李松林

1(淮陰工學(xué)院 生命科學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，江蘇 淮安，223003)

2(南京大學(xué) 淮安高新技術(shù)研究院，江蘇淮安，223003)

利用克氏螯蝦(Procambarus clarkii)生產(chǎn)1 t蝦仁約會(huì)產(chǎn)生5～6 t的下腳料——蝦殼［1］。蝦殼中含有20%～30%的甲克素，20% ～30%的蛋白質(zhì)等有機(jī)物，以及30% ～40%的鈣等無機(jī)物［2］。如果不對(duì)蝦殼進(jìn)行處理，既造成了資源的浪費(fèi)，又導(dǎo)致污染環(huán)境。食品蛋白質(zhì)經(jīng)過酶水解，可以在不影響營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的前提下提高或者改進(jìn)蛋白質(zhì)的功能特性［3］。水解產(chǎn)生的多肽不僅可以提高生物體對(duì)蛋白質(zhì)的進(jìn)一步消化吸收，而且可以獲得抗氧化活性肽。

自由基是有機(jī)體正常新陳代謝的產(chǎn)物，過量的自由基會(huì)引起脂質(zhì)的過氧化而導(dǎo)致嚴(yán)重的疾病，如癌癥、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和衰老等［4］。由于化學(xué)合成抗氧化劑可能具有潛在的毒性，因此人們更加關(guān)注天然抗氧化劑的開發(fā)與應(yīng)用［5］。本研究運(yùn)用Protamex蛋白酶對(duì)克氏螯蝦蝦殼進(jìn)行水解，對(duì)蝦殼蛋白肽(CSPH)的DPPH·清除能力，ABTS·+清除能力，OH·清除能力，還原能力和Fe2+螯合力進(jìn)行研究。同時(shí)對(duì)水解物的分子質(zhì)量分布與抗氧化性之間的關(guān)系進(jìn)行了探討。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

克氏螯蝦蝦殼，江蘇淮安盱眙縣;Protamex蛋白酶，南寧龐博生物工程有限公司;菲洛嗪，丹麥諾維信公司;DPPH(二苯代苦味?；杂苫?，GSH(谷胱甘肽)，ABTS［2，2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽］，美國Sigma-aldrich公司;其他試劑均為分析純。

HH-600數(shù)顯恒溫水浴鍋，UV752N紫外可見分光光度計(jì)，上海精科實(shí)業(yè)有限司;FreeZone 6L真空冷凍干燥機(jī)，美國Labconco公司;FA-2104N電子分析天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司;éppendorf 5430臺(tái)式高速離心機(jī)，艾本德中國有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蝦殼蛋白肽的制備工藝

蝦殼→干燥→研磨→蝦殼粉→脫脂蝦殼→堿提酸沉→離心→沉淀物真空冷凍干燥→蝦殼蛋白→酶解→滅酶(100℃水浴10 min)→離心(10 000 r/min，30 min)→上清液→濃縮→真空冷凍干燥→蝦殼蛋白肽

其中酶解條件為:酶∶底物=1∶500，蝦殼粉∶水=1∶7，溫度 55℃，pH7.0，時(shí)間 320 min。

1.2.2 蝦殼蛋白肽抗氧化功能評(píng)價(jià)

DPPH·清除能力測(cè)定［6］，ABTS·+清除能力的測(cè)定［7］，OH·清除能力的測(cè)定［8］，還原能力測(cè)定［9］，F(xiàn)e2+螯合力測(cè)定［10］。

1.2.3 水解物的分子質(zhì)量分布

采用高效凝膠滲透色譜法測(cè)定，色譜柱:TSK gel G2000 SWXL(7.8 mm×30 cm)。洗脫液:V(水)∶V(乙腈)∶V(三氟乙酸)=55∶45∶0.1)。柱溫為室溫，流速為0.5 mL/min。檢測(cè)波長(zhǎng):220 nm。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)樣品:Gly-Gly-Gly(189 Da)，Gly-Gly-Tyr-Arg(451 Da)，桿菌肽 (1450 Da)和細(xì)胞色素C(12 384 Da)。

2 結(jié)果與分析

2.1 還原力

還原力通常用來評(píng)價(jià)抗氧化劑作為電子供體提供電子或者氫原子的能力［6］。具有還原力的物質(zhì)可以減少脂質(zhì)過氧化反應(yīng)過程的氧化中間物［11］。如圖1所示，蝦殼蛋白肽的還原力隨著濃度的增加而增強(qiáng)，并且具有較好的線性關(guān)系(y=0.122 9x-0.035 6，R2=0.994 3，P ＜0.05)。Yang等人發(fā)現(xiàn)，金槍魚頭的蛋白水解物的還原力同樣隨著蛋白肽濃度的增加而增強(qiáng)，并具有良好的線性關(guān)系［12］。蝦殼蛋白肽在濃度為3.0 mg/mL時(shí)，吸光度值為0.33。Jia等人研究發(fā)現(xiàn)阿拉斯加鱈魚皮蛋白水解物在濃度為3.0 mg/mL 時(shí)，吸光度值為 0.2［13］。

