邱樂泉，王子超，陳 陽，董申華，鐘衛(wèi)鴻

（浙江工業(yè)大學(xué) 生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江 杭州 310032）

一株DEP降解菌的篩選及其休止細(xì)胞的降解特性

邱樂泉，王子超，陳 陽，董申華，鐘衛(wèi)鴻

（浙江工業(yè)大學(xué) 生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江 杭州 310032）

從杭州市河道污水出口的淤泥中篩選到一株鄰苯二甲酸二乙酯（DEP）降解菌HZ3，研究了該菌株的休止細(xì)胞對(duì)DEP的降解特性，結(jié)果表明：該休止細(xì)胞濃度為2×108～6×108cpu／mL，pH 7.0，30℃，180 r／min條件下，可在6 h內(nèi)將118 mg／L的DEP完全降解，37℃下的降解效率也無明顯差異，加入0.01 g／L Tween-80則對(duì)降解效率產(chǎn)生了一定的抑制.休止細(xì)胞對(duì)118～1 436 mg／L的DEP表現(xiàn)出較高的降解能力，而生長細(xì)胞則對(duì)1 062 mg／L的DEP無降解能力.

鄰苯二甲酸二乙酯；休止細(xì)胞；生物降解

鄰苯二甲酸酯類化合物（Phthalicacidesters，PAEs）是世界上廣泛使用的人工合成難降解有機(jī)化合物，主要用于塑料增塑劑、涂料、油漆等化工生產(chǎn)中.美國國家環(huán)保局（EPA）1999年公布的129種優(yōu)先污染物中包括了6種PAEs類化合物［1］，我國也已將其中的鄰苯二甲酸二正辛酯（DOP）、鄰苯二甲酸二乙酯（DEP）和鄰苯二甲酸二甲酯（DMP）列為環(huán)境優(yōu)先污染物［2］.已有證據(jù)表明：PAEs是一類環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，其最明顯的危害是使生殖機(jī)能下降，對(duì)動(dòng)物及人類生殖系統(tǒng)有一定損害，可引起睪丸萎縮、精子減少以及生殖細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變.且對(duì)胚胎發(fā)育有一定毒作用［3－4］.目前，PAEs在全球主要工業(yè)國的環(huán)境中已普遍檢出.在土壤、河流、湖泊、海洋底質(zhì)、飲用水、垃圾場(chǎng)乃至食品中都有檢測(cè)到PAEs的存在［5－6］.鄰苯二甲酸酯類化合物在環(huán)境中的水解、光解速率非常緩慢，屬于難降解物質(zhì).因此，微生物降解被認(rèn)為是自然環(huán)境中PAEs完全礦化的主要過程［7－8］.

生長細(xì)胞受到外界化學(xué)或物理作用后會(huì)相應(yīng)地發(fā)生變化，如基因表達(dá)、蛋白穩(wěn)定性的變化等［9］.而采用休止細(xì)胞則可以避免這種影響，利用微生物自身生長代謝產(chǎn)酶或誘導(dǎo)產(chǎn)酶的特點(diǎn)將微生物培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長末期，分離菌體并以一定的濃度懸于生理緩沖液中，此時(shí)微生物已經(jīng)基本停止生長代謝，但保持酶的活性，其主要優(yōu)點(diǎn)是反應(yīng)專一性強(qiáng)，可以提高底物轉(zhuǎn)化率，不易染雜菌，可以減少產(chǎn)物對(duì)菌體生長及酶合成的抑制［10］.為了獲得高效的鄰苯二甲酸酯降解菌株，有效解決鄰苯二甲酸酯類化合物的環(huán)境污染，筆者以DEP為模式化合物，從杭州河道污水出口的淤泥中分離出1株DEP降解菌HZ3，研究其休止細(xì)胞對(duì)DEP的降解特性.

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

DEP（99.5%，上海凌峰試劑有限公司），甲醇（色譜級(jí)，天津四友化工有限公司），其余試劑均為分析純.JEOL JEM-1230型透射電子顯微鏡（日本），Agilent1100高效液相色譜儀（美國）.

