隋小芳，王鳳玲，黃佳濱

（佳木斯大學附屬第一醫(yī)院 老年病科，黑龍江 佳木斯154002）

肺癌是當今世界各國最常見的惡性腫瘤之一。其發(fā)病數(shù)與死亡數(shù)成明顯上升趨勢 ，已成為嚴重威脅人民生命健康主要惡性腫瘤。肺癌的發(fā)生是一個復雜的生物學過程，有著多種因素參與其復雜的多步驟生物學變化，在其發(fā)生和發(fā)展過程中涉及基因遺傳信息的改變。因此，必須從本質上闡述其病因和發(fā)病機制，從分子機理的防治水平著手，表觀遺傳學機制具有重要作用［1］。DNA甲基化是基因遺傳信息的改變的最重要因素，是一種表觀遺傳修飾方式，基因異常甲基化抑制基因轉錄與胚胎發(fā)育和腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中很多因子發(fā)生了異常的變化，他們在腫瘤的進展中扮演了很重要的角色，因此要明確腫瘤的發(fā)病機理就應當深入的研究這些重要因子異常變化的臨床意義。在NSCLC發(fā)生發(fā)展中抑癌基因5′－CpG島甲基化較頻繁，并在腫瘤早期就可檢測到較多的異常甲基化，因此檢測該種基因異常甲基化為NSCLC早期診斷和干預治療提供了新的靶點，展現(xiàn)了良好的前景。CDH13正是肺癌的一個抑癌基因，其基因發(fā)生異常甲基化，抑制了基因的轉錄水平，組織中CDH13表達下調，其基因甲基化和蛋白表達下調參與了肺癌的發(fā)生發(fā)展過程，是肺癌發(fā)生發(fā)展的一個重要因素。本研究中DNA甲基化的檢測方法主要有三大類［2］：本實驗應用了 MSP方法，本實驗通過監(jiān)測CDH13蛋白在組織中表達和其基因異常甲基化的觀察，研究了CDH13因子與肺癌發(fā)生發(fā)展過程的相關性，是否存在甲基化及其甲基化率的臨床意義，明確CDH13的表達水平與該基因甲基化的相關性，將有可能更加全面真實地揭示肺癌的進而為研究肺癌的發(fā)生、發(fā)病機制提供科學理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床資料 ①實驗組：非小細胞肺癌標本40例，取自佳木斯大學附屬第一醫(yī)院2009年10月－2010年10月間肺癌患者手術切除的標本。所有患者術前均未接受過放療或化療，病理診斷為肺癌，按組織學類型分為鱗癌13例、腺癌27例。肺癌患者年齡為20－75歲，中位年齡為65.5歲。標本取自肉眼可見腫瘤區(qū)（未壞死）。

②對照組1：癌旁正常肺組織40例，取距離同一實驗組腫瘤組織邊緣5cm以上的遠癌正常肺組織為對照。③對照組2：良性病變肺組織15例，組織標本取自佳木斯大學第一附屬醫(yī)院胸外科2009年10月一2010年10月間5例肺結核球、8例支氣管擴張、2例肺錯構瘤患者手術切除的肺組織。

1.1.2 標本的采集及處理 肺組織標本為肺葉切除離體后30min內迅速切取的癌組織的標本，并取距離腫瘤組織邊緣5cm以上的遠癌正常肺組織為對照、分裝、液氮速凍、－80℃低溫保存。

1.1.3 主要試劑和儀器 試劑：Trizol試劑、甲基化DNA轉化試劑盒、Tris堿 、Tap DNA聚合酶等實驗所需試劑均購自上海生工生物工程技術服務有限公司。CDH13甲基化引物上游引物：5’TCGCGGGGTTCGTTTTTCGC－3’；下游引物：5’－GACGTTTTCATTCATACACGCG－3’；CDH13未甲基化引物上游引物：5’－TTGTGGGGTTTGTTTTTTGT－3’，下游引物：5’－AACTTTTCATTCATACACACA－3’。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。主要實驗儀器：TGL－20M高速臺式冷凍離心機、TGradient PCR儀、北京市六一儀器廠DYY－Ⅲ－BB穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、超凈臺－80度冰箱、凝膠成像系統(tǒng)和配套軟件、電熱恒溫水溫箱 核酸／蛋白定量分光光度計 液氮罐等。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取標本中基因組DNA的提取取負80℃冷凍組織塊，大小約為0.2cm3盡量切碎后放入1.5ml的離心管中，加入180μl的ATL緩沖液，用研磨棒仔細研磨；加入等體積的PBS磷酸鹽緩沖液，充分混勻后12 000rpm，離心5min，棄上清；加1%SDS 40μl，400μl STE，1蛋白酶－K 10 μl（10mg／ml）；37℃水浴6h以上或者過夜，然后加入2μl RNA酶，37℃孵育1h；加入等體積飽和酚，搖勻。12 000rpm離心5min，用吸管吸上層液體放入另一1.5ml離心管；避免吸入蛋白層；在上清液中加入酚：氯仿：異戊醇（25∶24∶1），混勻。12 000rpm離心5min，吸上層放入另一1.5ml離心管；向上清液加如氯仿：異戊醇（24∶1），搖勻10 min，12 000rpm離心5min，取上清入另一管；加1／12體積醋酸鈉，3倍體積的冷卻后的無水乙醇，輕柔搖勻；出現(xiàn)白色絮狀物（DNA）；20℃放置25 min，12 000rpm低溫離心10min，使DNA沉淀，棄去上清；加1ml 70%乙醇洗滌，12 000rpm 低溫（4℃）離心10min，去上清，重復1次；自然干燥后，加無菌去離子水500μl，充分溶解用pH8.0TE溶解，紫外分光光度儀分別在260nnl和280mn測定其吸光度值。DNA的純度以A260／A280的比值計算，所抽提的 DNA 如 OD260／0D280介于1.7、2.0之間，則保存在－20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 DNA甲基化修飾 按照DNA甲基化檢測試劑盒的說明對標本基因組DNA模板進行修飾操作。

