張 婧，高冬梅，汪學龍

調控宿主細胞自噬對弓形蟲在宿主細胞內增殖的影響

張 婧1，高冬梅2，汪學龍1

目的研究細胞自噬在弓形蟲增殖復制中的作用方法分別用自噬抑制劑Bafilomycin A1及自噬誘導劑氯化鋰作用于人胚胎成纖維細胞（HEF），然后將弓形蟲（RH株）速殖子懸液分別以蟲／細胞2∶1、4∶1、8∶1、16∶1感染HEF細胞，作用1、2、4、8、24、48、96 h。采用吖啶橙（AO）熒光染色和丹酰尸胺（MDC）熒光染色檢測HEF細胞自噬情況，采用Giemsa染色檢測不同時間點的弓形蟲感染復制動力學結果AO和MDC熒光染色結果表明自噬抑制劑Bafilomycin A1及自噬誘導劑氯化鋰可分別抑制和促進HEF細胞自噬，Giemsa染色結果顯示使用自噬誘導劑氯化鋰可以促進弓形蟲在HEF細胞內的增殖，使用自噬抑制劑Bafilomycin A1可以抑制弓形蟲在HEF細胞內的增殖結論調控宿主細胞自噬可調控弓形蟲增殖復制。

弓形蟲；自噬；增殖

弓形蟲病是由專性細胞內寄生的弓形蟲病原體引起的一種人獸共患寄生蟲病，廣泛流行于我國和世界各地［1－2］。傳統(tǒng)的抗弓形蟲藥物包括乙胺嘧啶、磺胺嘧啶等，但由于這些藥物的毒副作用較大，用藥時間長，只能殺死速殖子，停藥后易復發(fā)，因此極大限制了應用，至今仍沒有理想的治療弓形蟲病的藥物［3－4］。所以掌握弓形蟲在宿主細胞內增殖、致病機制以及與宿主細胞之間的相互作用也是解決弓形蟲感染的必要途徑。自噬是細胞通過單層或雙層膜包裹待降解物形成自噬體，自噬體與溶酶體的融合形成自噬溶酶體，接著進行多種酶的消化和降解，以實現(xiàn)細胞自身的代謝需要和某些細胞器的更新。自噬是細胞中初級溶酶體處理內源性底物的重要過程，同時參與維持內環(huán)境的穩(wěn)定和細胞內蛋白代謝的平衡，在清除廢物、結構重建以及細胞的生長發(fā)育中起著突出作用［5］。有研究［6］表明細胞自噬在弓形蟲感染增殖過程中很可能起重要作用。該研究通過檢測弓形蟲感染誘導宿主細胞自噬的程度，使用抑制劑、促進劑分別抑制和促進細胞自噬情況下，檢測自噬對弓形蟲感染增殖的影響；該研究將掌握自噬在弓形蟲感染致病中的作用，建立弓形蟲感染致病機制新的理論基礎，并為有效的干預和治療提供新的途徑。

1 材料與方法

1．1 人胚胎成纖維（human embryonic fibroblasts，HEF）細胞HEF細胞購自安徽醫(yī)科大學病原生物學教研室。

1．2 實驗動物5～7周齡雌性昆明小鼠購自安徽醫(yī)科大學實驗動物中心。室溫20～22℃下給予自由進食、飲水，標準顆粒飼料喂養(yǎng)。

1．3 主要試劑和器材胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購于美國HyClone公司；胰蛋白酶、雙抗、Giemsa染色粉劑等購于上海生物工程公司；培養(yǎng)瓶購于美國Corning公司；自噬抑制劑Hydroxychloroquine、Bafilomycin A1、自噬誘導劑氯化鋰、Carbamazepine以及吖啶橙（acridine orange，AO）和丹酰尸胺（monodansylcadaverine，MDC）熒光染色試劑均購于美國Sigma公司。

