林堆賢 梅寶富 鄧志鋒 陳俊輝

[摘要] 目的 探討射頻消融（RFA）對肺癌患者CD4+ T淋巴細胞亞群抗腫瘤免疫功能的影響。 方法 選取本院2012年8月～2014年8月收治的30例肺癌患者作為研究對象，給予RFA治療，分別于術前、術后半個月采集外周血，比較治療前后的Th1、Th2、Th17、Treg細胞水平。 結果 RFA術后半個月的外周血Th1水平及Th1/Th2比值顯著高于術前，Th2、Th17、Treg水平顯著低于術前，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。 結論 RFA能夠改善肺癌患者CD4+T細胞亞群的抗腫瘤免疫功能。

[關鍵詞] 肺癌；射頻消融；CD4+ T淋巴細胞亞群；免疫功能

[中圖分類號] R734.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2016）03（b）-0055-03

[Abstract] Objective To explore the influence of the radiofrequency ablation （RFA） on the anti-tumor immune function of CD4+ T lymphocyte subsets in patients with lung cancer. Methods 30 patients with lung cancer from August 2012 to August 2014 in our hospital were selected as the research group，the therapy of RFA was given.Peripheral blood was collected before and after operation half a month，the level of Th1，Th2，Th17，Treg cell was compared respectively. Results The level of Th1 and Th1/Th2 ratio after RFA operation at half a month was higher than that before operation，the level of Th2，Th17，Treg cell after RFA operation at half a month was lower than that before operation，with significant difference （P<0.05）. Conclusion RFA can improve the anti-tumor immune function of CD4+ T lymphocyte subset in patients with lung cancer.

[Key words] Lung cancer；Radiofrequency ablation；CD4+ T lymphocyte subset；Immune function

肺癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，在我國城鎮(zhèn)居民腫瘤死亡原因中居于首位，大多數(shù)患者確診時已經失去了手術切除的機會[1-2]。射頻消融（radiofrequency ablation，RFA）的原理是應用頻率在460～480 kHz之間的交變高頻電流使腫瘤組織內離子發(fā)生高速震蕩，互相摩擦，將射頻能轉化為熱能，使局部溫度達到60～100℃，導致腫瘤組織發(fā)生凝固性壞死[2]。2000年Dupuy等[3]首次報道利用RFA治療肺癌。RFA具有安全性高、創(chuàng)傷小、療效確切、術后恢復快等特點，已成為肺癌治療的有效方法之一[2-4]。其在直接損毀腫瘤組織的同時，也可使CD4+ T淋巴細胞升高，改善機體的抗腫瘤免疫功能[5-6]。CD4+ T細胞為不均一細胞群，研究[7-8]顯示，其主要有Th1細胞（輔助性1型T細胞，type 1 helper T cells）、Th2細胞（輔助性2型T細胞，type 2 helper T cells）、Th17細胞（IL-17 producing CD4+ T cells）、Treg細胞（調節(jié)性T細胞，regulatory T cell）4種不同的亞群。各淋巴細胞亞群介導不同的免疫功能，在體內又相互作用、相互影響。本研究通過檢測Th1、Th2、Th17及Treg4種不同的CD4+ T細胞亞群，旨在探討RFA對肺癌患者CD4+ T細胞抗腫瘤免疫功能的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2012年8月～2014年8月本科收治的30例肺癌患者作為研究對象，術前均進行穿刺活檢或纖維支氣管檢查，病理確診為肺癌，其中男19例，女11例；年齡31～70歲，平均48.7歲；腺癌18例，鱗癌12例；Ⅰ期1例，Ⅱ期3例，Ⅲ期17例，Ⅳ期9例。所有患者術前未接受放化療，無自身免疫性疾病。本研究經本院醫(yī)學倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。

1.2 RFA治療

射頻消融采用美國達隆公司生產的RF2000射頻治療儀及可伸展錨狀射頻電極針，集束電極射頻針為套管針，可呈放射狀釋放出12根微電極針。所有患者采用氣管插管靜吸復合麻醉，在CT引導下行經皮穿刺肺癌射頻消融治療。術中根據(jù)病灶的大小、位置，避開氣管、支氣管、大血管等重要結構，確定射頻電極針的皮膚進針點、穿刺路線及穿刺深度。穿刺射頻針到達病灶后，釋放微電極，開始RFA治療，局部病灶內溫度可達90～100℃，治療過程由計算機自動控制。退針時行針道消融。