圖1 蝦殼蛋白肽的還原能力

2.2 Fe2+螯合力

過渡態(tài)金屬，例如Fe2+，通過螯合作用可以延遲過氧化反應(yīng)，進(jìn)而阻止食品的酸?。?4］。如圖2所示，蝦殼蛋白肽Fe2+螯合力隨著濃度的增大而增大。在濃度為2 mg/mL時(shí)，蝦殼蛋白肽(CSPH)的螯合率為22.3%而EDTAD的螯合率則為79.9%。但是當(dāng)濃度值超過10 mg/mL時(shí)，兩者的螯合力趨于一致。Yaowapa等人通過研究證明圓竹莢魚蛋白的水解物同樣具有一定的螯合活力［15］。

圖2 蝦殼蛋白肽的Fe2+螯合能力

2.3 對(duì)DPPH·的清除能力

DPPH·清除實(shí)驗(yàn)被廣泛應(yīng)用于測(cè)定蛋白水解物的抗氧化性［16］。當(dāng)DPPH·遇到質(zhì)子供體時(shí)，例如具有抗氧化能力的物質(zhì)，自由基將被清除，同時(shí)吸光值下降［13］。如表1所示，對(duì)CSPH在不同濃度下的DPPH·清除活力進(jìn)行了測(cè)定，同時(shí)使用GSH作為自由基清除的對(duì)照。蝦殼蛋白肽的自由基清除活力隨著濃度的增加而增加，同時(shí)具有良好的線性關(guān)系(y=50.48x+7.027 3，R2=0.982 1，P ＜0.05)。Dong等人同樣發(fā)現(xiàn)了牡蠣肉蛋白肽的濃度與DPPH·清除活力之間具有線性關(guān)系［17］。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，GSH具有更強(qiáng)的清除自由基活力，其IC50=0.76 mg/mL，而蝦殼蛋白肽的IC50=0.85 mg/mL。這是由于GSH本身為強(qiáng)抗氧化劑。而蝦殼蛋白肽是由不同的多肽組合而成。其中某些分子質(zhì)量范圍的多肽可能具有較強(qiáng)的抗氧化性，然而其中可能還包括某些多肽只有較弱的抗氧化性，甚至不具有抗氧化性活力。

2.4 對(duì)ABTS+·的清除能力

對(duì)ABTS+·的清除能力以電子轉(zhuǎn)移和氫原子轉(zhuǎn)移為基礎(chǔ)，被廣泛應(yīng)用于評(píng)價(jià)抗氧化活力［18］。如表1所示，蝦殼蛋白肽濃度與ABTS+·的清除能力之間存在著線性增加的關(guān)系(y=47.6x+8.507 8，R2=0.986 8，P＜0.05)。與DPPH·清除能力相似，蝦殼蛋白肽的IC50(0.87 mg/mL)大于GSH的IC50(0.44 mg/mL)。與蝦殼蛋白肽相似，Zhu等人發(fā)現(xiàn)，小麥蛋白水解物的ABTS+·的清除能力同樣隨著蛋白肽的濃度增加而增加［19］。

2.5 對(duì)羥自由基(OH·)清除能力

OH·壽命較短，但具有較強(qiáng)的反應(yīng)性，只能與鄰近的分子發(fā)生反應(yīng)，對(duì)機(jī)體具有較大的危害性［20］。表1中比較了蝦殼蛋白肽和GSH在濃度0.2～1.2 mg/mL對(duì)OH·的清除能力。由表1可見，隨著濃度的增大，蝦殼蛋白肽和GSH對(duì)OH·清除能力均增大。在濃度相同時(shí)，二者對(duì)羥基自由基的清除能力存在顯著性差異(P＜0.05)。在濃度為1.0 mg/mL時(shí)，蝦殼蛋白肽的自由基清除能力為65.82%，而GSH則為79.16%。

2.6 蝦殼蛋白水解物分子質(zhì)量分布

分子質(zhì)量是反應(yīng)蛋白水解的重要參數(shù)，與蛋白水解物的生物活性密切相關(guān)［21］。Wang發(fā)現(xiàn)抗氧化性取決于水解物的分子質(zhì)量分布。如圖3和表2所示，92.79%的蝦殼蛋白水解物的分子質(zhì)量小于1 000 u。這說明水解物中包含了大量的低分子量多肽。這些低分子量多肽主要由分子質(zhì)量范圍在180～500 u的多肽組成(50.51%)。Sitthipong等報(bào)道了來源于虹色金線魚蛋白水解物的低分子量多肽具有較強(qiáng)的抗氧化能力。其中1個(gè)1.3 kDa的肽段展示出最強(qiáng)的ABTS自由基清除能力［22］，說明分子質(zhì)量對(duì)抗氧化性具有顯著的影響。

表1 蝦殼蛋白肽對(duì)DPPH·、ABTS+·和OH·的清除能力

圖3 蝦殼蛋白水解物的分子質(zhì)量分布

表2 蝦殼蛋白水解物的分子量分布

3 結(jié)論

蝦殼蛋白肽的還原能力和自由基清除能力隨肽濃度的增大而增大。Fe2+螯合力同樣與蛋白肽的濃度之間存在著量效關(guān)系，但是當(dāng)濃度達(dá)到10 mg/mL時(shí)，螯合力不再繼續(xù)增大。通過對(duì)蛋白肽的分子質(zhì)量分布進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，92.79%的多肽的分子質(zhì)量小于1 000 u，其中21.50%的多肽分子質(zhì)量小于180 u，50.51%的多肽分子量為180～500 u，20.78%的多肽分子質(zhì)量為500～1 000 u。

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