張錦梅，田海峰，張習(xí)志

(青島盛瀚色譜技術(shù)有限公司，山東青島 266101)

伊班膦酸鈉(Ibandronate sodium，IB)是第三代雙磷酸鹽類藥物，由德國Boehringer Mannheim公司開發(fā)，于1996年在德國上市，臨床主要用于治療伴有或者不伴有骨轉(zhuǎn)移的惡性腫瘤引起的高鈣血癥和治療絕經(jīng)后婦女的骨質(zhì)疏松癥［1–2］。李謝對伊班膦酸鈉合成工藝的改進(jìn)作了報道［3］。伊班膦酸鈉制備的方法主要有兩條合成路線［4–6］，在伊班膦酸鈉合成過程中，使用的PCl3和亞磷酸可能引入到成品中。雙膦酸類藥物作用的靶向細(xì)胞主要是破骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞［7］。隨著臨床應(yīng)用的增多，有必要建立一種便捷、靈敏的檢測方法，對藥品質(zhì)量檢測提供技術(shù)支持。已有人對伊班膦酸鈉中的雜質(zhì)陰離子進(jìn)行研究［8–9］，但是未有對伊班膦酸鈉中磷酸和亞磷酸同時檢測作過研究。目前，檢測該類物質(zhì)中H2PO3–，H2PO4–離子的方法主要有示差法、氧化還原滴定法［10］、電位滴定法［11］、離子色譜法［9］等。其中，離子色譜法因其快速、準(zhǔn)確、選擇性好，以及可同時測定多組分的優(yōu)點被廣為應(yīng)用［12］。

筆者采用離子色譜–抑制電導(dǎo)法測定伊班膦酸鈉中的H2PO3–，H2PO4–離子，通過優(yōu)化選擇色譜條件方式的對比，建立了最佳的色譜條件。樣品用超純水溶解后，過0.22 μm濾膜，進(jìn)樣后可在15 min內(nèi)分析完樣品。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

離子色譜儀：CIC–300型，青島盛瀚色譜技術(shù)有限公司；

高效液相泵：UC–3281型，北京優(yōu)聯(lián)光電技術(shù)有限公司；

超聲波清洗器：HS10260D型，北京華運安特科技有限責(zé)任公司；

工作站：HW–2000型，上海千譜軟件有限公司；

Na2CO3：分析純，上海山浦化工有限公司；

NaHCO3：優(yōu)級純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；

磷酸二氫鉀：工作基準(zhǔn)試劑，上海山浦化工有限公司；

亞磷酸：分析純，上海亭新化工有限公司；

H2PO3–，H2PO4–標(biāo)準(zhǔn)溶液：質(zhì)量濃度均為1 000 mg／L，用H3PO3、KH2PO4分別配制H2PO3–、H2PO4–標(biāo)準(zhǔn)液，用時根據(jù)需要稀釋成系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，淋洗液用分析純Na2CO3和優(yōu)級純NaHCO3配制；

實驗用水為電阻率18.2 MΩ·cm的二次去離子水。

1.2 樣品處理

稱取一定量的伊班膦酸鈉樣品約0.1 g，加入超純水振蕩溶解，轉(zhuǎn)移到100 mL容量瓶中，并用超純水定容至標(biāo)線，搖勻，備用。樣品經(jīng)過0.22 μm離子色譜專用濾膜后直接進(jìn)樣。

1.3 色譜條件

離子色譜柱：SH–AC–1陰離子交換柱(150 mm×4.0 mm，青島盛瀚色譜技術(shù)有限公司)和SH–AC–1陰離子保護(hù)柱(50 mm×4.0 mm，青島盛瀚色譜技術(shù)有限公司)；淋洗液：3.6 mmol／L Na2CO3–4.5 mmol／L NaHCO3混合液，等度淋洗，流量為1.5 mL／min；柱溫：45℃；進(jìn)樣體積：20 μL；電流：70 mA。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

稱取磷酸二氫鉀0.140 2 g于100 mL容量瓶中，以超純水定容至標(biāo)線，在4℃下避光保存?zhèn)溆?。稱取亞磷酸0.100 0 g于100 mL容量瓶中，以超純水定容至標(biāo)線，在4℃下避光保存?zhèn)溆?。配?0 mg／L H2PO3–與20 mg／L H2PO4–離子混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，逐級稀釋2，4，8，10，20倍配制成系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜柱的選擇

