張婷婷， 夏文水， 姜啟興， 許艷順

（江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

雙孢菇（Agaricus bisporus）屬草腐菌，中低溫性菇類，含有豐富的蛋白和多糖具一定的抗癌活性，有抑制腫瘤、降低血壓作用。我國稻草、麥草豐富，氣候適合雙孢菇生長，總產(chǎn)占世界第二位，主要加工產(chǎn)品為罐頭，是中國果蔬加工的主導(dǎo)和傳統(tǒng)出口產(chǎn)品，在國際貿(mào)易量中占首位，但雙孢菇在加工過程中易變色，雙孢菇的褐變主要是酶促褐變，酚類物質(zhì)如鄰苯二酚在多酚氧化酶（Polyphenol Oxidase，簡稱PPO）作用下發(fā)生酶促褐變形成醌類化合物，醌自身呈淺褐色，但醌類物質(zhì)通過非酶聚合反應(yīng)成為較高相對分子質(zhì)量的暗褐色化合物；另有非酶褐變?nèi)邕€原性物質(zhì)與多糖發(fā)生美拉德反應(yīng)等[1-3]。

國內(nèi)外已有對抑制酶促褐變的相關(guān)研究，Nerya研究發(fā)現(xiàn)二苯基磷酸（DPP）能滲入細(xì)胞組織而抑制少量PPO活力防止鮮切蘑菇褐變，但護(hù)色效果不佳且DPP在蘑菇組織內(nèi)不穩(wěn)定，易代謝分解[4]；抗壞血酸及其衍生物能抑制鮮切哈密瓜PPO酶活，但其自身易氧化而引起色變[5-6]；半胱氨酸不能抑制PPO酶活，但能與蘋果酶促反應(yīng)產(chǎn)物-醌類物質(zhì)結(jié)合成無色硫化物從而抑制褐變[7]；Yue-Xiu Si研究發(fā)現(xiàn)橙皮素可通過降低PPO疏水性而抑制其活性[8]；Yueming Jiang研究發(fā)現(xiàn)用谷胱甘肽和檸檬酸能抑制荔枝PPO活性[9]。中國雙孢菇罐頭生產(chǎn)中普遍采用焦亞硫酸鈉護(hù)色，雖控制褐變效果顯著，但由于SO2殘留有害于人體健康，所以國外禁止用于罐頭生產(chǎn)[10]。所以需要找到一種新型的雙孢菇罐頭安全高效護(hù)色劑應(yīng)，抑制褐變反應(yīng)發(fā)生。

檸檬酸亞錫二鈉（Disodium Stannous Citrate，簡稱DSC），具強(qiáng)還原性，在罐中逐漸消耗殘余氧氣，阻斷食品由于空氣氧化作用而引起的氧化腐敗，延緩食品的氧化所引起的不利變化從而起到抗氧護(hù)色作用，保持食品的色澤和風(fēng)味。金椗梁等研究發(fā)現(xiàn)檸檬酸亞錫二鈉對鮮切藕產(chǎn)品低溫保藏期間的褐變和PPO活力有明顯抑制作用，可作為亞硫酸鹽的一種替代物應(yīng)用于鮮切蓮藕產(chǎn)品中[11]。

作者以檸檬酸亞錫二鈉作為護(hù)色劑，研究DSC處理對雙孢菇罐頭產(chǎn)品褐變及PPO活性的影響，并與常用護(hù)色劑進(jìn)行比較和復(fù)合優(yōu)化，旨在探索新型的安全高效護(hù)色劑代替亞硫酸鹽及類似產(chǎn)品的非硫護(hù)色方法。

