馬 霄 莫利明 虞 成 逯嶺松 楊 攀

免疫傳感器在癌胚抗原檢測中的構(gòu)建與應(yīng)用研究*

馬 霄①莫利明①虞 成①逯嶺松②楊 攀①

目的：設(shè)計一種新型的基于絲網(wǎng)印刷技術(shù)的癌胚抗原(CEA)免疫傳感器，用于癌胚抗原濃度的床邊檢測。方法：在絲網(wǎng)印刷電極(SPE)上層層修飾上多壁碳納米管(MWNTs)N，N-二甲基甲酰胺(DMF)分散液與殼聚糖納米二氧化鈰(Chitosan-Nano CeO2)溶液兩種納米材料，利用納米鈰固載癌胚抗原抗體(anti-CEA)，最后用牛血清白蛋白(BSA)封閉納米鈰上非特異位點，構(gòu)建一種新型的癌胚抗原免疫傳感器。采用透射電鏡(TEM)及循環(huán)伏安法(CV)對修飾過程進(jìn)行表征。結(jié)果：探討不同pH、孵育溫度及孵育時間對該免疫傳感器性能的影響，該傳感器在最適條件下對CEA響應(yīng)良好，其線性范圍為0～80 ng/ml，線性相關(guān)系數(shù)r=0.99825，檢出限為0.08 ng/ ml。結(jié)論：CEA免疫傳感器具有穩(wěn)定性好、靈敏度高、特異性好、結(jié)果準(zhǔn)確可靠和可再生等優(yōu)點，可應(yīng)用于臨床檢測。

癌胚抗原；絲網(wǎng)印刷電極；多壁碳納米管；納米鈰

[First-author’s address] Department of Medical Engineering, Hangzhou First People’s Hospital, Hangzhou 310006, China.

癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)是一種具有人類胚胎抗原特性決定簇的酸性糖蛋白，作為一種常見的腫瘤標(biāo)志物，被廣泛用作卵巢癌、乳腺癌等各種腫瘤的診斷及監(jiān)測指標(biāo)[1-2]。準(zhǔn)確測定血清中CEA的含量對臨床診斷具有重要的意義。多壁碳納米管(modifying multi-wall carbon nanotubes，MWNTs)比表面積大、機(jī)械強度高，具有優(yōu)異的電子傳導(dǎo)特性和化學(xué)穩(wěn)定性，用其修飾電極可以顯著增加響應(yīng)電流，但MWNTs不易溶解分散[3-6]。N，N-二甲基甲酰胺(dimethyl-formamide，DMF)是一種用途廣泛的優(yōu)良溶劑，本研究選擇DMF分散MWNTs的分散劑，克服了MWNTs不易溶解分散的問題。納米鈰具有比表面積大、生物兼容性好等優(yōu)點，近年來常被用來吸附酶或抗體[7-8]。納米二氧化鈰(CeO2)具有較高等電點，由于抗體本身等電點低，故其對抗體具有很強的靜電吸附作用[9]。殼聚糖納米(Chitosan-Nano)生物相容性好、成膜能力強，可以有效地分散納米鈰[10-13]。

目前，血清CEA測定可用酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)和放射免疫檢測法(radioimmunoassay，RIA)，這兩種方法需要實驗室大型儀器檢測并需配備專業(yè)人員，且檢測時間相對較長[14]。絲網(wǎng)印刷電極(screen-printed electrodes，SPE)因其操作簡單，攜帶方便，近年來在環(huán)境監(jiān)測、DNA檢測等領(lǐng)域廣泛關(guān)注，且血糖紙片已經(jīng)成功用于臨床檢測[15]。本研究利用多壁碳納米管及納米鈰將CEA抗體固載到SPE表面，構(gòu)建了一種新型的一次性CEA免疫傳感器。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

(1)CHI604D電化學(xué)工作站(上海辰華儀器有限公司)；AUW220D電子天平(日本島津公司)；pHS-3C酸度計(上海精密科學(xué)儀器有限公司雷磁儀器廠)；DL-60A超聲波清洗器(上海之信儀器有限公司)；85-2數(shù)顯恒溫磁力攪拌器(上海梅香儀器有限公司)；Hitachi T-7500透射電子顯微鏡(日本日立公司)。

