吳正正 嚴 京 高健生 接傳紅 陳皆春

糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetes retinopathy，DR）是糖尿病常見及嚴重并發(fā)癥之一，嚴重影響著糖尿病患者的生活質量，目前有關DR的發(fā)病機制尚未完全闡明，各種治療方法尚不理想。從中醫(yī)藥中尋求有效防治DR的藥物及方法是目前的研究熱點。本研究所采用的密蒙花方，是導師高健生研究員多年臨證總結的有效防治DR的經(jīng)驗方。前期研究已證實其具有抑制細胞增殖的作用〔1〕，本實驗擬進一步從密蒙花方對缺氧狀態(tài)下人血管內皮細胞細胞周期的影響來探討其抑制細胞增殖、阻止新生血管發(fā)生的具體作用機制。

1 材料及方法

1.1 材料

1.1.1 試劑：RPMⅠ1640培養(yǎng)基干粉購自美國GⅠBCO公司；二氯化鈷、胰蛋白酶購自SⅠGMA公司；胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司。雙抗為南京凱基科技發(fā)展有限公司產品。

1.1.2 細胞來源：人臍靜脈血管內皮細胞（human umbilical vascular endothelial cell，HUVEC）株購自南京凱基科技發(fā)展有限公司。

1.1.3 中藥來源：購自北京燕北藥材公司，經(jīng)我院藥房鑒定為道地藥材。生黃芪（產于內蒙古），女貞子、益母草（產于河北），黃連（產于四川），肉桂（產于廣東），密蒙花（產于湖北）。

1.1.4 實驗儀器：二氧化碳培養(yǎng)箱（NAPCO公司），超凈工作臺（北京月壇儀器廠），倒置相差顯微鏡（奧林巴斯），流式細胞儀（美國BD公司）。

1.2 方法

1.2.1 HUVEC細胞培養(yǎng)：取HUVEC細胞株，采用胰蛋白酶（0.25%）消化法在 37℃下5%CO2二氧化碳培養(yǎng)箱中進行細胞培養(yǎng)，待細胞長滿融合后按1∶3分瓶傳代。

1.2.2 密蒙花方水提液制備：密蒙花方所含中藥材沸水浴煎30 min，過濾并收集濾液，取濾渣重復提取1次，合并2次濾液。加入2倍體積90%乙醇4℃過夜，離心去除乙醇不溶成分。定容至濃度為1 g/ml水提液。微孔濾膜濾過滅菌。

1.2.3 實驗分組：每組設6個平行樣本。①空白組：RPMⅠ1640維持液；②缺氧組：空白組 ＋終濃度100 μmol/L CoCl2；③密蒙花方低濃度組：缺氧組＋10 mg/ml密蒙花方水提液；④密蒙花方中濃度組：缺氧組＋20 mg/ml密蒙花方水提液；⑤密蒙花方高濃度組：缺氧組＋40 mg/ml密蒙花方水提液。

1.2.4 流式細胞儀（flow cytometer，F(xiàn)CM）檢測密蒙花方對HUVEC細胞周期的影響：①將細胞接種于50ml培養(yǎng)瓶中，根據(jù)上述實驗分組將CoCl2和不同濃度的密蒙花方水提液分別與HUVEC共同孵育24 h后消化收集細胞。②將預冷的70%乙醇沿壁緣滴入，輕輕吹打細胞，4℃固定12 h以上。③離心（1 000 r/min，4 min），PBS 洗 2 次，棄上清。 ④加入濃度為 1 mg/ml RNaseA 30 μl，37℃恒溫水浴鍋中孵育30 min。 ⑤加入碘化丙啶（propidium iodine，PⅠ）染色液800 μl，4℃避光30 min。⑥FCM測定DNA含量，所有資料經(jīng)軟件Modfit 3.0分析。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 培養(yǎng)的HUVEC形態(tài)學觀察

倒置顯微鏡下觀察可見，HUVEC貼壁生長，呈鋪路石狀鑲嵌排列。細胞為扁平多角形，胞質透明，胞漿豐富，胞體肥大，胞膜清晰。細胞核為圓形或橢圓形。傳代培養(yǎng)時約30 min開始貼壁生長。剛貼壁的細胞呈圓形，逐漸轉變?yōu)槎嘟切位蛩笮?，細胞間相互連接。約2～3 d后，細胞可長滿融合，呈緊密排列的單層上皮細胞。缺氧組鏡下觀察：細胞在缺氧狀態(tài)下較正常細胞增殖旺盛。密蒙花方組鏡下觀察：細胞生長受到抑制，細胞間隙增大，部分區(qū)域脫落，可見部分死細胞（圖1）。

2.2 FCM檢測密蒙花方對HUVEC細胞周期的影響

與正常組比較，缺氧組G0/G1期細胞比例減少，S期細胞比例增高（P＜0.01），說明缺氧狀態(tài)下HUVEC增殖旺盛。與缺氧組比較，各密蒙花方組均表現(xiàn)為G0/G1期細胞比例增高，S期細胞比例減少（P＜0.01），說明密蒙花方使缺氧狀態(tài)下的細胞阻滯于G0/G1期，具有抑制HUVEC增殖的作用。隨密蒙花方濃度的增高，G0/G1期細胞比例逐漸增高，S期細胞比例則逐漸下降（P＜0.01），具有量效關系。其中40 mg/ml密蒙花方作用最顯著（表1，圖2）。

經(jīng)FCM檢測，提示密蒙花方具有阻止HUVEC由G1期進入S期，從而抑制缺氧狀態(tài)下HUVEC增殖的作用。另外在密蒙花方作用24 h后，還出現(xiàn)了指示細胞凋亡的亞G1期凋亡峰，說明密蒙花方對缺氧狀態(tài)下HUVEC具有促凋亡作用。