離子交換分離是基于流動相與固定相上的離子交換集團之間發(fā)生的離子交換過程。對高極化度和疏水性較強的離子，分離機理中還包括非離子交換的吸附過程。一般離子交換功能基為季銨基的數(shù)值用作陰離子分離。本實驗采用表面氨基化聚乙烯醇的聚合物樹脂(SH–AC–3)型色譜柱與表面氨基化的其它類型聚合物樹脂柱(SH–AC–1)型色譜柱。用SH–AC–3型色譜柱在3.6 mmol／L Na2CO3溶液，流量0.7 mL／min，柱溫40℃條件下分析，亞磷酸和磷酸的分離度為1.1，出峰時間約為25 min。采用SH–AC–1型色譜柱，以3.6 mmol／L Na2CO3–4.5 mmol／L NaHCO3混合液作為淋洗液，流量為1.5 mL／min，室溫條件下分析，亞磷酸和磷酸的分離度為3.9，出峰時間約為4.8 min。綜合考慮定量的準(zhǔn)確性和效率，選用SH–AC–1型色譜柱。

2.2 淋洗液及其流量的選擇

單純使用碳酸鹽／碳酸氫鹽型淋洗液時，測定的噪音大，并且檢測靈敏度低，筆者選用內(nèi)置SHY–2自再生陰離子抑制器，在線使通過的淋洗液轉(zhuǎn)變?yōu)樘妓?，降低了背景電?dǎo)，提高了靈敏度。選擇SH–AC–1型 陰離子交換柱，3.6 mmol／L Na2CO3–4.5 mmol／L NaHCO3混合液為淋洗液可以同時檢測多種陰離子，分離度達(dá)到2.0以上，且可以得到較好的保留時間重現(xiàn)性。對淋洗液流量分別為1.0，1.5，2.0 mL／min進(jìn)行比較，結(jié)果表明，流量過低時，檢測靈敏度高，但所需時間較長；流量過高時，所需時間短，但柱壓升高。因此實驗選用的淋洗液流量為1.5 mL／min，離子分離效果好，峰型尖銳，對稱性好。

綜上所述，實驗選擇以3.6 mmol／L Na2CO3–4.5 mmol／L NaHCO3混合液為淋洗液，流量為1.5 mL／min。

2.3 線性關(guān)系和檢出限

配 制5.0 mg／L H2PO3–和10.0 mg／L H2PO4–混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，逐級稀釋2，4，8，10，20倍系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，其中H2PO3–的質(zhì)量濃度分別為2.50，1.25，0.63，0.50,0.25 mg／L； H2PO4–的質(zhì)量濃度分別為5.00，2.50,1.25,1.00,0.50 mg／L。在1.3色譜條件下測定系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以離子的質(zhì)量濃度x為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的色譜峰面積y為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得方法的線性方程和檢出限列于表1。

表1 離子濃度與峰面積的線性關(guān)系和檢出限

2.4 精密度試驗

分別取處理好的樣品溶液按1.3色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，測定結(jié)果見表2。由表2可知，H2PO3–，H2PO4–測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.5%，3.6%，說明該方法具有良好的精密度。

表2 樣品精密度試驗結(jié)果

2.5 加標(biāo)回收試驗

在樣品中添加3種不同濃度的H2PO3–，H2PO4–陰離子的混標(biāo)溶液，加標(biāo)后連續(xù)測定5次取平均值，加標(biāo)回收試驗結(jié)果見表3。圖1為伊班膦酸鈉樣品的加標(biāo)離子色譜圖(H2PO3–，H2PO4–離子加標(biāo)量分別為1.20，2.6 mg／L)。

表3 回收試驗結(jié)果

圖1 伊班膦酸鈉樣品的加標(biāo)離子色譜圖

2.6 實際樣品的測定

根據(jù)美國藥典，伊班膦酸鈉中雜質(zhì)限量控制是亞磷酸、磷酸的含量均不得超過0.5%。按實驗方法測得試樣中亞磷酸含量為0.067%，磷酸含量為0.334%，說明供試樣品為合格產(chǎn)品。

3 結(jié)語

采用離子色譜抑制電導(dǎo)法測定伊班膦酸鈉中亞磷酸和磷酸殘留量。該方法具有操作簡單、快速，測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠等優(yōu)點，具有很好的實用價值，這對測定雙膦酸類藥物中雜質(zhì)離子亞磷酸和磷酸的測定有一定的借鑒作用。

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