1．4 方法

1．4．1 弓形蟲RH株的保種和純化 生理鹽水適當稀釋后接種小鼠腹腔，每鼠約接種3×106個速殖子，體內常規(guī)轉種2代后用于實驗。無菌抽取小鼠腹水以PBS（pH 7．2）緩沖液洗滌2次，純化速殖子后備用。

1．4．2 MDC熒光染色檢測細胞自噬 MDC是自噬空泡的標志物，通過MDC染色可以觀察判斷細胞自噬過程的發(fā)生。取對數(shù)生長期HEF細胞，經消化制成細胞懸液，以5×104細胞／孔數(shù)接種于24孔板中，細胞貼壁后，按照實驗分組：①正常組（HEF細胞）；②對照組（RH株＋HEF細胞）；③自噬抑制劑組（自噬抑制劑＋RH株＋HEF細胞）；④自噬誘導劑組（自噬誘導劑＋RH株＋HEF細胞）。在藥物處理24 h后，PBS洗2遍，棄上清液，PBS洗2遍，加入終濃度50 μg／L MDC，37℃孵育60 min，PBS洗2遍。激光共聚焦顯微鏡觀察細胞自噬空泡的變化并進行熒光定量分析。

1．4．3 AO熒光染色檢測細胞自噬 AO熒光染色，取AO粉末溶于PBS（0．01 mmol／L，pH 7．4）中，終濃度0．5 μg／ml，分裝后4℃保存?zhèn)溆谩Ｈ?2 mm×22 mm的蓋玻片用無水乙醇浸泡去脂，紫外線消毒后放人6孔培養(yǎng)板中。取對數(shù)生長期HEF細胞以1×106細胞／孔密度接種于6孔板內蓋玻片上培養(yǎng)，每孔2 ml，加藥組加人自噬抑制劑使終濃度達10 nmol／L，處理24 h后，傾去培養(yǎng)液，用PBS洗滌2次，加入AO染色液使終濃度為0．5 μg／ml，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育10 min，用PBS洗滌2次，取出蓋玻片，激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察、拍照。

1．4．4 Giemsa染色 稱取Giemsa粉末0．5 g，加幾滴甘油研磨，再加入甘油，使加入的甘油總量為33 ml。56℃中保溫90～120 min。加入33 ml甲醇，置棕色瓶中保存，此為Giemsa原液。使用時按要求用PBS稀釋。一般稀釋10倍。

2 結果

2．1 MDC熒光染色檢測細胞自噬空泡的變化MDC是自噬空泡的標志物，通過MDC染色可以觀察判斷細胞自噬過程的發(fā)生。MDC染色結果表明單獨應用弓形蟲作用于HEF細胞時，細胞內無明顯自噬空泡出現(xiàn)。MDC染色結果表明單獨應用弓形蟲感染HEF細胞時，細胞內無明顯自噬空泡出現(xiàn)，熒光定量分析平均熒光強度為（99．1±15．3）%，與對照組（109．6±35．2）%平均熒光強度相比，差異無統(tǒng)計學意義。使用自噬誘導劑作用24 h，細胞內大量自噬空泡積聚，平均熒光強度為（209．8± 62．8）%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．01），表明有自噬發(fā)生；當加入自噬抑制劑作用，與對照組相比，自噬空泡明顯減少，平均熒光強度為（88．2± 24．1）%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．01），見圖1。

2．2 AO染色檢測自噬泡的變化細胞酸性自噬泡（acidic vesicular organeles，AVO）的形成是細胞自噬的特異過程。AO染色將細胞內的酸性部分染成亮紅色，紅色熒光的亮度表明酸性強度。單獨應用弓形蟲感染HEF細胞時，細胞內無明顯自噬泡出現(xiàn)，熒光定量分析平均熒光強度為（88．6± 13．1）%，與對照組（99．3±21．5）%平均熒光強度相比差異無統(tǒng)計學意義。使用自噬誘導劑作用24 h，細胞內大量紅色酸性泡積聚，平均熒光強度為（196．8±43．2）%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．01），表明有自噬發(fā)生；當加入自噬抑制劑作用，與對照組相比，酸性小泡明顯減少，平均熒光強度為（70．6± 36．1）%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．01），見圖2。熒光顯微鏡下觀察酸性自噬小體的形成，流式細胞儀檢測酸性自噬小體的形成隨時間的延長數(shù)量越來越多，96 h細胞被弓形蟲破壞殆盡，見表1。

