn)溆?。石蠟切片脫蠟至水?%甲苯胺藍(lán)室溫下染色，乙醇分色，二甲苯透明，中性樹膠封片。在 Olympus顯微鏡下，觀察大鼠海馬CA1和CA3區(qū)神經(jīng)元的形態(tài)及其分布。海馬神經(jīng)元計(jì)數(shù)定義為海馬CA1和CA3區(qū)每0.5 mm長度錐體細(xì)胞層中神經(jīng)元數(shù)目。每張切片隨機(jī)觀察5個(gè)視野，取其平均值。

5 海馬組織蛋白提取及Western blotting

各實(shí)驗(yàn)組大鼠快速斷頭取腦，快速分離海馬，緩沖液洗滌，加入細(xì)胞裂解液，冰上孵育，離心后棄上清;沉淀中加入裂解緩沖液，冰浴充分研磨，靜置離心;或于沉淀中加入細(xì)胞核裂解液或線粒體分離介質(zhì)，冰上孵育后離心，上清為核蛋白提取液，沉淀物為線粒體蛋白。加入蛋白上樣液，沸水煮，－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩＞郾０纺z電泳，分別配置不同濃度的分離膠和濃縮膠，加入電泳緩沖液，將40 μg蛋白質(zhì)樣品加入樣品孔的底部，在恒壓下電泳約60 min;將電泳凝膠、硝酸纖維素膜、濾紙置于轉(zhuǎn)膜槽，于恒流中電轉(zhuǎn)2 h;將硝酸纖維素膜放入濃度為5%脫脂牛奶中，室溫振蕩2 h;洗滌后，將硝酸纖維素膜放入合理稀釋后的Ⅰ抗溶液中4℃過夜;洗滌后，將硝酸纖維素膜放入合理稀釋后的Ⅱ抗溶液中室溫振蕩1 h;洗滌后，將化學(xué)發(fā)光液試劑均勻涂于硝酸纖維素膜，放入X光片夾中于暗室曝光;將X光片顯影、定影;應(yīng)用數(shù)字凝膠成像系統(tǒng)拍照，將目的蛋白條帶的灰度值與內(nèi)參照的灰度值做比較，計(jì)算相對(duì)灰度值。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 實(shí)驗(yàn)大鼠行為學(xué)和腦電圖變化

對(duì)照組大鼠術(shù)后無抽搐發(fā)作行為，KA致癇各組在注射KA 15 min內(nèi)出現(xiàn)咀嚼、點(diǎn)頭等面頸部肌肉的抽搐及單側(cè)或雙側(cè)前肢、后肢陣攣樣運(yùn)動(dòng)。對(duì)照組大鼠腦電圖表現(xiàn)為基礎(chǔ)波，KA致癇大鼠腦電圖描記到陣發(fā)性或叢集性高幅多棘、多尖波。單寧酸干預(yù)組大鼠與KA致癇組大鼠行為學(xué)及腦電圖未表現(xiàn)出明顯差別，見圖1。

Figure 1.Features of electroencephalogram in different experimental rats.A:slow waves in control group rats;B:rapid waves with high frequency charges in KA treatment rats;C:rapid waves with high frequency charges in gallotannin and KA treatment rats.圖1 各組實(shí)驗(yàn)大鼠腦電圖特征

2 PARG調(diào)節(jié)癲癇大鼠PAR表達(dá)

對(duì)照組大鼠海馬組織核蛋白中PAR表達(dá)較低(0.04±0.01)，KA致癇6 h組大鼠海馬組織中的PAR表達(dá)顯著增加(0.24±0.03)(P＜0.05);PARP抑制劑3－AB干預(yù)組中PAR表達(dá)減少(0.13±0.02)，PARG抑制劑單寧酸干預(yù)組中 PAR水平(0.36±0.04)顯著增高(P ＜0.05)，見圖2。

Figure 2.Effect of gallotannin(GT)on PAR expression in rat hippocampus after seizures.±s.n=6.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs KA.圖2 單寧酸對(duì)癲癇發(fā)作大鼠海馬PAR表達(dá)的影響

3 抑制PARG減輕癲癇大鼠海馬神經(jīng)元損傷

Nissl染色顯示，海馬CA1和CA3區(qū)錐體神經(jīng)元存活數(shù)目KA致癇72 h組(46.13±5.12和63.34±8.11)較對(duì)照組(86.25±8.67和125.36±13.74)明顯減少(P＜0.05)。KA+GT干預(yù)組(67.75±7.58和95.84±10.92)存活神經(jīng)元數(shù)目較KA致癇組顯著增加(P＜0.05)，見圖3。

4 抑制PARG減少癲癇大鼠海馬線粒體AIF的核轉(zhuǎn)位

對(duì)照組大鼠海馬組織核蛋白中僅可檢測到微弱的AIF表達(dá)(0.09±0.02)，KA致癇24 h組大鼠海馬組織核蛋白中的AIF的含量明顯增加(0.69±0.11，P＜0.05)，單寧酸干預(yù)以后，核蛋白中AIF含量顯著減少(0.35±0.08);與之對(duì)應(yīng)，KA致癇24 h組大鼠海馬組織線粒體蛋白中的AIF的含量(0.31±0.06)較對(duì)照組(1.12±0.14)減少(P＜0.05)，單寧酸干預(yù)以后，線粒體蛋白中 AIF含量(0.76±0.11)較KA致癇24 h組增加(P＜0.05)，見圖4。

