王 晶，袁俊青，劉蒙蒙，王志剛，于海洋，齊 潔，張全啟

(中國(guó)海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院海洋生物遺傳學(xué)與育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266003)

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牙鲆2種IGFBP基因的組織表達(dá)和激素調(diào)控分析?

王 晶，袁俊青，劉蒙蒙，王志剛，于海洋，齊 潔，張全啟??

(中國(guó)海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院海洋生物遺傳學(xué)與育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266003)

在脊椎動(dòng)物中，胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白(IGFBPs)對(duì)于調(diào)節(jié)IGFs生物活性、調(diào)控機(jī)體的生長(zhǎng)、代謝和繁殖有著非常重要的作用。但目前關(guān)于魚(yú)類IGFBPs的研究還不是非常深入。本實(shí)驗(yàn)利用RT-PCR技術(shù)分析了牙鲆IGFBP-3和IGFBP-4基因在不同成體組織中的表達(dá)模式。結(jié)果顯示，這2種基因在成體組織中均表達(dá)，其中IGFBP-3基因在性腺中表達(dá)量最高，在肝臟中最低；而IGFBP-4基因在腸中含量最豐富。利用原代培養(yǎng)的牙鲆肝細(xì)胞研究了不同激素對(duì)牙鲆IGFBPs的調(diào)控作用。結(jié)果顯示：生長(zhǎng)激素、胰島素和IGF-I能夠以劑量依賴和時(shí)間依賴的方式調(diào)控IGFBP-3和IGFBP-4基因的表達(dá)。本研究結(jié)果表明，牙鲆IGFBP-3和IGFBP-4基因可以在體內(nèi)不同組織中發(fā)揮作用，且不同激素的刺激可以調(diào)節(jié)它們的體外表達(dá)模式。

牙鲆；胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白；組織表達(dá)；激素調(diào)控

胰島素樣生長(zhǎng)因子(Insulin-like growth factor，IGF)信號(hào)系統(tǒng)是下丘腦-垂體-肝臟軸(Hypothalamic-pituitary-liver axis)的主要調(diào)控部分，通過(guò)分泌各種生長(zhǎng)因子和激素控制著生物有機(jī)體的生長(zhǎng)和發(fā)育[1]。在哺乳動(dòng)物中，IGF信號(hào)系統(tǒng)由配體(IGF-I，IGF-II)、細(xì)胞表面受體(IGF-IR，IGF-IIR)和6種胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白(IGFBP-1～6)組成，這6種IGFBPs以高親和力與IGFs結(jié)合，而不是和胰島素結(jié)合。IGF-I和IGF-II都為單鏈多肽，與胰島素序列的相似性為50%，它們主要是由肝臟合成和分泌，但一些生物體的某些非肝臟組織和不同類型的細(xì)胞也可以合成IGFs[2]。IGF-IR和IGF-IIR在機(jī)體的廣泛分布使IGFs可以行使細(xì)胞內(nèi)分泌、自分泌和旁分泌的功能[3-4]。IGFBPs不僅有依賴IGFs的作用，如調(diào)控IGFs的生物利用率，刺激或抑制IGFs的生物活性，還有不依賴IGFs的獨(dú)立作用，可以通過(guò)結(jié)合細(xì)胞表面受體或直接進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化等[5-6]。

褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)屬硬骨魚(yú)綱(Osteichthyes)、鰈形目(Pleuronectiformes)、牙鲆科(Paralichthyidae)，牙鲆屬(Paralichthys)，是一種冷溫性底層海水魚(yú)類，是中國(guó)重要的海洋漁業(yè)資源和水產(chǎn)養(yǎng)殖對(duì)象，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。IGFs信號(hào)系統(tǒng)對(duì)于魚(yú)類的生長(zhǎng)和發(fā)育有著不可替代的調(diào)控作用，而IGFBPs被證實(shí)可以調(diào)節(jié)IGFs的生物學(xué)活性。但是迄今為止，關(guān)于魚(yú)類IGFBPs的研究還不是非常深入，關(guān)于牙鲆IGFBP-3和IGFBP-4基因的體內(nèi)組織表達(dá)和體外激素調(diào)控還未見(jiàn)報(bào)道。因此，研究IGFBPs在IGFs信號(hào)系統(tǒng)和牙鲆生長(zhǎng)發(fā)育中的作用對(duì)于了解牙鲆的生長(zhǎng)調(diào)控機(jī)制、提高養(yǎng)殖產(chǎn)量具有重要的意義。