(2)CEA單克隆抗體與CEA標(biāo)準(zhǔn)品(美國Sigma公司)；牛血清白蛋白BSA(96%～99%，美國Sigma公司)；納米鈰(北京鈉辰科技有限公司)；殼聚糖(上海生物工程有限公司)；CEA試劑盒(武漢中美科技有限公司)；葡萄糖，尿酸，抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)品(上海生工生物工程公司)；多壁碳納米管(MWNTs，中科院成都有機(jī)化學(xué)研究所)；N，N-二甲基甲酰胺(DMF，分析純，上海生物工程有限公司)；實驗所用緩沖液均為含5 mmol/L[Fe(CN)6]3-/4-和0.1 mol/L KCl的0.1 mol/ L PBS溶液(pH=7.0)，其他所有輔助試劑均為分析純濃度，實驗所用水為雙蒸水。

1.2 免疫傳感器的制備方法

(1)絲網(wǎng)印刷電極的制備。在0.5 mm厚的塑料基板上依次印刷銀層、碳層和絕緣層，放入90 ℃真空干燥箱中干燥15 min，制得SPE電極，將10 mg羧基化的MWNTs分散在10 ml的DMF溶液中，超聲處理10 min，制成1.0 mg/ml的MWNTs分散液。處理過的MWNTs帶有豐富的負(fù)電荷，取2 μl該溶液均勻滴涂于SPE中間4 mm2工作電極上，室溫下干燥2 h，制成MWNTs-DMF/SPE電極(如圖1所示)。

圖1 絲網(wǎng)印刷電極圖

(2)CeO2用透射電子顯微鏡表征，溶膠顆粒平均直徑為12 nm。將殼聚糖溶于1%(V/V)的冰醋酸溶液中，制成5%(W/W)殼聚糖溶液。將CeO2與殼聚糖混合溶液2 μl(體積比為1∶1)滴涂于工作電極表面，室溫37 ℃浸泡4 h，用雙蒸水洗滌工作電極，除去未附著混合溶液，制成Chitosan-Nano CeO2/MWNTs-DMF/SPE電極。

(3)抗體包被。將2 μl anti-CEA均勻滴涂在工作電極表面4 ℃下靜置12 h，最后將2 μl BSA溶液(2.5%， m/V)均勻滴涂在工作電極表面上，4 ℃下浸泡1 h，以封閉電極上的非特異吸附位點，用雙蒸水洗滌電極表面，除去未附著物質(zhì)，制成CEA絲網(wǎng)印刷電極。該電極的制備流程如圖2所示。

圖2 工作電極修飾流程圖

(4)表征方法。利用循環(huán)伏安法(cyclic voltammetry，CV)對傳感器響應(yīng)電流進(jìn)行表征，測試采用經(jīng)典三電極體系，即CEA抗體修飾的SPE為工作電極，以Ag電極為參比電極，碳電極為對電極，在含5 mmol/L [Fe(CN)6]3-/4-和0.1 mol/L KCl的0.1 mol/ LPBS(pH=7.0)緩沖液中進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，電壓為：-0.2～0.8 V；掃描速度：50 mV/s；所有測試均在35 ℃下進(jìn)行。

(5)檢測方法。SPE工作電極在被檢標(biāo)本中孵育，37 ℃，10 min；然后在含5 mmol/L[Fe(CN)6]3-/4-和0.1 mol/L KCl的0.1 mol/LPBS(pH=7.0)緩沖液進(jìn)行CV檢測，觀察響應(yīng)電流隨標(biāo)本中CEA濃度變化關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 MWNTs-DMF和Chitosan-Nano CeO2的TEM表征

如圖3所示，圖3(A)顯示出MWNTs在DMF溶液中分散的情況，MWNTs直徑為10～15 nm；圖3(B)顯示出Nano CeO2在Chitosan分散的情況，Nano CeO2分散比較均勻，顆粒直徑約為12 nm。

圖3 MWNTs-DMF和Chitosan-NanoCeO2透射電鏡圖(×105)

2.2 傳感器的電化學(xué)性質(zhì)

(1)溫度為30 ℃的檢測條件。SPE為5 mmol/ L[Fe(CN)6]3-/4-和0.1 mol/L KCl的0.1 mol/ LPBS(pH=7.0)緩沖液，掃描電壓為-0.2～0.8 V，掃描速度為50 mV/s，溫度為30 ℃，其不同條件下的循環(huán)伏安曲線如圖4所示。