Figure 3.Gallotannin attenuated hippocampal cell death after seizures(Nissl staining，× 200).A，C，E:CA3 subfield;B，D，F(xiàn):CA1 subfield.A，B:control;C，D:KA;E，F(xiàn):KA+GT.圖3 單寧酸減少癲癇大鼠海馬神經(jīng)元的死亡

Figure 4.Effect of GT on AIF translocation from mitochondria to nucleus in hippocampus after seizures.±s.n=6.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs KA.圖4 單寧酸對(duì)癲癇大鼠海馬線粒體AIF細(xì)胞核轉(zhuǎn)位的作用

5 抑制PARG減少癲癇大鼠海馬組織中IL－1β和TNF－α蛋白的表達(dá)

對(duì)照組大鼠海馬組織中僅有較弱的IL－1β和TNF－α蛋白表達(dá)(0.12±0.02和0.17±0.02)，KA致癇24 h組大鼠海馬中的IL－1β和TNF－α蛋白的表達(dá)(0.95±0.11和0.93±0.13)明顯增加(P＜0.05);單寧酸干預(yù)后，IL－1β和TNF－α蛋白表達(dá)(0.45±0.07和0.39±0.07)明顯降低(P＜0.05)，見圖5。

Figure 5.Effect of GT on IL－1β and TNF－α protein expression in hippocampus after seizures.±s.n=6.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs KA.圖5 單寧酸對(duì)癲癇大鼠海馬IL－1β與TNF－α表達(dá)的作用

討 論

聚腺苷二磷酸核糖基化是細(xì)胞內(nèi)一種重要的蛋白修飾方式，PARP催化合成不同分子量的PAR以共價(jià)鍵方式與靶蛋白結(jié)合，參與DNA修復(fù)、細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)等生理過程［1］。目前，PARP介導(dǎo)的細(xì)胞死亡也被稱為parthanatos(PARP－1－mediated cell death)，被認(rèn)為是不同于壞死、凋亡、自嗜的細(xì)胞死亡形式，它與AIF從線粒體釋放移位到細(xì)胞核有關(guān)［9］。我們先前的研究也證實(shí)了調(diào)節(jié)AIF信號(hào)通路是PARP抑制劑在癲癇致神經(jīng)損傷過程中發(fā)揮保護(hù)作用的重要機(jī)制之一［5］。目前，PAR被認(rèn)為是調(diào)節(jié)parthanatos的重要信號(hào)分子，在細(xì)胞核內(nèi)合成的PAR可轉(zhuǎn)移到細(xì)胞漿作用于線粒體從而誘發(fā)AIF的釋放。最新研究發(fā)現(xiàn)，AIF蛋白本身不僅含有DNA結(jié)合位點(diǎn)，還含有PAR結(jié)合的特異性位點(diǎn)，若PAR結(jié)合位點(diǎn)喪失，AIF蛋白則不再被PARP調(diào)節(jié)［10］。

PARG在細(xì)胞中存在110 kD和60 kD 2種異構(gòu)體，前者主要表達(dá)于細(xì)胞核，與PARG活性關(guān)系密切［11］。研究發(fā)現(xiàn)，抑制PARG活性具有一定的細(xì)胞保護(hù)作用，這很可能與減慢細(xì)胞PAR降解速度，減少細(xì)胞能量消耗有關(guān)［8］。此外，PARG還參與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平，而細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)與AIF介導(dǎo)的細(xì)胞死亡密切相關(guān)［1］。最新的研究發(fā)現(xiàn)，PARG可調(diào)節(jié)瞬時(shí)受體電位通道2引起的細(xì)胞鈣超載及AIF介導(dǎo)的細(xì)胞死亡［12］。抑制PARG能降低細(xì)胞內(nèi)二磷酸腺苷核糖水平，阻斷瞬時(shí)受體電位通道2介導(dǎo)的細(xì)胞鈣信號(hào)及AIF核轉(zhuǎn)位，最終減輕細(xì)胞的損傷［12］。不過也有研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞敲除PARG基因后，DNA損傷加重，在紫外線損傷下發(fā)生 AIF介導(dǎo)的細(xì)胞死亡［13］。本研究提示，PARG抑制劑單寧酸可顯著減輕癲癇發(fā)作造成的大鼠海馬神經(jīng)元損傷，而且單寧酸的神經(jīng)保護(hù)作用部分與阻斷AIF信號(hào)通路有關(guān)。