表1 AO熒光染色流式細胞儀檢測HEF細胞AVO的形成（±s）

與感染1 h組比較：*P＜0．05，**P＜0．01

時間（h）AVO（%）1 8．1±2．3 8 18．2±4．6*2424．0±3．8*4836．3±4．2**960**

結果顯示，在不同時間段AO熒光染色流式細胞儀檢測HEF細胞酸性小泡形成的過程中，在作用8 h組、24 h組和48 h組、96 h組與感染1 h組相比自噬泡形成數(shù)量差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05，P＜0．01），表明酸性自噬小體的形成隨時間的延長數(shù)量越來越多，直到96 h細胞被弓形蟲完全破壞。

2．3 弓形蟲速殖子在細胞內增殖動力學檢測分別加入HEF細胞于含1塊蓋玻片18 mm×18 mm 6孔板內，當細胞融合至80%時，另換2%FCS的DMEM高糖培養(yǎng)液（含2 mmol／L L-谷氨酰胺25 mmol／L），12 h各培養(yǎng)孔加入純化的速殖子1×104個于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，共培養(yǎng)1、4、8、12、24、48和96 h后取出6孔板內蓋玻片以PBS（pH 7．2）洗滌2次，甲醇固定后吉氏染色30 min，油鏡觀察細胞內蟲體增殖情況并照相記錄，抑制細胞形態(tài)略有殘缺。HEF細胞與弓形蟲共培養(yǎng)8 h絕大多數(shù)速殖子進入HEF細胞；隨著細胞內蟲體的進一步增殖，24 h可見蟲體在HEF細胞中形成明顯的“假包囊”排列成菊花狀，蟲體在HEF明顯增殖，有少量速殖子脹破細胞游離于培養(yǎng)液中；96 h HEF細胞被破壞殆盡，見圖3。

為了進一步探討自噬抑制劑和自噬誘導劑作用后對弓形蟲增殖的影響，在弓形蟲接種HEF細胞的不同時間點里本實驗選取24 h為檢測時間點，3組細胞內的弓形蟲速殖子個數(shù)所占百分比。自噬抑制劑組細胞內弓形蟲速殖子個數(shù)主要以2～8個為主，自噬誘導劑組細胞內弓形蟲速殖子個數(shù)主要以4～8個為主，前者與后者相比，增殖速率明顯放慢，見圖4。

3 討論

在弓形蟲感染的過程中，通過影響宿主細胞自噬信號通路很可能改變弓形蟲的復制及其致病效應。程序性細胞死亡是病原體一種重要的致病機制以及病原體與宿主細胞相互作用的途徑［7］。程序性細胞死亡作為宿主細胞機體免疫的一部分，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)對許多病原體都有作用，有些病原體能夠被細胞程序性死亡直接殺傷，也可以通過獲得性免疫被間接消滅，但是也有某些病原體通過進化能夠逃避程序性細胞死亡的識別，甚至通過程序性細胞死亡為自身的復制和發(fā)育提供便利［8－9］。程序性細胞死亡分為兩種：Ⅰ型為細胞凋亡，Ⅱ型是自噬性細胞死亡。自噬和凋亡在一些情況下相互聯(lián)系，并可能有著共同的調節(jié)機制：①自噬可能是細胞凋亡的一種前提—自噬發(fā)生于細胞凋亡之前并進一步上調后者的活性；②在一些細胞內環(huán)境，促進自噬可抑制凋亡，同樣抑制自噬可能增加細胞對凋亡信號的敏感性；③細胞自噬和細胞凋亡在一些環(huán)境下可相互轉化［10］。