本研究分析了牙鲆IGFBP-3和IGFBP-4基因在成體不同組織中的表達(dá)情況，并利用原代培養(yǎng)的牙鲆肝臟組織細(xì)胞，研究了不同激素對(duì)牙鲆IGFBP-3和IGFBP-4基因的體外調(diào)控模式，以期為研究IGFBPs對(duì)魚(yú)類生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)節(jié)作用和調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

實(shí)驗(yàn)用健康牙鲆取自山東省海陽(yáng)市黃海水產(chǎn)有限公司，平均體重約500 g，在實(shí)驗(yàn)室用20 ℃循環(huán)海水暫養(yǎng)1周，觀察無(wú)任何異常情況后使用。選取雌雄各3尾健康成體牙鲆置于冰水中麻醉，之后采用斷椎法處死，并立即取出適當(dāng)大小的心臟、肝臟、脾臟、腎臟、腸、腦、鰓絲、肌肉、卵巢和精巢，用已滅菌的1% DEPC-H2O清洗組織表面殘留的血液和黏膜，液氮速凍，之后轉(zhuǎn)移至-80 ℃超低溫冰箱備用。

實(shí)驗(yàn)所用的Trizol Reagent購(gòu)自Invitrogen公司，Recombinant DNaseI、Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H-)和SYBR Premix Ex Taq試劑盒均購(gòu)自TaKaRa公司，L-15培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)均購(gòu)自CWBIO公司，青霉素、鏈霉素均購(gòu)自山東魯抗醫(yī)藥有限公司，重組人生長(zhǎng)激素(GH)購(gòu)自BioVision公司、重組人胰島素(Insulin)購(gòu)自ProSpec公司，重組人IGF-I和IGF-II均購(gòu)自PeproTech公司。

1.2 總RNA的提取和cDNA第一條鏈的合成

牙鲆成體各組織總RNA的提取按照Trizol Reagent說(shuō)明書(shū)的方法進(jìn)行，得到的總RNA按照Recombinant DNaseI的使用說(shuō)明進(jìn)行基因組DNA的去除和RNA的純化。采用分光光度計(jì)和瓊脂糖電泳檢測(cè)純化后的RNA濃度和完整性，按照反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV的使用說(shuō)明進(jìn)行cDNA第一條鏈合成，并轉(zhuǎn)移至-80 ℃超低溫冰箱備用。

1.3 RT-PCR分析

利用哺乳動(dòng)物和其它硬骨魚(yú)類IGFBP-3和IGFBP-4基因的保守序列，對(duì)實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)構(gòu)建的牙鲆混合組織cDNA文庫(kù)(未發(fā)表)進(jìn)行篩查，得到2條分別與其它硬骨魚(yú)的IGFBP-3和IGFBP-4基因具有較高同源性的cDNA序列。設(shè)計(jì)引物BP3-F/R和BP4-F/R(見(jiàn)表1)，以之前得到的牙鲆肝臟組織cDNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)并測(cè)序驗(yàn)證這2條序列的準(zhǔn)確性。

采用上述得到的牙鲆各成體組織cDNA為模板，利用引物BP3-F/R和BP4-F/R(見(jiàn)表1)進(jìn)行半定量分析。PCR反應(yīng)體系為25 μL，反應(yīng)條件為94 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s分別進(jìn)行31和35個(gè)循環(huán)。選用β-actin為內(nèi)參基因，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次并設(shè)計(jì)空白對(duì)照。

1.4 肝細(xì)胞的原代培養(yǎng)和激素處理

采用酶解消化法(0.25%胰蛋白酶)分離獲得牙鲆肝細(xì)胞，具體操作步驟在之前文獻(xiàn)[14-15]的基礎(chǔ)上稍作改動(dòng)：將牙鲆采用斷椎法處死，剪取部分新鮮肝臟組織在PBS(含有工作濃度為100 IU/mL的青霉素和100 mg/mL的鏈霉素)緩沖液中剪成體積為1 mm3的小塊。經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化30 min后，利用400目篩絹得到單細(xì)胞，并置于含有10%FBS、100 IU/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素的L-15培養(yǎng)基中。經(jīng)0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色后，觀察細(xì)胞成活率和數(shù)目。將計(jì)數(shù)好的肝細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至6孔板中(每孔約含有2×106個(gè)細(xì)胞)，24 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