1.2 培養(yǎng)基

基礎(chǔ)無機(jī)鹽培養(yǎng)基：K2HPO4·3H2O 1.0 g／L，NaCl 1.0 g／L，（NH4）2SO40.5 g／L，MgSO4·7H2O 0.4 g／L，CaCl20.075 5 g／L，F(xiàn)eCl3·6 H2O 0.014 3 g／L，pH 7.0.

選擇培養(yǎng)基：每升無機(jī)鹽培養(yǎng)基加適量DEP的甲醇溶液，使DEP終質(zhì)量濃度為118 mg／L.

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母膏5 g，NaCl 10 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0，121℃滅菌20 min.

1.3 方 法

1.3.1 DEP降解菌的篩選

取杭州市河道污水出口處淤泥1 g置于100 mL水中，混勻，靜置，然后取1 mL加入到250 mL選擇培養(yǎng)基中，DEP初始質(zhì)量濃度為118 mg／L，30℃，180 r／min培養(yǎng)4 d，重復(fù)多次馴化.將有明顯生長的培養(yǎng)液稀釋涂布培養(yǎng)，同時(shí)測(cè)DEP降解情況，平板涂布法分離得到單菌落，觀察菌落形態(tài)并挑取單菌落做進(jìn)一步鑒定.

1.3.2 DEP降解菌的休止細(xì)胞的制備

將菌株接種到LB培養(yǎng)基，30℃，180 r／min培養(yǎng)到對(duì)數(shù)末期，4 000 r／min離心收集細(xì)胞，用無菌水洗1次，沉淀懸浮于pH 7.0的0.1 mol／L磷酸鉀緩沖液中，加入少量葡萄糖，制成菌懸液，使其菌體濃度約為2×108～6×108cpu／mL.

1.3.3 不同條件下休止細(xì)胞對(duì)DEP降解的影響

通過改變溫度、pH、DEP質(zhì)量濃度、休止細(xì)胞濃度及Tween-80等條件，考察不同降解條件下休止細(xì)胞對(duì)DEP降解的影響.

1.3.4 DEP檢測(cè)方法

取5 mL培養(yǎng)液，置于具塞試管中，加入等體積石油醚，劇烈振蕩，靜置2.5 h，取有機(jī)層測(cè)OD240，根據(jù)DEP標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算降解率.將上層有機(jī)相在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干后用1 mL甲醇定容，以20μL進(jìn)樣，進(jìn)一步用HPLC Agilent 1100 HPLC檢測(cè)，檢測(cè)條件：流動(dòng)相甲醇：H2O，90：10，流速1.0 mL／min，Hypersil BDS C18色譜柱，二極管陣列（DAD）檢測(cè)器，檢測(cè)波長240 nm，DEP保留時(shí)間為3.414 min.

2 結(jié)果與分析

2.1 DEP降解菌的篩選與分離

將經(jīng)過多次馴化后的菌液稀釋后涂布，挑取形態(tài)不同的9個(gè)單菌落接入選擇培養(yǎng)基進(jìn)一步檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示，菌株HZ3的降解效果最優(yōu)，在第1 d即可將DEP降解完全，而菌株HZ8，HZ9至第5 d仍未能完全降解DEP，故選取菌株HZ3作進(jìn)一步研究.菌株HZ3在固體選擇平板上形成的菌落呈圓形，凸起，濕潤有光澤，乳白色，不透明.通過透射電鏡觀察（圖2），菌株HZ3呈短桿狀，無鞭毛.大小約0.6μm×0.35μm.HPLC分析結(jié)果表明：培養(yǎng)24 h后，菌株HZ3已將118 mg／L DEP完全降解（圖3）.

圖1 DEP降解菌的篩選結(jié)果Fig.1 Screening results of DEP-degrading bacterium

2.2 溫度對(duì)休止細(xì)胞降解DEP的影響

采用休止細(xì)胞濃度為2×108～6×108cpu／mL，DEP初始質(zhì)量濃度為118 mg／L，30℃，180 r／min，不同溫度對(duì)休止細(xì)胞降解DEP的影響如圖4（a）所示，在37℃和30℃下DEP降解效率無明顯差異，在6 h均能快速有效完全降解DEP.

