王元元陸楊唐潔查成柴繼俠賀文欣胡小冬謝長好

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·論著·

濾泡輔助性T細胞在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血中的變化

王元元1陸楊2唐潔3查成3柴繼俠1賀文欣1胡小冬1謝長好2

【摘要】目的 檢測系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）患者外周血濾泡輔助性T細胞（T follicular helper cells，Tfh）的表達變化，探討Tfh細胞在SLE發(fā)病中的意義。方法 應用流式細胞儀檢測32例SLE患者和28例健康對照者外周血Tfh細胞的表達水平，以及CD3+T細胞、CD4+T細胞、CD3+CD4+CXCR5+T細胞的表達水平。結果 SLE患者組外周血Tfh細胞百分率高于健康對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。CD3+T細胞百分率、CD3+CD4+T細胞百分率及CD3+CD4+CXCR5+T細胞百分率與健康對照組差異均無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）。結論 SLE患者外周血Tfh細胞的表達水平明顯升高，可能在其發(fā)病過程中起一定作用。

【關鍵詞】系統(tǒng)性紅斑狼瘡；濾泡輔助性T細胞；流式細胞術

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一個慢性全身性自身免疫性結締組織病，它以多克隆B細胞高度活化增殖、免疫球蛋白增多和多種自身抗體的生成為特征，發(fā)病機制尚不明確。隨著Tfh細胞亞群的發(fā)現(xiàn)及對B細胞分化、成熟和抗體分泌功能的不斷認識［1］，Tfh細胞在SLE發(fā)生發(fā)展中的重要作用日益顯現(xiàn)。Tfh細胞表達轉錄因子Bcl-6［2］，標志性表達CXCR5，可誘導T細胞共刺激因子（inducible T cell costimulator，ICOS）、程序性死亡分子1（programmed death1，PD-1）等表面分子［3］。PD-1調節(jié)生發(fā)中心B細胞的存活和選擇，是漿細胞形成的必要因素［4］，因此以CD3+CD4+CXCR5+PD-1+定義Tfh細胞。筆者運用流式細胞術檢測SLE患者外周血Tfh細胞水平，以探討Tfh細胞對SLE發(fā)病機制的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

32例SLE患者來自蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院風濕免疫科2016 年3月～2016年5月住院患者，其中男1例，女31例，平均年齡（40.50±12.16）歲，臨床診斷符合美國風濕病學會（ARA）1997年修訂的分類標準。所有患者無風濕性關節(jié)炎、強制性脊柱炎等其他的自身免疫性疾病。健康對照組28例，均為健康志愿者，男4例，女24例，平均年齡（37.86±7.80）歲。兩組性別、年齡差異無統(tǒng)計學意義（P=0.470，P＞0.05）。

1.2 試劑和儀器

FITC標記的抗PD-1單克隆抗體及其同型對照抗體，PE標記的抗CXCR5單克隆抗體及其同型對照抗體，PerCP標記的抗CD4單克隆抗體均為美國eBioscience公司產(chǎn)品；APC標記的抗CD3單克隆抗體，為美國Biolegend公司產(chǎn)品；流式細胞儀為FACSVerse，美國Becton Dickinson公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 直接免疫熒光標記 采集受試者清晨空腹狀態(tài)下外周靜脈血2 ml，EDTA抗凝，血標本在6 h內(nèi)上流式機檢測。取流式試管8支，試管1中未加入抗體，為調節(jié)各熒光通道的電壓用；試管2、3、4、5為調熒光通道補償用；試管6為同型對照用，加入熒光抗體CD3-APC、CD4-PerCP、MouseIgG2b-PE，試管7為同型對照用，加入熒光抗體CD3-APC、CD4-PerCP、CXCR5-PE、MouseIgG1-FITC，試管8為測試管，加入熒光抗體CD3-APC、CD4-PerCP、CXCR5-PE、PD-1-FITC。血標本50 μl分別加入到上述8支流式管中，與熒光抗體充分混勻，室溫避光放置15 min；加入溶血劑1 ml/管，充分震蕩混勻，室溫避光放置10 min，使紅細胞充分裂解；離心1 500 r/min×5 min，倒上清液；加入染色緩沖液（SB）1 ml/管，洗滌，再次離心，1 500 r/min×5 min，倒上清液；最后加入1%多聚甲醛（PFA）固定液300 μl/管，流式機檢測。

1.3.2 流式細胞儀檢測 運用FACSVerse流式細胞儀，設置相應各通道電壓和通道之間熒光補償后，經(jīng)FSC、SSC設定淋巴細胞群為P1門，以CD3定義T細胞；CD3、CD4定義CD4+T細胞；CD3、CD4、CXCR5、PD-1定義Tfh細胞。測定CD3+T細胞占淋巴細胞百分率、CD4+T細胞占CD3+T細胞百分率、CD4+CXCR5+T細胞占CD4+T百分率和Tfh細胞占CD4+T百分率，見圖1。

1.4 統(tǒng)計學分析

運用統(tǒng)計學軟件SPSS 17對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計描述和分析，結果以（±s）表示，兩組間的比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

圖1 SLE患者外周血CD4+T細胞，CD4+CXCR5+T細胞，Tfh細胞的測定

2 結果

SLE患 者 外 周 血CD3+T細 胞、CD4+T細 胞、CD3+CD4+CXCR5+T細胞和Tfh細胞的表達：SLE患者組和健康對照組外周血CD3+T細胞占淋巴細胞的百分率，CD4+T細胞占CD3+T細胞的百分率，CD3+CD4+CXCR5+T細胞占CD4+T細胞的百分率，Tfh細胞占CD4+T細胞的百分率見下表。SLE患者組Tfh細胞表達高于健康對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。其余差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05，見表1）。