在自噬的檢測方面，MDC染色法和AO染色法等是目前使用較多的方法，常被認為是自噬檢測的金標準之一。MDC是自噬空泡的標志物，通過MDC染色可以觀察判斷細胞自噬過程的發(fā)生；AO是一種弱堿性熒光染料，可選擇性滯留在酸性的溶酶體及自噬小體中。熒光顯微鏡下可進行定性判斷，若配合流式細胞儀，則可進行定量分析，因而也被用于自噬的檢測［11］。本研究通過利用MDC熒光染色和吖啶橙熒光染色的方法證明相同細胞在不同時間點不同誘導因素可誘發(fā)不同的自噬結果［12－13］。

使用自噬抑制劑、促進劑作用后不同時間點的弓形蟲感染復制動力學檢測以及形態(tài)檢測，判斷自噬在弓形蟲增殖復制過程中的作用；進行弓形蟲形態(tài)學檢測：Giemsa染色觀察弓形蟲速殖子在各組細胞內的寄生；弓形蟲增殖檢測：Giemsa染色觀察弓形蟲速殖子在細胞內的胞內平均增殖數(shù)；觀察分析并記錄Giemsa染色檢測弓形蟲在不同時間點不同誘導因素下的增殖情況結果顯示，8 h的共培養(yǎng)絕大多數(shù)速殖子進入HEF細胞，隨著細胞內蟲體的進一步增殖，24 h可見蟲體在HEF細胞中形成明顯的“假包囊”在細胞內排列成菊花狀，蟲體在HEF明顯增殖，有少量速殖子脹破細胞游離于培養(yǎng)液中，在96 h HEF細胞被完全破壞。所以選取24 h為檢測點發(fā)現(xiàn)3組細胞內的弓形蟲速殖子個數(shù)所占百分比，結果顯示誘導劑組比抑制劑組增殖速率明顯加快結果表明弓形蟲感染后可促進HEF細胞自噬，促進HEF細胞自噬可以促進弓形蟲在宿主細胞內的增殖，調控宿主細胞自噬可調控弓形蟲增殖復制。

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Influence of regulation of host cell autophagy on the proliferation of Toxoplasma gondii in host cells

Zhang Jing1，Gao Dongmei2，Wang Xuelong1
（1Dept of Parasitology，Anhui Medical University，Hefei 230032；2Dept of Laboratory，The First People′s Hospital of Hefei，Hefei 230061）

ObjectiveTo study the role of autophagy in the replication process of Toxoplasma proliferation．Methods As the experimental groups，these cells were infected by Toxoplasma gondii tachyzoites at given MOI（2∶1，4∶1，8∶1，16∶1）．Host cell autophagy was detected through acridine orange staining and MDC fluorescence staining at different time points（1，2，4，8，24，48，96 hs post infection）．Detect the condition of HEF cells autophagy with acridine orange fluorescence staining and MDC fluorescence staining，and detect the replication kinetics of Toxoplasma gondii infection at different time points using Giemsa staining．Results The results of acridine orange and MDC fluorescence staining showed that autophagy inhibitors and inducers could inhibit and promote the autophagy of HEF cells respectively．From the results of Giemsa staining，it was found that the proliferation of Toxoplasma gondii in HEF cells could be promoted with autophagy inducers and be inhibited with autophagy inhibitors．Conclusion The regulation on autophagy of host cell could regulate the proliferation and replication of Toxoplasma gondii．

Toxoplasma gondii；autophagy；proliferation

R 382．5

A

1000－1492（2015）03－0290－04

2014－11－23接收

國家自然科學基金（編號：81101273）；安徽省教育廳高校省級自然科學研究項目（重點）（編號：KJ2013A149）

1安徽醫(yī)科大學病原生物學教研室，合肥 230032

2安徽醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院（合肥市第一人民醫(yī)院）檢驗科，合肥 230061

張 婧，碩士研究生；汪學龍，男，教授，碩士生導師，責任作者，E-mail：wangxl1964＠163．com