2.3 pH對(duì)休止細(xì)胞降解DEP的影響

圖4 溫度及pH對(duì)休止細(xì)胞降解DEP的影響Fig.4 Effects of temperature and pH on the DEP-degradation of resting cells

pH 4.0，5.0的降解體系采用 HAC-NaAC緩沖液，pH 6.0，7.0，8.0的降解體系采用 PB緩沖液，休止細(xì)胞濃度為2×108～6×108cpu／mL，DEP初始質(zhì)量濃度為118 mg／L，30℃，180 r／min，菌株HZ3的休止細(xì)胞降解DEP的影響如圖4（b）所示，pH 7.0時(shí)降解最快，6 h將DEP完全降解.而pH4.0及5.0時(shí)，2 h時(shí)DEP降解20%左右，但在2 h以后DEP幾乎不被降解.Walker等［11］曾對(duì)難降解有機(jī)物處理過程中產(chǎn)生的生物吸附作用進(jìn)行過研究與分析，認(rèn)為細(xì)菌在對(duì)污染物降解的同時(shí)對(duì)其有吸附作用，吸附作用可在幾分鐘到幾小時(shí)完成，而在降解過程中，這2種作用同時(shí)存在并相互影響，推測(cè)在pH 4.0與5.0條件下，2 h內(nèi)可降解20%，但其后則不再降解的現(xiàn)象可能與菌體對(duì)DEP的吸附有關(guān).

2.4 休止細(xì)胞濃度對(duì)DEP降解的影響

分別將休止細(xì)胞濃度調(diào)為0.4×108～1.2×108，0.8×108～2.4×108，1.2×108～3.6×108，1.6×108～4.8×108，2×108～6×108cpu／mL，其他降解條件為118 mg／L DEP，30 ℃，180 r／min，菌株HZ3的休止細(xì)胞降解DEP的影響如圖5（a）所示，休止細(xì)胞濃度為2×108～6×108cpu／mL略優(yōu)于濃度1.6×108～4.8×108cpu／mL的降解效率，在4 h已接近完全降解DEP.隨著菌液濃度的減少，降解效率也隨之降低，但均能在6 h完全降解DEP.

圖5 菌體濃度及Tween-80對(duì)休止細(xì)胞降解DEP的影響Fig.5 Effects of cell concentration and Tween-80 on the DEP-degradation of resting cells

2.5 Tween-80對(duì)休止細(xì)胞降解DEP的影響

添加表面活性劑，可以促進(jìn)DEP與水相形成微乳液，提高傳質(zhì)效果，從而有利于DEP的降解.取適量表面活性劑Tween-80并且加入DEP，混合后加入45 mL pH 7.0的磷酸緩沖液，使Tween-80最終質(zhì)量濃度為0.01 g／L，休止細(xì)胞濃度為2×108～6×108cpu／mL，DEP質(zhì)量濃度為118 mg／L，30℃，180 r／min，以未加入Tween-80的DEP磷酸緩沖液為對(duì)照.休止細(xì)胞降解DEP的影響如圖5（b）所示，添加Tween-80對(duì)休止細(xì)胞的降解效率產(chǎn)生了一定的抑制，在10 h將DEP完全降解，而對(duì)照的完全降解時(shí)間為6 h.其原因可能Tween-80對(duì)菌體有一定的毒害作用，從而對(duì)降解產(chǎn)生抑制，在以后的研究中擬加入細(xì)胞毒性更小的表面活性劑如鼠李糖脂，以提高降解能力.

2.6 底物濃度對(duì)休止細(xì)胞及生長細(xì)胞降解DEP的影響

分別采用含有不同DEP質(zhì)量濃度的磷酸緩沖液，休止細(xì)胞濃度2×108～6×108cpu／mL，30℃，180 r／min，底物質(zhì)量濃度對(duì)休止細(xì)胞降解DEP的影響如圖6（a）所示，結(jié)果表明：休止細(xì)胞對(duì)各質(zhì)量濃度的DEP均能有效降解，其中118 mg／L和236 mg／L的DEP均能在6 h內(nèi)完全降解.隨著DEP質(zhì)量濃度的增加，降解效率也隨之下降，DEP被完全降解所需時(shí)間也延長，24 h可將1 436 mg／L的DEP完全降解.