1 材料與方法

1.1 原料與設(shè)備

新鮮雙孢菇：購于無錫市雪浪農(nóng)貿(mào)市場，菌柄完整，菌蓋直徑3～4 cm，成熟未開傘；

檸檬酸亞錫二鈉：西隴化工廠股份有限公司產(chǎn)品；焦亞硫酸鈉、檸檬酸、植酸、CaCl2、VC均為分析純；數(shù)型恒溫水浴鍋：HH-2，國華電氣有限公司產(chǎn)品；紫外分光光度計(jì)：UV2100，尤尼柯（上海）儀器有限公司產(chǎn)品；高速冷凍離心機(jī)：4K15，SIGMA公司產(chǎn)品；高速組織搗碎機(jī)：DS-1，上海標(biāo)本模型制造廠產(chǎn)品；色差儀：Ultra Scan PRO，上海信聯(lián)創(chuàng)體電子有限公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 雙孢菇罐頭工藝流程 參照Zhimin Li[13-14]等的試驗(yàn)方法并略有修改，工藝流程如下：

選樣→修剪→稱重→清洗→切片→護(hù)色處理→預(yù)煮→冷卻→瀝干→挑選修整→裝罐加湯→殺菌冷卻→室溫貯藏

1.2.2 DSC與常用護(hù)色劑對雙孢菇切片預(yù)處理護(hù)色效果比較 選取無腐爛變質(zhì)的新鮮雙孢菇，洗去泥土，去根，剔除損傷、褐變的雙孢菇，切分為0.5 cm左右的薄片，分別置于如表1所示不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的DSC、焦亞硫酸鈉、檸檬酸、植酸、VC及NaCl護(hù)色溶液中在常溫條件下處理15 min，取出瀝干，測定多酚氧化酶活力（PPO）和褐變度（BD）。

1.2.3 雙孢菇切片預(yù)處理復(fù)合護(hù)色劑各組分最佳配比的確定 在滿足 《食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》（GB 2760-2011）用量規(guī)定的前提下，以防止雙孢菇切片酶促褐變?yōu)槟康模?.2.1單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交實(shí)驗(yàn)方法正交試驗(yàn)如表2所示。以DSC、檸檬酸、植酸和VC為因素配制成復(fù)合護(hù)色液進(jìn)行如表2所示L9（34）表正交實(shí)驗(yàn)，確定復(fù)合護(hù)色劑中個(gè)護(hù)色劑用量。分別以去離子水為空白參照CK1，以0.02%NaHSO3的護(hù)色液為對照組 CK2。護(hù)色后測定雙孢菇褐變度BD和PPO殘余酶活。

表1 雙孢菇切片預(yù)處理護(hù)色劑的種類及質(zhì)量分?jǐn)?shù)篩選表Table 1 Arrange test of single factor of anti-browning agents for fresh -cut Agaricus bisporus pretreatment%

表2 鮮切雙孢菇護(hù)色液因素水平表Table 2 Orthogonal design of anti-browning agents for fresh-cut Agaricus bisporus pretreatment

1.2.4 DSC與常用護(hù)色劑對雙孢菇罐頭護(hù)色效果比較 經(jīng)1.2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出的最佳正交復(fù)合護(hù)色劑預(yù)處理過的菇片再經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%檸檬酸溶液預(yù)煮9 min后冷卻、裝罐，按表3所示配制成護(hù)色液湯汁制成雙孢菇罐頭，以空白（去離子水）為對照組。新鮮雙孢菇制成罐頭樣品貯藏于室溫（25℃）和自然光照條件下6個(gè)月，每隔一個(gè)月測定多酚氧化酶活力（PPO）和褐變度（BD）。

表3 罐頭護(hù)色劑的種類及質(zhì)量分?jǐn)?shù)篩選表Table 3 Arrange test of single factor of anti-browning agents for canned Agaricus bisporus%

1.2.5 雙孢菇罐頭的復(fù)合護(hù)色劑各組分最佳配比的確定 參照Zhimin Li[12]等的試驗(yàn)方法，在含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.30% 檸檬酸的護(hù)色液中，以DSC、植酸和氯化鈣為三因素配制成復(fù)合護(hù)色湯汁進(jìn)行L9（34）表正交實(shí)驗(yàn)制備罐頭，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.30%檸檬酸的護(hù)色液所得樣品為空白參照CK3，0.02%NaHSO3的護(hù)色液所得樣品為空白參照CK4。新鮮雙孢菇制成罐頭樣品貯藏于室溫（25℃）和自然光照條件下6個(gè)月，每隔一個(gè)月測定多酚氧化酶活力（PPO）和褐變度（BD）。