表1 本實(shí)驗(yàn)所用到的引物序列

待肝細(xì)胞貼壁后，吸去培養(yǎng)基，加入含有不同濃度激素的L-15培養(yǎng)基(含10%FBS)。GH、胰島素、IGF-I和IGF-II分別以梯度濃度處理細(xì)胞24 h。用含有濃度為10 nmol/L的GH、10 μmol/L的胰島素、10/100 ng/μL的IGF-I和500 ng/μL IGF-II的培養(yǎng)基分別培養(yǎng)細(xì)胞6、12、24和48 h。將不同激素刺激后的原代培養(yǎng)肝臟細(xì)胞按照Trizol Reagent說(shuō)明書(shū)的方法進(jìn)行提取總RNA。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

利用熒光定量PCR檢測(cè)不同激素對(duì)牙鲆原代培養(yǎng)肝細(xì)胞中IGFBP-3和IGFBP-4基因的表達(dá)調(diào)控。分別以1.4中得到的總RNA為模板，設(shè)計(jì)跨內(nèi)含子引物qBP3-F/R和qBP4-F/R(見(jiàn)表1)用于熒光定量擴(kuò)增，選取牙鲆18S rRNA作為內(nèi)參基因。熒光定量PCR采用SYBR Green法，使用SYBR Premix Ex Taq，由ABI Prism 7500 Sequence Detection System(Applied Biosystems,USA)實(shí)行，并自動(dòng)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。實(shí)驗(yàn)中的每個(gè)待檢測(cè)的樣品均設(shè)置3次重復(fù)，保證準(zhǔn)確性。根據(jù)目的基因和內(nèi)參基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別計(jì)算它們的拷貝數(shù)并進(jìn)行歸一化處理。使用SPSS v1.9對(duì)歸一后的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

2 結(jié)果

2.1 牙鲆IGFBPs基因核心片段的獲得

2.2 牙鲆IGFBPs基因的組織表達(dá)分析

2.2.1 牙鲆IGFBP-3基因的組織表達(dá)分析 利用半定量PCR檢測(cè)牙鲆IGFBP-3基因在10種不同成體組織中的表達(dá)情況(見(jiàn)圖1A)。由于PCR反應(yīng)處于線性增長(zhǎng)期內(nèi)，故首先確定IGFBP-3基因半定量PCR反應(yīng)的最佳循環(huán)數(shù)。在PCR反應(yīng)進(jìn)行到20個(gè)循環(huán)后，每個(gè)循環(huán)拿出1個(gè)PCR小管，直到40個(gè)循環(huán)，從而確定各組織差異表達(dá)最佳循環(huán)數(shù)為31個(gè)循環(huán)。同時(shí)，以β-actin為內(nèi)參確定各個(gè)組織樣品的cDNA模板量在同一水平，β-actin最佳循環(huán)數(shù)為26個(gè)循環(huán)(見(jiàn)圖1C)。

半定量結(jié)果顯示(見(jiàn)圖1A)，牙鲆IGFBP-3基因在所檢測(cè)的10種成體組織中均有不同程度的表達(dá)，但存在表達(dá)差異。其中在卵巢和精巢中的表達(dá)量最高，在其他組織，如心臟、脾臟、腎臟、腸、腦、鰓絲、肌肉中的表達(dá)量相對(duì)較低，而在肝臟中的表達(dá)水平最低。

2.2.2 牙鲆IGFBP-4基因的組織表達(dá)分析 半定量PCR檢測(cè)牙鲆IGFBP-4基因組織差異表達(dá)，最佳循環(huán)數(shù)為35個(gè)循環(huán)，β-actin最佳循環(huán)數(shù)同樣為26個(gè)循環(huán)。結(jié)果顯示(見(jiàn)圖1B)，在所檢測(cè)的10種牙鲆成體組織中均能檢測(cè)到牙鲆IGFBP-4基因的不同程度的表達(dá)。該基因在腸中表達(dá)量最高，其次是腦和鰓。而在心臟、肝臟、脾臟、腎臟、肌肉、卵巢和精巢中表達(dá)量相對(duì)較低。

2.3 激素對(duì)牙鲆肝細(xì)胞中IGFBPs基因的表達(dá)調(diào)控

本實(shí)驗(yàn)從健康牙鲆分離肝臟組織，最終得到單細(xì)胞懸浮液。在顯微鏡下可觀察到細(xì)胞呈單個(gè)游離狀態(tài)，形狀為球形，體積飽滿，油脂清晰可見(jiàn)(見(jiàn)圖2)。細(xì)胞懸液中雜質(zhì)較少，偶爾可見(jiàn)由2個(gè)或以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)。在經(jīng)過(guò)0.4%臺(tái)盼藍(lán)溶液染色后，觀察到細(xì)胞的成活率>90%。