先配制轉化緩沖液（CVB）：加800μl dd水，100μl活化劑（ACS）和100μl穩(wěn)定劑（STS）制成轉換緩沖液（CVR）在渦旋混合儀上劇烈混合直到CVR徹底溶解，室溫孵育10min。CVB－20℃保存，1個月有效。使用前渦旋混合確保無沉淀。配制平衡緩沖液（EQB）：加30ml 96－100%乙醇到20ml緩沖液中，室溫保存。配制脫硫緩沖液（DSB）：加6ml 96%－100%乙醇到緩沖液中，室溫保存。以下所有離心操作條件都是室溫下≥10，000g離心1min。10μl DNA樣品中加入90μl的轉化緩沖液（CVB），徹底混合；92℃孵育10min，然后64℃孵育2.5h；在樣品中加600μl平衡緩沖液（EQB），徹底混合；使用分離柱，離心處理，丟棄濾過液；分離柱中加入200μl平衡緩沖液（EQB），離心；然后于分離柱中加入200μl脫硫緩沖液（DSB）；室溫孵育15－20min，離心；離心后在 分離柱中加入200μl平衡緩沖液（EQB），再次離心，丟棄濾過液；離心，將分離柱放入1.5ml的離心管；分離柱中加入20μl of洗脫緩沖液 （TE），孵育1min，離心，－20℃儲存洗脫液。洗脫DNA－20℃可穩(wěn)定保存3個月。

1.2.3 CDH13基因的甲基化擴增（MSP） 應用PCR擴增儀按照下面的循環(huán)條件擴增：DNA合成和預變性1個循環(huán)：92℃10min，PCR擴增40個循環(huán)：94℃15s，50℃15s，70℃35s，終延伸1個循環(huán)72℃10min。擴增結束后，取10微升擴增產(chǎn)物與1微升6×loading Buffer混合后，在1%的瓊脂糖凝膠上電泳，溴化乙啶染色，用天能GIS凝膠圖像系統(tǒng)進行拍照分析。見圖1。

圖1

1.3 實驗結果判定

實驗結果判定：甲基化陽性：樣品擴增出CDH13M（甲基化）相應長度（243bP），但是未擴增出CDH13U（未甲基化）相應長度的片段，則判斷該樣品啟動子區(qū)5’CpG島甲基化陽性。甲基化陰性：樣品未擴增出CDH13M（甲基化）相應長度（243 bP），但擴增出CDH13U（未甲基化）相應長度的片段，則判斷該樣品啟動子區(qū)5’CpG島甲基化陰性。

1.4 統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據(jù)，采用方差齊性分析、兩樣本t檢驗，數(shù)據(jù)處理均用SPSS17.0軟件完成，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 在40例肺癌組織中發(fā)生CDH13基因異常甲基化的共13例，陽性率為32.5%，在40例癌旁正常組織中：發(fā)生CDH13基因異常甲基化的共3例，陽性率為7.5%，在15例肺良性病變切除肺組織中：發(fā)生CDH13基因異常甲基化的共1例，陽性率為6.7%，應用χ2檢驗，P＜0.05在統(tǒng)計學上有顯著性差別，見表1。

表1 癌組織、對照組1和對照組2CDH13基因異常甲基化水平

2.2 在40例肺癌組織標本中CDH13基因異常甲基化率在患者的年齡大小、性別、有無吸煙史及TNM分期上的差異，無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；CDH13基因異常甲基化率在腺癌中明顯高于鱗癌中的異常甲基化率，具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），具體見表2。