表4 罐頭護(hù)色劑的種類及質(zhì)量分?jǐn)?shù)篩選表Table 4 Orthogonal design of anti-browning agents for canned Agaricus bisporus

1.2.6 褐變度的測定 參照Mohapatra D，Gemma Oms-Oliu[13-14]的方法，將處理好的雙孢菇切片表面的水分用紙巾吸干，直接用色差儀測定。L*（亮度），a*（紅-綠）和b*（黃-藍(lán)）參數(shù)值通過反射測量。每組樣品至少進(jìn)行6次重復(fù)測定，取ΔE*平均值為褐變度BD。

1.2.7 多酚氧化酶活力的測定 粗酶液的提?。簠⒄誇atih Kalyoncu、潘永貴等[15-16]方法，稱取20 g樣品，與80 mL預(yù)先冷凍至-26℃的丙酮一起倒入組織搗碎機(jī)中勻漿（20 000 r/min，2 min），迅速抽濾，保留濾紙上的沉淀部分，將沉淀薄層中的殘留的丙酮用冷風(fēng)吹去，至沉淀無丙酮味，將所得丙酮粉轉(zhuǎn)移至 40 mL 0.1 mol/L PBS（pH 6.5）中攪拌 30 min，離心（4 ℃，10 000 r/min，20 min）。 所得上清液即為PPO粗酶液。

測定方法：在410 nm下測定粗酶液的紫外吸收分光光度值A(chǔ)410nm，比色皿中加入0.1 mol/L PBS 1.5 mL，0.1 mol/L鄰苯二酚 1 mL，PPO粗酶液 0.5 mL，混勻后立即用410 nm比色，粗酶液加入后開始計(jì)時(shí)，每10秒記錄一次A值隨時(shí)間變化而變大，以吸光值為縱坐標(biāo)，反應(yīng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，作吸光值-時(shí)間曲線，從最初直線線段斜率（ΔA/Δt）計(jì)算多酚氧化酶的活力（參比以緩沖液代替酶液）。酶活定義為：在測定條件下，每min引起吸光度變化0.01所需酶量。每組實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)測定，取3次平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 DSC對鮮切雙孢菇的護(hù)色效果研究

2.1.1 DSC與不同護(hù)色劑對雙孢菇切片預(yù)處理護(hù)色效果的影響 DSC與常用護(hù)色劑的護(hù)色效果比較見圖1，由此可知，DSC與常用護(hù)色劑均能起到良好的護(hù)色作用，而且隨著護(hù)色劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)增大，鮮切雙孢菇的PPO活力和褐變度的抑制效果逐漸增強(qiáng)，但增長速率漸趨平緩；各抑制劑護(hù)色效果依次為：焦亞硫酸鈉＞DSC＞植酸＞檸檬酸＞VC＞氯化鈉＞空白，盡管焦亞硫酸鈉、DSC和植酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低，但其抑制效果均優(yōu)于較高質(zhì)量分?jǐn)?shù)的VC、檸檬酸及氯化鈉，其中質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.02%～0.03%DSC的護(hù)色效果可與焦亞硫酸鈉媲美，但經(jīng)后者處理過的雙孢菇切片過于蒼白，失去了原本的灰白色質(zhì)感。金椗梁研究發(fā)現(xiàn)，在pH 3～6條件下用DSC浸泡處理后的鮮切藕產(chǎn)品可保持較低的褐變度和多酚氧化酶活力[11]；植酸不僅能降低溶液pH值，還可與多種多價(jià)金屬絡(luò)合，從而抑制多價(jià)金屬對PPO酶促反應(yīng)的催化作用，由此起到護(hù)色作用[17]，B Dave、Lixiang Liu等研究發(fā)現(xiàn)其在加拿大大豆、苦丁茶等果蔬制品中取得了較為理想的護(hù)色效果[18-19]。