癲癇發(fā)作可引起腦組織出現(xiàn)明顯的炎癥反應(yīng)，腦內(nèi)注射針對(duì)IL－1β受體拮抗劑表現(xiàn)出明顯的抗驚厥及神經(jīng)元保護(hù)作用，炎癥因子被認(rèn)為與癲癇的發(fā)生頻率、神經(jīng)元存活及膠質(zhì)細(xì)胞增生關(guān)系密切［6，14］。研究已證實(shí)，PARP 可調(diào)節(jié) IL－1β、TNF－α等核轉(zhuǎn)錄因子κB依賴性的基因轉(zhuǎn)錄［2］。我們的研究也發(fā)現(xiàn)，抑制PARP活性可減少癲癇大鼠海馬組織核轉(zhuǎn)錄因子κB相關(guān)的IL－1β和環(huán)氧化酶2的表達(dá)［4］。另外，研究也提示PARG參與調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，在脊髓損傷中，抑制PARG可抑制白細(xì)胞浸潤及多種炎癥因子的表達(dá)［7］。PARG抑制劑單寧酸可調(diào)節(jié)激活蛋白1及分裂原活化蛋白激酶介導(dǎo)的炎癥信號(hào)［15］。本研究也提示，單寧酸可調(diào)節(jié)癲癇大鼠海馬組織IL－1β、TNF－α表達(dá)，這很可能也是其發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的重要機(jī)制之一。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)，PARG參與大鼠癲癇致神經(jīng)元損傷過程，單寧酸可明顯減輕癲癇后大鼠海馬神經(jīng)元損傷，參與調(diào)節(jié)AIF由線粒體向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)位及IL－1β、TNF－α的表達(dá)，提示PARG很可能是參與癲癇致神經(jīng)元損傷的重要機(jī)制之一。

［1］ Malanga M，Althaus FR.The role of poly(ADP－ribose)in the DNA damage signaling network［J］.Biochem Cell Biol，2005，83(3):354－364.

［2］ Kauppinen TM.Multiple roles for poly(ADP－ribose)polymerase－1 in neurological disease［J］.Neurochem Int，2007，50(7－8):954－958.

［3］ 朱鐵年，趙瑞景，凌亦凌.多聚(ADP－核糖)聚合酶與細(xì)胞損傷［J］.中國病理生理雜志，2002，18(1):104－107.

［4］ 王勝軍，遲兆富，王樹華，等.PARP調(diào)節(jié)癲癇大鼠海馬轉(zhuǎn)錄因子κB及相關(guān)炎癥因子的表達(dá)［J］.中國病理生理雜志，2010，26(1):86－90.

［5］ Wang SJ，Wang SH，Song ZF，et al.Poly(ADP－ribose)polymerase inhibitor is neuroprotective in epileptic rat via apoptosis inducing factor and Akt signaling［J］.Neuroreport，2007，18(12):1285－1289.

［6］ Vezzani A，Moneta D，Richichi C，et al.Functional role of inflammatory cytokines and antiinflammatory molecules in seizures and epileptogenesis［J］.Epilepsia，2002，43(Suppl 5):30－35.

［7］ Cuzzocrea S，Genovese T，Mazzon E，et al.Poly(ADP－ribose)glycohydrolase activity mediates post－traumatic inflammatory reaction after experimental spinal cord trauma［J］.J Pharmacol Exp Ther，2006，319(1):127－138.

［8］ Lu XC，Massuda E，Lin Q，et al.Post－treatment with a novel PARG inhibitor reduces infarct in cerebral ischemia in the rat［J］.Brain Res，2003，978(1－2):99－103.

［9］ Wang Y，Dawson VL，Dawson TM.Poly(ADP－ribose)signals to mitochondrial AIF:a key event in parthanatos［J］.Exp Neurol，2009，218(2):193－202.

［10］ Wang Y，Kim NS，Haince JF，et al.Poly(ADP－ribose)(PAR)binding to apoptosis－inducing factor is critical for PAR polymerase－1－dependent cell death(parthanatos)［J］.Sci Signal，2011，4(167):ra20.

［11］ Cortes U，Tong WM，Coyle DL，et al.Depletion of the 110－kilodalton isoform of poly(ADP－ribose)glycohydrolase increases sensitivity to genotoxic and endotoxic stress in mice［J］.Mol Cell Biol，2004，24(16):7163－7178.

［12］ Blenn C，Wyrsch P，Bader J，et al.Poly(ADP－ribose)glycohydrolase is an upstream regulator of Ca2+fluxes in oxidative cell death［J］.Cell Mol Life Sci，2011，68(8):1455－1466.

［13］ Zhou Y，F(xiàn)eng X，Koh DW.Activation of cell death mediated by apoptosis－inducing factor due to the absence of poly(ADP－ribose)glycohydrolase［J］.Biochemistry，2011，50(14):2850－2859.

［14］ Turrin NP，Rivest S.Innate immune reaction in response to seizures:implications for the neuropathology associated with epilepsy［J］.Neurobiol Dis，2004，16(2):321－334.

［15］ Erdèlyi K，Kiss A，Bakondi E，et al.Gallotannin inhibits the expression of chemokines and inflammatory cytokines in A549 cells［J］.Mol Pharmacol，2005，68(3):895－904.