(A、B、C分別代表IGFBP-3、IGFBP-4、β-actin。H：心臟；L：肝臟；S：脾臟；K：腎臟；I：腸；B：腦；G：鰓絲；Mu：肌肉；O：卵巢；T：精巢；M：分子量標(biāo)記；NTC：陰性對(duì)照；β-actin為內(nèi)參基因。A: IGFBP-3; B: IGFBP-4; C: β-actin. H: heart; L: liver; S: spleen; K: kidney; I: intestine; B: brain; g: gill; Mu: muscle; O: ovary; T: testis; M: molecular marker; NTC: no template control; β-actin was amplified as an internal control.)

圖1 牙鲆IGFBP-3和IGFBP-4基因在成體不同組織中的表達(dá)模式

Fig.1 Expression pattern ofP.olivaceusIGFBP-3 and IGEBP-4 in different adult tissues

圖2 牙鲆肝臟組織單細(xì)胞懸液

2.3.1 激素對(duì)牙鲆肝細(xì)胞中IGFBP-3基因的表達(dá)調(diào)控 利用熒光定量PCR檢測(cè)不同激素對(duì)原代培養(yǎng)的牙鲆肝細(xì)胞中IGFBP-3基因表達(dá)的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。在濃度效應(yīng)實(shí)驗(yàn)中，GH處理24 h后可以增加IGFBP-3的表達(dá)量，但處理組之間沒(méi)有顯著變化(見(jiàn)圖3A)。以時(shí)間依賴的方式對(duì)IGFBP-3表達(dá)量起增強(qiáng)作用：在用10 nmol/L GH處理12 h后，肝細(xì)胞中IGFBP-3的表達(dá)量升至未處理組的1.65倍，并在處理后48 h時(shí)表達(dá)量保持持續(xù)上升(P<0.05)(見(jiàn)圖3B)。

與未處理組細(xì)胞相比，胰島素可以增加IGFBP-3在肝細(xì)胞中的表達(dá)，且表達(dá)量隨濃度升高而升高，當(dāng)用10 μmol/L的胰島素處理肝細(xì)胞后，IGFBP-3的表達(dá)量出現(xiàn)明顯上升，是未處理組細(xì)胞的1.49倍(P<0.05)(見(jiàn)圖3C)。而在時(shí)間效應(yīng)實(shí)驗(yàn)中胰島素對(duì)IGFBP-3的作用趨勢(shì)不是單一的：在10 μmol/L胰島素處理24h的肝細(xì)胞中，IGFBP-3的含量顯著增加；但在處理后48h，IGFBP-3的表達(dá)量反而降低，僅為未處理組的0.48倍(P<0.05)(見(jiàn)圖3D)。

在IGF-I的濃度效應(yīng)實(shí)驗(yàn)中，高濃度的IGF-I顯著提升IGFBP-3的表達(dá)。當(dāng)培養(yǎng)基中IGF-I的濃度為100和500 ng/μL時(shí)，肝細(xì)胞中IGFBP-3的表達(dá)量升至未處理組的1.40和3.35倍(P<0.05)。而用10 ng/μL的IGF-I處理肝細(xì)胞24 h時(shí)，IGFBP-3的表達(dá)量幾乎沒(méi)變化(P>0.05)(見(jiàn)圖3E)。在時(shí)間效應(yīng)實(shí)驗(yàn)中，100 ng/μL的IGF-I只在處理12 h后使IGFBP-3的含量出現(xiàn)明顯提高，是未處理組的1.91倍，隨后便開(kāi)始降低；至48 h時(shí)恢復(fù)未處理組水平(見(jiàn)圖3F)。

此外，只有高濃度的IGF-II才能增加IGFBP-3的表達(dá)。10和100 ng/μL的IGF-II對(duì)實(shí)驗(yàn)組中IGFBP-3的表達(dá)無(wú)太大影響，而500 ng/μL的IGF-II使實(shí)驗(yàn)組中IGFBP-3的含量升至未處理組的1.44倍(P<0.05)(見(jiàn)圖3G)。而不同的是，在用500 ng/μL IGF-II處理6 h后的細(xì)胞中IGFBP-3的表達(dá)量便開(kāi)始持續(xù)降低，至24 h時(shí)達(dá)到最低值，僅為未處理組的0.48倍；雖然在48 h時(shí)有所回升，但仍低于未處理組的表達(dá)量(P<0.05)(見(jiàn)圖3H)。

(A、C、E、G代表濃度效應(yīng)實(shí)驗(yàn)，B、D、F、H代表時(shí)間效應(yīng)實(shí)驗(yàn)。A和B：GH處理；C和D：胰島素處理；E和F：IGF-I處理；G和H：IGF-II處理。圖中不同的小寫(xiě)字母表示組間差異顯著。A, C, E, G: Concentration-response study; B, D, F, H: Time-response study. A and B: GH treatment; C and D: Insulin treatment; E and F: IGF-I treatment; G and H: IGF-II treatment. Data sharing different lowercase letters indicating significant difference.)