1.3 CD4+ T淋巴細胞亞群的檢測

采用流式細胞術檢測CD4+ T細胞亞群。FACS Canto流式細胞儀購自美國Becton Dickinson公司，熒光素偶聯(lián)鼠抗人單克隆抗體（CD3-PE-Cy5、CD3-APC、CD4-PE-Cy5、CD8-APC-Cy7、CD25-FITC、IFN-γ-APC、IL-17-FITC、IL-4-PE、foxp3-PE）購自美國BD Bioscience公司。檢測方法：治療前及治療后半個月清晨用肝素鋰抗凝管收集肺癌患者空腹外周靜脈血5 ml，即行流式細胞術檢測。采用熒光素偶聯(lián)的單克隆抗體CD3-PE-Cy5、CD8-APC-Cy7、IFN-γ-APC、IL-17-FITC及IL-4-PE對細胞表面抗原及胞內細胞因子進行直接標記，通過檢測細胞因子的IFN-γ、IL-4、IL-17分析Th1、Th2、Th17的細胞水平，染色后上機測定各項指標，以FACS Diva軟件分析Th1、Th2、Th17細胞占CD4+ T細胞的百分率。Treg細胞的特征表型分子是CD3+CD4+CD25+foxp3+，以熒光素偶聯(lián)的單克隆抗體CD3-APC、CD4-PE-Cy5、CD25-FITC及Foxp3-PE對特征表型分子進行直接標記，染色后上機測定各項指標，以FACS Diva軟件分析Treg細胞占CD4+ T細胞的百分率。

1.4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 15.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計量資料以x±s表示，采用t檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

RFA術后半個月的外周血Th1水平及Th1/Th2比值顯著高于術前，Th2、Th17、Treg水平顯著低于術前，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）（表1）。

3 討論

腫瘤患者免疫功能低下和紊亂，腫瘤細胞所分泌的細胞因子可抑制機體宿主的抗腫瘤反應，免疫功能低下又促進了腫瘤細胞的生長，增加了腫瘤的轉移和復發(fā)。細胞免疫在機體抗腫瘤免疫中發(fā)揮著主要作用，其主要免疫活性細胞為T淋巴細胞，而CD4+ T細胞是效應T細胞的重要成分[9]。根據(jù)分泌細胞因子不同，CD4+ T細胞主要包括Th1細胞、Th2細胞、Th17細胞及Treg細胞4種亞群，各亞群主要通過分泌不同的細胞因子發(fā)揮作用[7，10-11]。Th1細胞主要分泌γ-干擾素（IFN-γ）、白介素-2（IL-2）、腫瘤壞死因子β（TNF-β）等[7，10]，活化的Th1細胞及其細胞因子具有較強的抗腫瘤活性和免疫調節(jié)作用。IFN-γ可抑制腫瘤血管生成，誘導腫瘤細胞凋亡；IL-2可刺激自然殺傷細胞（natural killer cell，NK細胞）殺瘤活性；TNF-β可直接造成腫瘤細胞的凋亡[10，12-13]。Th2細胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13[10]，IL-4和IL-10可抑制Th1類細胞因子的應答，促進腫瘤生長，與Th1細胞相互拮抗[15-16]，機體Thl型細胞占優(yōu)勢時有利于機體的抗腫瘤反應。肺癌患者存在Th1/Th2免疫失衡，當Th2細胞占優(yōu)勢時，能夠抑制Th1型細胞因子的產生，使機體抗腫瘤免疫功能減弱，導致肺癌細胞容易逃避細胞免疫的監(jiān)視，進而加速腫瘤的進展[12，14-15]。Th17細胞能夠特異性地分泌IL-17，而IL-17可以激活活化信號轉導與轉錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3），上調血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）表達，進而促進肺癌血管形成[17]；能夠誘導結合鋅指蛋白1（zinc finger E-box binding homeobox 1，ZEB1）表達，促進肺癌侵襲與轉移[18]。Treg細胞能夠抑制正常的抗腫瘤功能，與肺癌患者分期與進展相關[19]。通過抑制CD4+和CD8+ T細胞的活化、增殖，分泌顆粒酶、穿孔素殺傷效應細胞，介導腫瘤的免疫耐受[10，20]。

已有研究[5-6]顯示，RFA術可使肺癌的外周血CD4+ T細胞升高，進而改善細胞的抗腫瘤免疫功能。本研究結果顯示，RFA術后CD4+ T細胞亞群的變化表現(xiàn)為Th1水平及Th1/Th2比值較術前升高，Th2、Th17、Treg細胞水平較術前降低。Th1水平及Th1/Th2值較術前升高有助于糾正Th1/Th2細胞免疫失衡，增強Th1的抗腫瘤免疫功能；Th17細胞水平降低，IL-17分泌減少，可減弱IL-17對肺癌血管促生長及肺癌的侵襲、轉移作用。RFA術后外周血Treg細胞降低，有助于減弱Treg細胞對腫瘤患者免疫功能的負調節(jié)作用，改善抗腫瘤免疫功能。