圖1 常溫光照條件下不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)護(hù)色劑對雙孢菇切片的護(hù)色效果比較Fig.1 Comparison analysis of browning inhibition effect of DSC and other anti-browning agents on freshcut Agaricus bisporus at room temperature（25℃）in natural light condition

2.1.2 雙孢菇切片預(yù)處理正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析 從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，與2.1.1結(jié)果相比較，正交組復(fù)合護(hù)色劑對PPO活性抑制及防褐變的效果明顯優(yōu)于單一護(hù)色劑溶液，表明不同護(hù)色劑之間有一定的協(xié)同作用。根據(jù)表5正交分析結(jié)果可以得出，各因素對褐變度BD和PPO殘余酶活的影響程度均依次為：DSC＞檸檬酸＞植酸 ＞VC，這與單因素試驗(yàn)結(jié)果相同。復(fù)合護(hù)色劑的最優(yōu)參數(shù)組合為 （質(zhì)量分?jǐn)?shù)）：檸檬酸 0.2%，DSC 0.03%，植酸 0.02%，VC 0.03%，在最優(yōu)護(hù)色處理下，菇片色澤呈現(xiàn)雙孢菇特有的灰白色，形態(tài)正常，護(hù)色液清澈透明。

表5 雙孢菇褐變抑制正交實(shí)驗(yàn)L9（34）結(jié)果Table 5 Result of orthogonal design for fresh-cut Agaricus bisporus pretreatment

2.2 DSC對雙孢菇罐頭的護(hù)色效果研究

2.2.1 DSC與不同護(hù)色劑對雙孢菇罐頭護(hù)色效果的比較 罐頭湯汁的正交復(fù)配設(shè)計(jì)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。由于雙孢菇罐頭在開罐期間PPO活性抑制率均在99.97%以上，故后期以褐變度BD作為主要參考因素。

圖2 常溫光照條件下各種護(hù)色劑對雙孢菇罐頭的護(hù)色效果比較Fig.2 Comparison analysis of anti-browning agents on canned Agaricus bisporus at room temperature（25℃）in natural light condition

不同護(hù)色劑對雙孢菇罐頭護(hù)色效果的影響結(jié)果如圖2所示，數(shù)據(jù)結(jié)果為各護(hù)色劑的最大濃度實(shí)驗(yàn)組產(chǎn)品褐變度平均值。由圖可知，焦亞硫酸鈉和DSC防褐變效果最好，其次是植酸、檸檬酸和氯化鈣，VC效果最差，褐變度與空白對照組相近，該組產(chǎn)品湯汁暗黃，菇片也呈現(xiàn)較深的黃褐色，這可能是由于VC雖有一定還原性[20]，但因其本身在高溫殺菌過程中受熱見光易發(fā)生自身氧化而褐變，從而導(dǎo)致色澤的變化，這與O.Lamikanra等[5-6]的研究結(jié)果相似。氯化鈣的護(hù)色作用是通過保持細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性和穩(wěn)定性，阻止底物與酶PPO的接觸，延緩褐變的發(fā)生，同時(shí)對果肉具有明顯的護(hù)脆效果[19-21]。焦亞硫酸鈉組的湯汁和菇片均顯黃色，且有蒼白的感覺，失去了蘑菇本身的色澤，缺少真實(shí)感。故以DSC效果最佳。