圖3 牙鲆IGFBP-3基因在激素處理后的原代培養(yǎng)肝細(xì)胞中的表達(dá)情況

Fig.3 Relative expression levels ofP.olivaceusIGFBP-3 gene in primary cultured hepatocytes after hormones treatment

2.3.2 激素對(duì)牙鲆肝細(xì)胞中IGFBP-4基因的表達(dá)調(diào)控 不同激素對(duì)原代培養(yǎng)的牙鲆肝細(xì)胞中IGFBP-4基因表達(dá)的影響如圖4所示。10和100 nmol/L濃度的GH能顯著增加肝細(xì)胞中IGFBP-4的表達(dá)(P<0.05)，而1 nmol/L GH對(duì)IGFBP-4的表達(dá)幾乎沒(méi)有影響(P>0.05)(見(jiàn)圖4A)。當(dāng)用10 nmol/L GH處理肝細(xì)胞后，在處理后6 h IGFBP-4的表達(dá)量就開(kāi)始上升，為未處理組的1.44倍(P<0.05)；隨著處理時(shí)間的延續(xù)，IGFBP-4的表達(dá)維持相對(duì)較高水平，但變化不大(見(jiàn)圖4B)。

不同濃度的胰島素處理均可以降低IGFBP-4的表達(dá)：當(dāng)培養(yǎng)基中的胰島素含量為0.1和1 μmol/L時(shí)，IGFBP-4的表達(dá)量顯著下降，分別是對(duì)照組的0.62和0.60倍(P<0.05)；當(dāng)濃度升至10 μmol/L時(shí)，IGFBP-4的含量雖有所上升，但仍比對(duì)照組少(見(jiàn)圖4C)。在時(shí)間效應(yīng)實(shí)驗(yàn)中，10 μmol/L胰島素在處理6 h后就會(huì)引起IGFBP-4表達(dá)量的下降，并維持該表達(dá)水平直到24 h；在處理48 h時(shí)表達(dá)量繼續(xù)下降，僅為未處理組的0.48倍(P<0.05)(見(jiàn)圖4D)。

IGF-I對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞中IGFBP-4表達(dá)量的影響隨著濃度的增加出現(xiàn)波動(dòng)。當(dāng)IGF-I的濃度為10 ng/μL時(shí)，IGFBP-4的表達(dá)量下降；升至100 ng/μL時(shí)，IGFBP-4的表達(dá)量卻升至未處理組的1.42倍，隨后隨著IGF-I的濃度增至500 ng/μL，IGFBP-4的表達(dá)量又下降至未處理組的0.72倍(P<0.05)(見(jiàn)圖4E)。而當(dāng)用10 ng/μL的IGF-I處理肝細(xì)胞時(shí)，IGFBP-4的表達(dá)量隨著處理時(shí)間的進(jìn)行持續(xù)下降，至48 h達(dá)到最低值，僅為未處理組的0.32倍(P<0.05)(見(jiàn)圖4F)。

IGF-II對(duì)肝細(xì)胞中IGFBP-4的表達(dá)量呈現(xiàn)先增強(qiáng)后減弱的作用趨勢(shì)。當(dāng)培養(yǎng)基中IGF-II為100 ng/μL時(shí)，IGFBP-4的表達(dá)量達(dá)到最大值，是未處理組的1.71倍(P<0.05)。但當(dāng)濃度為10和500 ng/μL時(shí)，與未處理組相比，IGFBP-4的表達(dá)量也是增加的，分別是未處理組的1.26和1.30倍(P<0.05)(見(jiàn)圖4G)。而不同的是，用500 ng/μL IGF-II處理6～24 h，IGFBP-4的表達(dá)量顯著下降，但可能不依賴處理時(shí)間的進(jìn)行，處理后48 h時(shí)IGFBP-4的表達(dá)量又出現(xiàn)回升(見(jiàn)圖4H)。

(A、C、E、G代表濃度效應(yīng)實(shí)驗(yàn)，B、D、F、H代表時(shí)間效應(yīng)實(shí)驗(yàn)。A和B：GH處理；C和D：胰島素處理；E和F：IGF-I處理；G和H：IGF-II處理。圖中不同的小寫(xiě)字母表示組間差異顯著。A, C, E, G: Concentration-response study; B, D, F, H: Time-response study. A and B: GH treatment; C and D: Insulin treatment; E and F: IGF-I treatment; G and H: IGF-II treatment. Data sharing different lowercase letters indicating significant difference.)