圖4 不同修飾的SPE緩沖液中的循環(huán)伏安曲線

圖中曲線a為裸SPE碳電極條件，有氧化還原峰，表明SPE在5 mmol/L[Fe(CN)6]3-/4-和0.1 mol/L KCl的 0.1 mol/LPBS(pH=7.0)緩沖液中可產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)的氧化還原電流；曲線b為在電極表面滴涂了MWNTs-DMF分散液，圖形較之曲線a中氧化還原電流均變大，表明MWNTs-DMF放大了電流信號；曲線c為在SPE上修飾了Chitosan-NanoCeO2，其氧化還原峰較曲線b有明顯的增高，表明Chitosan-Nano CeO2極大增加了電極電子傳遞的有效面積，起到了明顯放大響應(yīng)電流的作用；曲線d為在SPE上固載了anti-CEA，其氧化還原峰較曲線c變小，因為抗體蛋白質(zhì)有阻礙電流的作用；曲線e為在SPE上包被了BSA，氧化還原電流均進(jìn)一步減小，因為蛋白質(zhì)分子修飾到電極上會阻礙電子傳遞，表明BSA封閉了電極上非特異吸附位點。

(2)溫度為35 ℃的檢測條件。SPE為5 mmol/ L[Fe(CN)6]3-/4-和0.1 mol/L KCl的0.1 mol/ LPBS(pH=7.0)緩沖液，掃描電壓為-0.2～0.8 V，溫度為35 ℃。SPE在不同掃描速度下的循環(huán)伏安曲線以及響應(yīng)電流的擬合曲線如圖5所示。

圖5 SPE在不同掃速下的循環(huán)伏安曲線

圖5 中顯示，[Fe(CN)6]3-/4-的氧化還原可逆性好，在20～150 mV/s范圍內(nèi)，SPE的響應(yīng)電流與掃速的平方根成線性關(guān)系，氧化峰線性方程為Ipi=-5.57539e-6v1/2-1.48002e-5，r=-0.99565，還原峰線性方程為Ipc=7.21998e-6v1/2+1.67433e-5，r=0.99603，說明SPE表面氧化還原反應(yīng)受擴(kuò)散控制。

2.3 pH對CEA免疫傳感器的影響

緩沖液的pH對抗原、抗體的活性有很大的影響。在緩沖液pH值為5.0～8.0范圍內(nèi)考察了其與CEA免疫傳感器孵育CEA孵育前后電流變化值Δi的關(guān)系，可觀察到當(dāng)緩沖液的pH值為7.0時電流響應(yīng)變化值最大，表明此時抗原、抗體的活性最高，抗原、抗體結(jié)合度最大，形成的復(fù)合物影響電流傳遞，因此將緩沖液的pH調(diào)為7.0(如圖6所示)。

圖6 pH對CEA免疫傳感器電流的影響

2.4 溫度對CEA免疫傳感器的影響

溫度對抗原、抗體的活性有很大的影響。當(dāng)溫度升高時，抗原、抗體反應(yīng)速率增加，但高溫會使其失活。實驗在20～45 ℃范圍內(nèi)考察了其與CEA免疫傳感器孵育CEA孵育前后電流變化值Δi的關(guān)系，當(dāng)溫度達(dá)到40 ℃時，響應(yīng)電流值達(dá)到最大。但是為了保持抗原、抗體的活性，實驗溫度選為35 ℃(如圖7所示)。

圖7 溫度變化對CEA免疫傳感器電流的影響

2.5 孵育時間對CEA免疫傳感器的影響

如圖8所示，圖中反映了孵育時間對CEA免疫傳感器響應(yīng)電流的影響，將傳感器與20 U/L的CEA孵育，孵育時間在3～20 min考察其與電流變化值Δi的關(guān)系，3～8 min內(nèi)電流變化值Δi逐漸增大，8～20 min電流趨于平穩(wěn)，即15 min時抗原、抗體結(jié)合達(dá)到飽和，因此，孵育時間控制在8 min。

圖8 孵育時間對CEA免疫傳感器電流的影響

3 CEA免疫傳感器的響應(yīng)特性

3.1 CEA標(biāo)準(zhǔn)品的檢測

CEA免疫傳感器檢測原理如圖9(A)所示，CEA抗原、抗體結(jié)合前其氧化峰電流值為ia，當(dāng)傳感器上抗原、抗體發(fā)生反應(yīng)后，形成的免疫復(fù)合物阻礙電子傳導(dǎo)，免疫傳感器的氧化峰電流減小，此時氧化峰電流值為ib，電流變化值Δi＝ib-ic，即CEA孵育前后CEA免疫傳感器電流變化值。

在最優(yōu)實驗條件下，將制備好的CEA免疫傳感器在不同濃度的CEA標(biāo)準(zhǔn)品中進(jìn)行孵育，CV法記錄Δi，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖9(B)所示，CCEA在0～80 ng/ml與Δi線性相關(guān)，線性方程為ΔIpa=0.01994CCEA+0.15225，r=0.99825，檢測下限為0.08 ng/ml。