表2 CDH13在癌組織中的基因異常甲基化率在患者年齡大小、性別、吸煙史、病理類型和TNM分期上的差異性

2.3 CDH13基因異常甲基化和CDH13的表達水平呈負相關性（r＝－0.520）。

2.4 CDH13基因啟動子區(qū)5’CpG島甲基化陽性率在肺癌組織中顯著高于癌旁組織和非肺癌良性肺切除組織，CDH13基因啟動子區(qū)5’CpG島甲基化導致了CDH13的表達下調。

3 討論

肺癌在發(fā)生發(fā)展過程中存在抑癌基因的失活［3］，近年來研究發(fā)現(xiàn)［4，7］，在腫瘤的發(fā)生過程中，除去DNA序列的改變之外，表觀遺傳學在腫瘤的發(fā)生過程中也有重要的作用，因此表觀遺傳學的研究逐漸成為研究的方向，其中DNA甲基化作為表觀遺傳學的重要內容，成為近年來腫瘤分子病因學的研究熱點。在細胞基因的表達調控中起著關鍵的作用，實驗證實在腫瘤細胞廣泛存在著DNA啟動子區(qū)域的異常甲基化［5］。其中抑癌基因大多數(shù)為過度甲基化，引起基因遺傳學的變化從而轉錄抑制，導致抑癌基因失活，蛋白表達受到抑制。相對于抑癌基因的過度甲基化，癌基因大部分是不全甲基化，致使其重新開放或異常表達。近來研究顯示在肺癌患者中基因啟動子發(fā)生甲基化現(xiàn)象非常普遍，部分腫瘤相關基因甲基化是肺癌診斷、分期及治療預后特異性較強的標識物［6］。所以DNA甲基化現(xiàn)在已經(jīng)成為表觀基因組學和表觀遺傳學的重要研究內容。

CDH13是一個獨特的鈣黏蛋白細胞黏附分子，在腫瘤發(fā)生的啟動和進展過程中起到重要作用。本實驗40例癌組織中CDH13蛋白的表達明顯低于癌旁組織和和良性病變肺組織，癌旁組織和良性病變組織的CDH13表達正常，說明在肺癌的發(fā)生發(fā)展中CDH13蛋白表達發(fā)生了下調或者缺失，也進一步提示CDH13是一種抑癌基因。

本實驗采用MSP法檢測CDH13基因在肺癌、癌旁組織及良性病變肺組織基因啟動子區(qū)5’CpG島甲基化情況，在40例肺癌癌組織中有13例發(fā)生了甲基化，甲基化率為32.5%，在癌旁組織和良性病變肺組織中沒有發(fā)現(xiàn)基因的甲基化，差異有統(tǒng)計學意義。在13例甲基化癌組織中年齡＜60歲的有4例，年齡＞60歲的有9例，有吸煙史者8例，沒有吸煙史的5例，男性8例，女性5例，腺癌12例，鱗癌1例，TNM分期Ⅰ期5例Ⅱ期8例，腺癌的甲基化發(fā)生率遠遠大于鱗癌的甲基化率 且有統(tǒng)計學意義，隨著年齡的增長，長期吸煙史，腫瘤的遠處轉移CDH13基因甲基化率有增加的趨勢。

本實驗中發(fā)現(xiàn)在CDH13基因異常甲基化陽性的肺癌組織標本中CDH13的表達量下調明顯，CDH13正常表達的癌旁組織和非肺癌良性病變切除組織不存在基因異常甲基化，提示CDH13基因甲基化率的增高和CDH13在組織中的表達下調密切相關，并且和腫瘤的發(fā)生和發(fā)展息息相關。通過相關分析得出兩者呈負相關性，推測CDH13基因異常甲基化導致了CDH13表達水平下降，并且基因異常甲基化和蛋白水平的下降共同參與了肺癌的發(fā)生和發(fā)展。

本實驗研究證明CDH13具有抑制腫瘤的發(fā)生、抑制腫瘤細胞的轉移、減緩腫瘤的進展作用。提示CDH13基因甲基化導致肺癌組織中CDH13蛋白表達下降，促進了肺癌的發(fā)生和發(fā)展。因此CDH13基因異常甲基化可以作為肺癌的治療的新靶點。期望CDH13能夠成為肺癌治療的新的靶點，為肺癌的治療開辟新的領域。

［1］Toyook AS，Tokumo M，SHI Gematsu H，et al.Mutational ande PigeneticEvidence for independent pathways for lungadenoearcinomas arising in smokersAnd never Smokers［J］.CaneerRes，2006，66（3）：1372－1375.

［2］Zhou SX.Matsuyoshi N.Liang SB.et al.Expression of T－Cadherin in Basal Keratinocytes of Skin［J］.J Invest Dermatol，2002.118：1 0804.

［3］Hibi K，Koshikawa K，Inoue S，et al.Frequent promoter methylation and gene sileneing of CDH13in panereatic cancer［J］.Cancer SCi，2004，95（7）：588.

［4］Chung JH，Lee HJ，Kim BH，et al.DNA methylation profile during multistage progression of pulmonary adenocarcinomas［J］.Virchows Arch.2011，15.

［5］Leong KJ，Wei W，Tannahill LA，et al.Methylation profiling of rectal cancer identifies novel markers of early－stage disease［J］.Br J Surg，2011，98（5）：724.

［6］Ren JZ，Huo JR Correlation between T－cadherin gene expression and aberrant methylation of T－cadherin promoter in human colon carcinoma cells［J］.Med Oncol，2011，5.

［7］Zhang Y，Wang R，Song H，et al.Methylation of multiple genes as a candidate biomarker in non－small cell lung cancer［J］.Cancer Lett，2011，303（1）：21.