圖4 牙鲆IGFBP-4基因在激素處理后的原代培養(yǎng)肝細(xì)胞中的表達(dá)情況

Fig.4 Relative expression levels ofP.olivaceusIGFBP-4 gene in primary cultured hepatocytes after hormones treatment

3 討論

對(duì)于IGFBP-4來(lái)說(shuō)，之前在哺乳動(dòng)物中的研究顯示IGFBP-4 mRNA在成體各組織中均有表達(dá)。在成年大鼠中，其在所有被檢測(cè)的組織中均有分布，包括腎上腺、睪丸、脾臟、心臟、肺、腎臟、胃、下丘腦和大腦皮層，其中在肝臟表達(dá)量最高[18]。目前已得到的魚(yú)類IGFBP-4序列僅包括虹鱒IGFBP-4的部分片段和紅鰭東方鲀IGFBP-4的cDNA全長(zhǎng)。在虹鱒中，除腎臟和鰓外，其它組織能檢測(cè)到IGFBP-4[9]；同樣，在紅鰭東方鲀的各成體組織中也有IGFBP-4的分布，其表達(dá)量在肌肉中最高，脾臟中最低[13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，牙鲆的IGFBP-4基因在被檢測(cè)的10種成體組織中廣泛表達(dá)，在腸中含量最豐富，這也印證了它與哺乳動(dòng)物IGFBP-4表達(dá)的相似性。同時(shí)，這個(gè)結(jié)果也說(shuō)明IGFBP-4以細(xì)胞自分泌和/或旁分泌的方式，對(duì)于調(diào)控IGF的活性起著十分重要的作用。

人工構(gòu)建的第一個(gè)魚(yú)類永久性細(xì)胞系是Wolf和Quimby[19]在1960年代初建立的，為虹鱒的生殖腺細(xì)胞系RTG22。在這之后，越來(lái)越多的魚(yú)類細(xì)胞系逐步被建立起來(lái)，并在毒理學(xué)、魚(yú)類免疫系統(tǒng)、遺傳機(jī)制、基因組學(xué)等多方面研究中發(fā)揮作用。在魚(yú)類的細(xì)胞培養(yǎng)中，培養(yǎng)的肝臟組織能發(fā)揮肝臟的絕大部分功能。之前的研究顯示，利用鯰魚(yú)、虹鱒等魚(yú)類的肝細(xì)胞可以用來(lái)對(duì)環(huán)境污染進(jìn)行檢測(cè)[20-21]。在本研究中，IGF信號(hào)系統(tǒng)位于下丘腦-垂體-肝臟軸中，參與生物有機(jī)體的新陳代謝和生長(zhǎng)發(fā)育。肝臟是哺乳動(dòng)物IGFBPs的主要合成器官，和代謝相關(guān)的激素通過(guò)調(diào)節(jié)肝臟中IGFBPs基因的表達(dá)控制血清中IGFBPs的水平[7]。在硬骨魚(yú)中，IGF信號(hào)系統(tǒng)對(duì)于代謝調(diào)節(jié)也有著非常重要的作用，其中肝臟是參與代謝的重要器官。之前有報(bào)道指出，在魚(yú)類代謝過(guò)程中，當(dāng)肝臟中的激素刺激信號(hào)發(fā)生改變時(shí)，會(huì)產(chǎn)生典型的內(nèi)分泌反應(yīng)，從而改變肝臟mRNA的表達(dá)水平和血漿中IGFs、IGFBPs的含量[11]。因此，作者構(gòu)建了牙鲆肝臟組織細(xì)胞的原代培養(yǎng)系統(tǒng)用于體外激素調(diào)控實(shí)驗(yàn)的研究，這樣不僅節(jié)約了實(shí)驗(yàn)個(gè)體數(shù)量，同時(shí)利用體外培養(yǎng)的細(xì)胞可以防止體內(nèi)環(huán)境中未知因素的干擾，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中細(xì)胞也更容易檢測(cè)。