表1 FCM檢測各組HUVEC細胞周期構成比較（±s，%）（每組樣本數(shù)=6）

表1 FCM檢測各組HUVEC細胞周期構成比較（±s，%）（每組樣本數(shù)=6）

注：FCM：流式細胞儀。①缺氧組與正常組比較，P＜0.01；②各密蒙花方組分別與缺氧組比較，P＜0.01；③密蒙花方中濃度與低濃度比較，P＜0.01；④密蒙花方高濃度與中濃度比較，P＜0.01。

G0/G1期 S期 G2/M期正常組 57.928±1.226 33.015±2.352 8.03±0.764缺氧組 46.165±2.748① 48.085±3.171① 7.12±0.810密蒙花方低濃度組 54.220±1.627② 32.437±1.181② 10.034±0.069密蒙花方中濃度組 59.872±2.226②③ 29.552±1.892②③ 10.212±0.165密蒙花方高濃度組 67.313±1.692②④ 26.757±1.365②④ 6.901±0.441

3 討論

密蒙花方是在密蒙花，交泰丸（黃連、肉桂）的基礎上加黃芪，女貞子等藥組成。黃芪大補元氣，女貞子補肝腎明目，黃連，肉桂相配使水火既濟，能安神寧血，密蒙花清肝火除翳膜，可入血絡退赤脈，諸藥相配伍，共奏益氣滋陰，和血明目的功效，臨床上治療DR的效果顯著〔2〕。本課題從細胞分子水平探討密蒙花方對血管內皮細胞細胞周期的影響，為臨床實踐提供科學依據(jù)。

在DR的病理過程中，新生血管形成是DR進入增殖期的標志。新生血管的發(fā)生發(fā)展是目前臨床上面臨的難題。如果能夠在某種程度上抑制新生血管的形成，將對于防治DR具有重要意義。

FCM是一種快速的單細胞定量分析方法，它利用分光光度法的原理，定量分析細胞的各種生物化學成分。細胞周期是細胞生命活動的基本過程，細胞增殖的調節(jié)最終發(fā)生在細胞周期水平上。細胞周期按時相順序依次進展至G1期（DNA合成前期）、S期（DNA合成期）、G2期（有絲分裂前期）和M期（有絲分裂期），最終出現(xiàn)細胞增殖。通過觀察細胞周期變化，有助于深入了解藥物對細胞增殖的影響。

正常增殖細胞存在不同DNA的含量，隨各時相呈現(xiàn)出周期性變化：在G1期，細胞開始RNA和蛋白質的合成，但DNA的含量仍保持二倍體；進入S期后，DNA開始合成，這時細胞核內DNA的含量介于G1和G2之間；當復制結束成為4倍體時，細胞進入G2期，G2期細胞繼續(xù)合成RNA及蛋白質，直到進入M期。單純從DNA含量無法區(qū)分G2期和M期；一旦細胞分裂成兩個子細胞，這兩個子細胞或者進入下一個細胞周期，或者進入靜止期（G0），而G0期從DNA含量上同樣無法與G1期區(qū)分。因此整個復制周期可以描繪為G0/G1期、S期、G2/M期。通過核酸染料標記DNA，并由FCM進行分析，可以得到細胞各個時期的分布狀態(tài)，計算出各期細胞的比例，以了解細胞的增殖能力。通常以S期細胞比率作為判斷細胞增殖狀態(tài)的指標。細胞周期進程中有兩個限制點，分別在G1/S轉變期和G2/M轉變期，也即在細胞增殖周期中存在許多稱作關卡（check-point）的監(jiān)控系統(tǒng)，當它探測到基因組或紡錘體損傷時，就會剎住細胞周期進展，使細胞停留在G1/S或G2/M轉變期，允許細胞進行損傷修復，以維持遺傳穩(wěn)定性〔3〕。

本實驗中密蒙花方低、中、高濃度是通過CCK-8法來確定的，三種濃度均可排除對細胞的毒性作用〔1〕。本實驗結果顯示：與正常組比較，缺氧組HUVEC G0/G1期細胞百分率下降，S期細胞百分率升高，說明缺氧組HUVEC增殖旺盛。10、20、40 mg/ml的密蒙花方分別作用于缺氧狀態(tài)下HUVEC 24 h后，與缺氧組比較，G0/G1期細胞比例升高，S期細胞比例降低，表明密蒙花方使缺氧狀態(tài)下的HUVEC阻滯于G1/S轉變期，從而抑制了細胞增殖。另外，密蒙花方作用于HUVEC 24 h后還出現(xiàn)了指示細胞凋亡的亞G1期凋亡峰，提示密蒙花方對缺氧狀態(tài)下的HUVEC有促凋亡作用。

本研究細胞周期分析揭示了密蒙花方對缺氧狀態(tài)下HUVEC細胞增殖的影響在于：（1）阻止細胞周期由G1期進入S期，且隨密蒙花方劑量提高，該作用越明顯；（2）密蒙花方還具有促進缺氧狀態(tài)下HUVEC凋亡的作用。這對于抑制視網(wǎng)膜新生血管發(fā)生，防治DR具有積極的意義。由于細胞凋亡和細胞周期變化受復雜的分子基因調控，詳細的調控機理尚待進一步研究。

[1]吳正正，高健生，接傳紅，等.密蒙花方對缺氧狀態(tài)下人血管內皮細胞的作用及機理研究[J].中國中醫(yī)眼科雜志，2008，18（3）：138-140.

[2]高健生，接傳紅，羅旭昇，等.交泰丸合密蒙花辨證治療早期糖尿病視網(wǎng)膜病變的新思路[J].世界中醫(yī)藥，2007，5（3）：143-144.

[3]王金發(fā).細胞生物學[M].科學出版社，2003：508-511.