圖9 CEA濃度與峰電流的線性關(guān)系

3.2 CEA免疫傳感器的特異性

將8.8 mmol/L葡萄糖，0.24 mmoL/L尿酸，0.5 mmol/L抗壞血酸加入到50 ng/ml的CEA標(biāo)準(zhǔn)品中，模擬人體環(huán)境可能出現(xiàn)的干擾物質(zhì)，觀察傳感器在干擾物加入前后響應(yīng)電流的變化，結(jié)果相差＜8%，說明傳感器特異性較好。

3.3 免疫傳感器的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性

將同批次制備的5支免疫傳感器在相同條件下測定，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為4.3%，說明該傳感器有良好的重現(xiàn)性。將免疫傳感器在4 ℃下保存1個月，響應(yīng)電流能保持初始電流的80%。說明傳感器的穩(wěn)定性較好。

3.4 回收試驗

用CEA標(biāo)準(zhǔn)品配制5個質(zhì)量濃度依次為5 ng/ml、20 ng/ml、40 ng/ml、60 ng/ml及80 ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液，將CEA免疫傳感器分別在5個樣本溶液中孵育8 min，計算其回收率為98.3%～101.8%。結(jié)果表明，通過該方法制得的免疫傳感器可用于臨床對CEA的檢測。

4 臨床比對

為了驗證此方法的可行性和應(yīng)用到臨床醫(yī)學(xué)的可能性，對實際樣品進(jìn)行了檢測，在正常人血清中加入CEA標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行模擬，采用本法進(jìn)行測定并和標(biāo)準(zhǔn)的EILSA方法進(jìn)行對照，結(jié)果見表1。

表1 免疫傳感器和標(biāo)準(zhǔn)ELISA法檢測血清標(biāo)本結(jié)果對照

表1顯示，兩種方法檢測結(jié)果的相對偏差在-4.0%～2.1%之間，表明該傳感器適合用于血清CEA含量的測定。

5 結(jié)論

采用層層自助裝法將MWNTs-DMF和Chitosan-Nano CeO2修飾到SPE上，逐層明顯增大響應(yīng)電流，最后用Chitosan-Nano CeO2固載抗體，研制了一種新型的一次性CEA電流型免疫傳感器。該傳感器具有較好的敏感性和特異性，可用于床邊快速檢測。

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Research on immunosensor for the determination of carcinoembryonic antigen and its application/

MA Xiao, MO Li-ming, YU Cheng, et al// China Medical Equipment,2014,11(10):1-5.

Objective: To design immunosensor for the determination of Carcinoembryonic Antigen(CEA) and be used in the piont-of-care test of the concentration of CEA. Methods: The immunosensor was developed by modifying multi-wall carbon nanotubes(MWNTs)which dispersed in N, N-dimethyl-formamide(DMF)on the Screen-Printed Electrodes (SPE), then Chitosan-NanoCeO2were immobilized self-assembly. And then the antibody of CEA (anti-CEA) was absorbed on the surface of NanoCeO2monolayer. Finally, Albumin from bovine serum (BSA) blocked the non-specific adsorption site.The modification process was characterized by transmisCeOn electronmicroscope(TEM)and cyclic voltammetry(CV). The factors possibly influenced the performance of the proposed immunosensor were studied in detail. Results: Under optimal conditions,the obtained immunosensor exhibited good electrochemical behavior to CEA in a linear range of 0 to 80 ng/ml (r=0.99825), with a detection limit of 0.08 ng/ml. Conclusion: The immunosensor prepared using this method has advantages of good stability, regeneration, high sensitivity and specificity. Thus, the method can be used for clinical application.

Carcinoembryonic antigen; Screen-printed electrodes; Multi-wall carbon nanotubes; NanoCeO2

1672-8270(2014)10-0001-05

R730.45

A

10.3969/J.ISSN.1672-8270.2014.10.001

2014-06-13

國家自然科學(xué)基金(81301514)“基于DNA甲基化多指標(biāo)聯(lián)合檢測卵巢癌的新方法研究”；浙江省科研項目基金(2011C37027)“基于雙納米生物傳感技術(shù)的MPO即時檢測系統(tǒng)”

①杭州市第一人民醫(yī)院設(shè)備科 浙江 杭州 310006

②杭州市第一人民醫(yī)院中心實驗室 浙江 杭州 310006

馬霄，男，(1982- )，碩士，助理工程師。杭州市第一人民醫(yī)院設(shè)備科，從事電化學(xué)生物傳感器的技術(shù)研究、床邊快速診療設(shè)備的開發(fā)以及臨床醫(yī)學(xué)檢驗設(shè)備及生物醫(yī)學(xué)工程的項目研發(fā)工作。