之前的研究通常采用機(jī)械分離法(組織塊法)或二步灌流法分離動(dòng)物的肝細(xì)胞，但機(jī)械分離法往往無(wú)法得到單細(xì)胞懸浮液，而二步灌流法主要用于分離哺乳動(dòng)物的肝細(xì)胞。在本實(shí)驗(yàn)中，使用0.25%胰蛋白酶溶液消化牙鲆的肝臟組織，最終得到單細(xì)胞懸液。同樣在銀板魚(yú)(Metynnisroosevelti)中的研究顯示，與組織塊法相比，利用消化法得到的單細(xì)胞在培養(yǎng)第5天的時(shí)候便能長(zhǎng)滿細(xì)胞培養(yǎng)瓶底的90%，而機(jī)械法得到的肝細(xì)胞鋪滿70%的瓶底需要培養(yǎng)21 d[22]。本實(shí)驗(yàn)中，在胰蛋白酶消化法之前也曾使用過(guò)機(jī)械法分離牙鲆的肝臟組織細(xì)胞，但培養(yǎng)的細(xì)胞觀察到細(xì)胞遷出需要很長(zhǎng)時(shí)間，這可能是由于肝臟組織中的內(nèi)部結(jié)構(gòu)限制了細(xì)胞的生長(zhǎng)方向，使細(xì)胞的遷出變得十分困難。而隨后用胰蛋白酶消化的到的單細(xì)胞懸液中不存在細(xì)胞之間的連接作用，消除了體內(nèi)組織的限制，使分離得到的大量肝細(xì)胞更容易生長(zhǎng)和增殖，有利于實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。此外，在牙鲆肝細(xì)胞的原代培養(yǎng)中，將細(xì)胞接種到6孔板中培養(yǎng)24 h以后，肝細(xì)胞才有貼壁情況的出現(xiàn)。在哺乳動(dòng)物中，肝細(xì)胞在培養(yǎng)4 h后，便有大量細(xì)胞貼壁的現(xiàn)象產(chǎn)生[23]。而在斑點(diǎn)叉尾鮰和虹鱒中，原代培養(yǎng)的肝細(xì)胞貼壁時(shí)間也需要過(guò)夜[24,25]。這不僅因?yàn)橄啾炔溉閯?dòng)物而言，魚(yú)類的肝細(xì)胞對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力更差，也有可能是由于經(jīng)過(guò)胰蛋白酶消化后得到的單個(gè)肝細(xì)胞，失去了體液和細(xì)胞外基質(zhì)的調(diào)控作用，也失去了細(xì)胞之間的連接作用，導(dǎo)致細(xì)胞貼壁困難。

在本實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)使用不同激素分別以不同劑量和作用時(shí)間對(duì)原代培養(yǎng)的肝細(xì)胞進(jìn)行處理，研究了不同激素對(duì)牙鲆IGFBP-4和IGFBP-3基因的表達(dá)調(diào)控。IGFBP-3可以調(diào)節(jié)IGF的活性，并容易受到激素的影響。GH是調(diào)控IGFBP-3濃度的主要激素，這種調(diào)控作用在哺乳動(dòng)物和硬骨魚(yú)中是保守的。在小鼠的β-細(xì)胞系中，GH可以影響DNA的合成和IGFBP-3的表達(dá)[26]。在羅非魚(yú)中，經(jīng)GH處理后，實(shí)驗(yàn)組所有被檢測(cè)的組織中的IGFBP-3的表達(dá)都有顯著提高[12]。另外，在斑馬魚(yú)中，注射胰島素后IGFBP-3表達(dá)量起初沒(méi)有太大變化；直到48 h后才開(kāi)始明顯增長(zhǎng)[10]。相似的結(jié)果出現(xiàn)在原代培養(yǎng)的大馬哈魚(yú)的肝細(xì)胞中，胰島素可以增加肝細(xì)胞中IGFBP基因的表達(dá)[27]。而在牛的MAC-T細(xì)胞系中，IGF-I可以引起IGFBP-3的特異性的合成來(lái)加強(qiáng)對(duì)DNA合成的刺激效應(yīng)[28]。在本文進(jìn)行的體外實(shí)驗(yàn)中，GH可以時(shí)間依賴的方式增加肝細(xì)胞中IGFBP-3的表達(dá)，在處理48 h后表達(dá)量達(dá)到最高點(diǎn)，而IGF-I的作用方式為劑量依賴方式。在哺乳動(dòng)物的血清中，注射胰島素后IGFBP-3的濃度仍處于正常范圍內(nèi)，并沒(méi)有增加。然而，作者發(fā)現(xiàn)胰島素在10μmol/L時(shí)會(huì)增加IGFBP-3的表達(dá)，胰島素的這種調(diào)節(jié)機(jī)制在哺乳動(dòng)物和魚(yú)類中可能存在著差異，具體的作用機(jī)理還不清楚。