此外，為了比較休止細(xì)胞與生長細(xì)胞對(duì)DEP降解能力的差異，還分別添加不同質(zhì)量濃度的DEP于無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，30℃，180 r／min搖床培養(yǎng)，檢測(cè)培養(yǎng)基中DEP殘留率，結(jié)果表明：菌株HZ3的生長細(xì)胞對(duì)1 062 mg／L的DEP已無降解能力，當(dāng)DEP質(zhì)量濃度低于944 mg／L以下時(shí)，隨DEP初始質(zhì)量濃度的降低而其完全降解所需時(shí)間也縮短，但與其休止細(xì)胞相比，無論是完全降解所需的時(shí)間還是最高耐受濃度，休止細(xì)胞均遠(yuǎn)優(yōu)于生長細(xì)胞，如圖6（b）所示.

圖6 不同底物濃度對(duì)休止細(xì)胞及生長細(xì)胞降解DEP的影響Fig.6 Effects of different concentration of DEP and Tween-80 on the DEP-degradation of resting cells

3 結(jié) 論

1）以DEP為唯一碳源，從杭州市河道污水出口處淤泥中篩選到一株DEP降解菌HZ3，可在1天內(nèi)將118 mg／L的DEP完全降解.

2）基于休止細(xì)胞在生物降解中的優(yōu)點(diǎn)，制備了菌株HZ3的休止細(xì)胞，考察了不同因子對(duì)休止細(xì)胞降解DEP的影響，結(jié)果表明：在休止細(xì)胞濃度為2×108～6×108cpu／mL，pH 7.0，30 ℃，180 r／min條件下，可在6 h內(nèi)將118 mg／L的DEP完全降解，37℃下的降解效率也無明顯差異，加入0.01 g／L Tween-80則對(duì)降解效率產(chǎn)生了一定的抑制.

3）休止細(xì)胞對(duì)1 436 mg／L的DEP表現(xiàn)出較高的降解能力，可在24 h內(nèi)將其完全降解，而生長細(xì)胞則對(duì)1 062 mg／L的DEP已無降解能力，當(dāng)DEP質(zhì)量濃度低于944 mg／L以下時(shí)，隨DEP初始質(zhì)量濃度的降低將其完全降解所需時(shí)間也縮短，但休止細(xì)胞無論從降解時(shí)間還是耐受濃度上均明顯優(yōu)于生長細(xì)胞.

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Screening of a diethyl phthalate-degrading bacterium and biodegradation characteristics of its resting cell

QIU Le-quan，WANG Zi-chao，CHEN Yang，DONG Shen-hua，ZHONG Wei-hong
（College of Biology and Environment Engineering，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310032，China）

A bacterial strain HZ3，which could degrade DEP，was isolated from sludge of river of Hangzhou city.This research focused on DEP-degrading characteristics using resting cell of strain HZ3.When the degradation conditions were 2×108～6×108cpu／mL of the resting cell concentration，pH 7.0，30℃，and 180 r／min，118 mg／L DEP could be completely degraded in 6 h，and no significant difference was found in the degradation efficiency when occurred at 37℃.After adding 0.01 g／L Tween-80，the degradation efficiency of DEP was decreased.The resting cells still showed a high degradation capacity for a wide range of initial DEP concentrations of 118～1 436 mg／L，the growing cells，however，were not capable of degrading the DEP with an initial concentration of 1 062 mg／L.

diethyl phthalate；resting cell；biodegradation

X172

A

1006-4303（2013）02-0178-05

2012-03-20

邱樂泉（1974—），男，江西樂安人，講師，研究方向?yàn)閼?yīng)用微生物學(xué)，E-mail：lqqiu＠sohu.com.

（

陳石平）