2.2.2 雙孢菇罐頭正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析 從表6雙孢菇罐頭正交試驗(yàn)結(jié)果可以看出，各因素對褐變度BD的影響程度均依次為：DSC>植酸>氯化鈣，其中DSC和植酸對雙孢菇罐頭防褐變效果均有顯著性影響；罐頭護(hù)色湯汁的復(fù)合護(hù)色劑的最優(yōu)參數(shù)組合為：DSC 0.03%+植酸0.02%+氯化鈣0.30%。金椗梁研究發(fā)現(xiàn)，檸檬酸亞錫二鈉可能具有較強(qiáng)還原性，可通過消耗罐中殘余的氧氣將Sn2+氧化成Sn4+來達(dá)到抗氧化目的，而在罐頭中，檸檬酸和植酸可能對其的抗氧化性有一定增效作用[11，22]。

表6 罐頭湯汁L9（34）配方試驗(yàn)結(jié)果Table 6 Result of orthogonal design for canned Agaricus bisporus

圖3表示了分別以復(fù)合護(hù)色劑、檸檬酸亞錫二鈉、焦亞硫酸鈉及去離子水空白為湯汁護(hù)色液對常溫光照條件下6個(gè)月保存期內(nèi)的雙孢菇罐頭的護(hù)色效果比較，數(shù)據(jù)結(jié)果為各實(shí)驗(yàn)組產(chǎn)品褐變度平均值。由圖可知，與空白組相比較，經(jīng)護(hù)色液處理過的產(chǎn)品的褐變程度均得到了有效抑制，在雙孢菇罐頭的6個(gè)月保藏期內(nèi)，正交復(fù)合護(hù)色劑取得了最佳的護(hù)色效果，而檸檬酸亞錫二鈉的褐變抑制效果與亞硫酸鈉相當(dāng)。

3 結(jié)語

圖3 常溫光照條件下復(fù)合護(hù)色劑與其他護(hù)色劑對雙孢菇罐頭的護(hù)色效果比較Fig.3 Comparison analysis of compound color fixative and otheranti-browningagentson canned Agaricus bisporus at room temperature（25℃）in natural light condition

1）與常用護(hù)色劑相比，DSC對雙孢菇PPO活力和褐變度有明顯的抑制作用，護(hù)色效果優(yōu)于檸檬酸、植酸和氯化鈣，而與焦亞硫酸鈉效果相當(dāng)；預(yù)煮前經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù) 0.2%檸檬酸，0.03%DSC，0.02%植酸，0.03%VC復(fù)合護(hù)色劑浸泡處理15 min后的雙孢菇可保持較低的褐變度和PPO活力，表明在預(yù)處理階段，DSC對雙孢菇切片酶促褐變的抑制作用是非常顯著的；

2）DSC在雙孢菇罐頭中也有理想的褐變抑制效果，且DSC的復(fù)合護(hù)色劑湯汁質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.03%DSC，0.02% 植酸，0.30% 氯化鈣對雙孢菇罐頭在室溫自然光照保藏期間質(zhì)量分?jǐn)?shù)均有非常顯著的護(hù)色效果，可與0.02%焦亞硫酸鈉媲美，各因素對其影響程度為：DSC>植酸>氯化鈣。DSC可作為雙孢菇罐頭中替代焦亞硫酸鈉的新型安全高效護(hù)色劑。

綜上，雙孢菇罐頭的最佳工藝條件為：質(zhì)量分?jǐn)?shù) 0.2%檸檬酸，0.03%DSC，0.02%植酸，0.03%VC復(fù)合護(hù)色劑浸泡預(yù)處理15 min；再經(jīng)0.2%檸檬酸溶液預(yù)煮9 min后冷卻、裝罐，按復(fù)合護(hù)色劑湯汁0.03%DSC，0.02%植酸，0.30%氯化鈣制成雙孢菇罐頭，在室溫（25℃）自然光照下保存，取得較好的褐變抑制效果。

迄今為止，國內(nèi)外關(guān)于檸檬酸亞錫二鈉對雙孢菇的褐變抑制機(jī)理的研究較少，尚無明確清晰的原理分析，作者僅是應(yīng)用DSC進(jìn)行雙孢菇罐頭的初步試驗(yàn)，具體的作用機(jī)理還需進(jìn)一步的研究。

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