此外，在體內(nèi)，GH、維生素D3和甲狀旁腺素(Parathyroid hormone，PTH)的處理都能夠增加血清中IGFBP-4的表達(dá)，而雌二醇能夠使人類血清中的IGFBP-4的表達(dá)量降低[29-30]。同樣的，體外實(shí)驗(yàn)顯示黃體生成素(Luteinizing hormone，LH)也可以增加IGFBP-4在牛卵巢膜細(xì)胞中的表達(dá)[31]，而在小鼠顆粒細(xì)胞中，IGFBP-4表達(dá)在一定程度上受促卵泡激素(Follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH)和IGF-I的影響，并被蛋白激酶C信號(hào)激活[32]。另外，雌激素可以刺激IGFBP-4的表達(dá)，而雄激素、孕激素、腎上腺皮質(zhì)素抑制IGFBP-4的產(chǎn)生，雌激素和孕激素對(duì)IGFBP-4的作用是由在啟動(dòng)子水平上SP1和DNA的相互作用引起的[33]。本研究中，作者發(fā)現(xiàn)GH能增加牙鲆IGFBP-4的表達(dá)，胰島素可以降低它的表達(dá)，這說(shuō)明GH和胰島素可能通過(guò)作用IGFBP-4的表達(dá)參與了對(duì)IGF活性的調(diào)節(jié)作用。此外，IGF-I對(duì)IGFBP-4的影響是波動(dòng)性的；同IGFBP-3一樣，在用高濃度IGF-II處理過(guò)的細(xì)胞中，牙鲆IGFBP-4基因的表達(dá)變化也并不完全是由IGF-II引起的。目前造成這一現(xiàn)象的原因還不清楚，而IGFs對(duì)IGFBP-3和IGFBP-4基因表達(dá)的具體調(diào)控機(jī)制也仍需要進(jìn)一步的研究。

本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了牙鲆IGFBP-3和IGFBP-4基因在成體組織中的表達(dá)模式，并分析了不同激素刺激對(duì)它們體外表達(dá)情況的調(diào)控。這為今后進(jìn)一步研究IGFBPs的表達(dá)調(diào)控機(jī)制，了解IGFBPs在IGFs信號(hào)系統(tǒng)和魚(yú)類生長(zhǎng)發(fā)育中的作用提供了材料和理論指導(dǎo)。

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責(zé)任編輯 高 蓓

Tissue Distribution and Hormonal Regulation of Insulin-Like Growth Factor Binding Proteins (IGFBPs) inParalichthysolivaceus

WANG Jing, YUAN Jun-Qing，LIU Meng-Meng, WANG Zhi-Gang, YU Hai-Yang, QI Jie, ZHANG Quan-Qi

(The Key Laboratory of Marine Genetics and Breeding, Ministry of Education, College of Marine Life Sciences, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

Insulin-like growth factor binding proteins (IGFBPs) play a crucial role in modulating IGFs biological activities, stimulating cell growth, metabolism and reproduction in vertebrates. However, current research on fish IGFBPs is not very deep. In this study, RT-PCR was performed to analyze the tissue distribution of IGFBP-3 and IGFBP-4 in Japanese flounder (Paralichthysolivaceus). The result demonstrated that IGFBP-3 mRNA was detected in all selected tissues, with the most abundant in gonads, while intestine showing the highest IGFBP-4 expression. Hormonal regulation of IGFBP-3 and IGFBP-4 was investigated using primary cultured Japanese flounder hepatocytes.Invitro, growth hormone, insulin and IGF-I modulated IGFBP-3 and IGFBP-4 expression with a dose- or time-dependent manner. These results indicated that Japanese flounder IGFBP-3 and IGFBP-4 may play an important role in varied tissuesinvivo, and the expression patterns were regulated by hormones stimulationinvitro.

Paralichthysolivaceus; insulin-like growth factor binding proteins; tissue distribution; hormonal regulation

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2012AA10A402;2012AA10A408)資助

2014-05-05；

2014-06-04

王 晶(1988-)，女，博士。E-mail：228jingjing@163.com

?? 通訊作者： E-mail：qzhang@ouc.edu.cn

Q756

A

1672-5174(2015)06-064-08

10.16441/j.cnki.hdxb.20140154