表1 SLE患者組及健康對照組外周血CD3+T細胞、CD3+CD4+T細胞、CD3+CD4+CXCR5+T細胞及Tfh細胞的表達（%）

3 討論

SLE的發(fā)病機制尚不明確，以多克隆B細胞高度增殖活化、免疫球蛋白增多和多種自身抗體的生成為特征，而近年來發(fā)現(xiàn)的Tfh細胞則在B細胞增殖分化、刺激免疫球蛋白分泌中發(fā)揮重要作用。其表面表達趨化因子受體CXCR5和轉錄因子Bcl-6以及ICOS、PD-1等表面分子，分泌IL-21、IL-17等細胞因子。

本研究中，SLE患者組外周血CD3+T細胞占淋巴細胞百分率、CD4+T細胞占CD3+T細胞百分率與健康對照組差異無統(tǒng)計學意義，而CD3+CD4+CXCR5+T細胞占CD4+T細胞百分率與健康對照組之間雖無明顯差異，但其中表達PD-1的這群CD3+CD4+CXCR5+T細胞亞群，即Tfh細胞，它的表達卻高于健康對照組，這提示Tfh細胞的高表達可能與SLE的發(fā)生有關。

B細胞分化、增殖、突變，高親和力B細胞出現(xiàn)及長效記憶性B細胞出現(xiàn)和漿細胞分化都需要在淋巴濾泡生發(fā)中心中完成。淋巴濾泡生發(fā)中心形成、抗原特異性記憶B細胞和漿細胞的產(chǎn)生都必須CD4+T細胞的參與［5］。CD4+T細胞在不同的細胞因子、微環(huán)境的影響下分化為不同的CD4+T細胞亞類，這些效應細胞亞類有不同的作用，其中Th1細胞介導細胞免疫，Th2細胞介導抗細胞外寄生蟲免疫，Th17細胞介導皮膚黏膜免疫和抗微生物感染免疫，而Tfh細胞則在生發(fā)中心與B細胞相互作用，輔助B細胞活化或分化，并幫助產(chǎn)生長效抗體反應［6-7］。若Tfh細胞升高則產(chǎn)生大量Ig［8］。MRL/lpr狼瘡鼠缺乏生發(fā)中心，但是在濾泡外有Tfh樣細胞，此類細胞可以輔助B細胞發(fā)生免疫球蛋白類別轉換，誘導B細胞分泌免疫球蛋白［9］。在獲得性系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠模型中，Tfh細胞分化的負性調節(jié)蛋白-Roquin蛋白突變?nèi)笔?，導致Tfh數(shù)量增高，最終導致系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)生［10］。Rui YX等［11］研究發(fā)現(xiàn)，B細胞與CD4+T細胞作用后，PD-1在Tfh細胞表面表達上調。Tfh表達的CXCR5和配體CXCL15結合，引導Tfh細胞進入B細胞濾泡，形成生發(fā)中心［12］，生發(fā)中心B細胞在其協(xié)助下分化為記憶型B細胞和漿細胞，在記憶型B細胞和漿細胞的表面均可檢測到PD-1的表達［13］。以上實驗結果初步證明了SLE患者存在功能異常表達的Tfh細胞，與SLE的發(fā)生密切相關。

綜上所述，Tfh細胞可能參與SLE的發(fā)病過程，但其在SLE發(fā)病中的具體作用機制尚不清楚，仍需對其進一步研究。

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【中圖分類號】R593

【文獻標識碼】A

【文章編號】1674-9308（2016）15-0039-03

doi：10.3969/j.issn.1674-9308.2016.15.024

基金項目：安徽省高等學校自然科學研究一般項目（KJ2015B009by） 安徽省高等學校自然科學研究重點項目（KJ2016A475） 安徽省高等學校自然科學研究一般項目（KJ2013B139）

作者單位：1 安徽省蚌埠醫(yī)學院組織學與胚胎學教研室，安徽 蚌埠233030；2 安徽省蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院風濕免疫科，安徽 蚌埠233004；3 安徽省蚌埠醫(yī)學院科研中心，安徽 蚌埠 233030

通訊作者：謝長好，E-mail：uglboy2002@126.com

The Increace of Tfh Cells From the Peripheral Blood of Patients With Systemic Lupus Erythematosus

WANG Yuanyuan1LU Yang2TANG Jie3ZHA Cheng3CHAI Jixia1HE Wenxin1HU Xiaodong1XIE Changhao2
1 Department of Histology and Embryology， Bengbu Medical College， Bengbu Anhui 233030， China， 2 Department of Rheumatology and Immunology， The First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College， Bengbu Anhui 233004， China， 3 Research Center， Bengbu Medical College， Bengbu Anhui 233030， China

［Abstract］Objective To detect expression of Tfh cells from the peripheral blood of patients with systemic lupus erythematosus （SLE） and discuss Tfh significance in SLE pathogenesis. Methods The expression of Tfh cells，CD3+T， CD4+T and CD3+CD4+CXCR5+T was examined in 32 SLE patients and 28 healthy controls （HC） by flow cytometry. Results The Proportions of Tfh cells were significantly increased in SLE patients as compared with HC （P＜0.05）. The number of CD3+T， CD3+CD4+T and CD3+CD4+CXCR5+T were pointless in SLE patients compared with HC （P＞0.05）. Conclusion The aberrations of Tfh cells were observed in patients with SLE. Tfh cells may play a role in the pathogenesisof SLE.

［Key words］Systemic lupus erythematosus， Tfh， Flow cytometry