綜上所述，RFA術利用高溫損毀局部腫瘤，可使其完全滅活，在一定時間內又能夠改善機體的抗腫瘤免疫功能。其能否對遠期效應產生影響，尚需大樣本、多中心研究，而RFA引起淋巴細胞變化的機制也需更深入地研究。

[參考文獻]

[1] 楊海.支氣管動脈化療栓塞聯(lián)合125I放射性粒子植入術治療老年非小細胞肺癌的效果分析[J].中國當代醫(yī)藥，2015， 22（17）：38-40.

[2] 劉寶東，支修益.影像引導射頻消融治療肺部腫瘤專家共識（2015年版）[J].中國肺癌雜志，2015，18（5）：251-259.

[3] Dupuy DE，Zagoria RJ，Akerley W，et al.Percutaneous radiofrequency ablation of malignancies in the lung[J].Am J Roentgenol，2000，174（1）：57-59.

[4] 曾川，張獻全.肺癌的射頻消融治療現(xiàn)狀及進展[J].中華肺部疾病雜志·電子版，2015，8（2）：99-101.

[5] 陳理明，李曉潔，蔡應木，等.肝癌肺癌患者射頻消融治療后細胞免疫功能變化[J].實用醫(yī)學雜志，2006，22（21）：2467-2468.

[6] 鄧振領，張萬久，韓玥，等.射頻消融抑制小鼠乳腺癌肺轉移[J].中華腫瘤雜志，2015，37（7）：497-500.

[7] Zhu JF，Paul WE.CD4 T cells：fates，functions，and faults[J].Blood，2008，12（5）：1557-1569.

[8] Ivanova EA，Orekhov AN.T helper lymphocyte subsets and plasticity in autoimmunity and cancer：an overview[J].Biomed Res Int，2015，2015：327470.

[9] 熊佳時，何剛，李士英，等.非小細胞肺癌患者外周血T細胞亞群、NK細胞與臨床分期及預后的相關性[J].臨床肺科雜志，2015，20（7）：1183-1186.

[10] 何維.醫(yī)學免疫學[M].2版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2010：189-192.

[11] Gasper DJ，Tejera MM，Suresh M.CD4 T-cell memory generation and maintenance[J].Crit Rev Immunol，2014，34（2）：121-146.

[12] 李軍，石殿鵬.肺癌與T淋巴細胞亞群相關性研究[J].中華肺部疾病雜志，2015，8（2）：110-112.

[13] Boost KA，Sadik CD，Bachmann M，et al.IFN-gamma impairs release of IL-8 by IL-1beta-stimulated A549 lung carcinoma cells[J].BMC Cancer，2008，（8）：265.

[14] Li J，Wang Z，Mao K，et al.Clinical significance of serum T helper 1/T helper 2 cytokine shift in patients with non-small cell lung cancer[J].Oncol Lett，2014，8（4）：1682-1686.

[15] Nguyen AH， Berim IG，Agrawal DK.Cellular and molecular immunology of lung cancer：therapeutic implications[J].Expert Rev Clin Immunol，2014，10（12）：1711-1730.

[16] 范小斌，林秋雄，羅燕飛.Hsa-miR202通過下調IL-10的表達抑制肺癌A549細胞的增殖[J].中國腫瘤臨床，2014，41（23）：1512-1516.

[17] Pan B，Shen J，Cao J，et al.Interleukin-17 promotes angiogenesis by stimulating VEGF production of cancer cells via the STAT3/GIV signaling pathway in non-small-cell lung cancer[J].Sci Rep，2015，（5）：16053.

[18] Gu K，Li MM，Shen J，et al.Interleukin-17-induced EMT promotes lung cancer cell migration and invasion via NF-κB/ZEB1 signal pathway[J].Am J Cancer Res，2015， 5（3）：1169-1179.

[19] 吳杰，陳文虎，張鈞，等.肺癌患者外周血調節(jié)性T細胞的變化及其與臨床病理因素的關系[J].中華微生物學和免疫學雜志，2014，34（9）：687-690.

[20] 何燕超，施勁東，梅周芳，等.非小細胞肺癌患者外周血Thl7和Treg表達的意義[J].復旦學報·醫(yī)學版，2015， 42（3）：362-367.