姜 爽， 李 璐， 王星云， 邱麗敏， 包 楊*（.長春中醫(yī)藥大學，吉林長春307；.吉林省前衛(wèi)醫(yī)院，吉林長春300）

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黃連多糖提取工藝的優(yōu)化及其體外抗氧化作用

姜 爽1， 李 璐1， 王星云1， 邱麗敏2， 包 楊1*
（1.長春中醫(yī)藥大學，吉林長春130117；2.吉林省前衛(wèi)醫(yī)院，吉林長春130021）

目的 探討黃連多糖的最佳提取工藝及其體外抗氧化作用。方法 單因素試驗考察不同提取及樣品處理方法對黃連多糖得率的影響，正交試驗確定最佳提取條件，測定其對超氧陰離子自由基、羥自由基和DPPH自由基的清除作用。結果 最佳提取工藝為粉碎過40目篩，回流提取，料液比、提取溫度、時間及次數(shù)分別為1∶10、100℃、45 min和3次，平均得率為1.52%。同時，黃連多糖對超氧陰離子自由基、羥自由基和DPPH自由基均有一定的清除作用。結論 該方法操作簡便，條件溫和，適合推廣。

黃連多糖；提取工藝；體外抗氧化作用；單因素試驗；正交試驗；超氧陰離子自由基；羥自由基；DPPH自由基

黃連Coptis chinensis應用歷史悠久，為傳統(tǒng)中藥材，藥理作用廣泛，涉及抗癌、抗炎、抗糖尿病等［1-3］，而黃連多糖為其活性成分之一，主要具有抑制內皮細胞增殖、抗菌和抗糖尿病等活性［4-6］。本課題組前期證實，其具有降低糖尿病模型小鼠的血糖水平以及改善血脂代謝紊亂的作用［7］，還發(fā)現(xiàn)其降糖機制與提高模型小鼠抗氧化物酶活性、降低脂質過氧化物含有量等密切相關［8］。為了更好地開發(fā)和利用黃連多糖，本實驗對該成分提取工藝進行優(yōu)化，同時對其體外抗氧化作用也做了進一步探討。

1　材料與方法

1.1實驗材料 黃連藥材購自本地市場，經(jīng)北華大學生藥教研室鑒定為毛茛科植物黃連Coptis chinensis Franch的根莖。D-半乳糖醛酸和D-葡萄糖購自中國食品藥品檢定研究院；DPPH購自美國Sigma公司。所用試劑均為國產(chǎn)分析純。2550紫外-可見分光光度計 （日本島津國際貿易上海有限公司）；藥材粉碎機 （濟南天方機械有限公司）；真空干燥箱 （南京帕源機械設備有限公司）；恒溫水浴箱 （北京醫(yī)用設備廠）。

1.2實驗方法

1.2.1多糖含有量標準曲線 用76%稀硫酸溶解50.00 mg蒽酮，并定容至50mL量瓶中備用。稱取干燥至恒重的葡萄糖25.00 mg，加蒸餾水定容至25 mL，配成1 mg/mL標準溶液備用。精密吸取葡萄糖標準液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，蒸餾水定容至25 mL，分別吸取1 mL，加5mL蒽酮試液，迅速放入冰水浴中搖勻，再置于水浴中煮沸10min，冷卻，于624 nm波長處測定吸光度，蒸餾水作為空白對照。以吸光度為縱坐標 （y）、葡萄糖質量濃度為橫坐標（x）回歸，得回歸方程y=0.004 7x+0.032 5（r=0.999 1），線性范圍20～120μg/mL。

1.2.2多糖得率測定 按照 “1.2.1”項下方法測定吸光度，根據(jù)下述公式計算多糖得率。

1.2.3不同提取方法比較 取黃連藥材5.0 g，置于250 mL圓底燒瓶中，然后加入50 mL蒸餾水，分別采用超聲提取法 （1 h）、回流提取法 （1 h）和冷浸提取法 （室溫下浸泡過夜）提取。將所得濾液轉移至100 mL量瓶中，加水至刻度，測定多糖含有量和得率。

1.2.4不同樣品處理方法比較 采用回流提取法，以蒸餾水為提取溶劑，考察藥材不同粒度 （過100目篩、40目篩和未粉碎）對多糖提取率的影響。稱取樣品各5.0 g，加入50 mL蒸餾水，回流取1 h，濾液轉移至100 mL量瓶中，加水至刻度，測定多糖含有量和得率。

1.2.5正交試驗 取干燥至恒重的黃連藥材適量，粉碎后過40目篩，稱取5.0 g，置于250 mL圓底燒瓶中，加50mL蒸餾水。按照表1條件分別進行提取，濾液轉移至100mL量瓶中，加水至刻度，測定多糖含有量和得率。

表1　因素水平

1.2.6 優(yōu)化工藝的驗證 按正交試驗所得工藝條件提取3次，計算平均得率，考察其可靠性。

1.2.7黃連多糖對超氧陰離子自由基清除作用的測定 吸取不同質量濃度的黃連多糖樣品液1 mL，依次加入四唑氮藍（0.078 mo1/L）和還原型輔酶Ⅰ（0.468 mo1/L）各1 mL，最后加入吩嗪硫酸甲酯（0.06 mo1/L）0.4 mL，反應后室溫下靜置5m in，在560 nm波長處測定吸光度 （A），蒸餾水取代樣品液作為陰性對照，計算清除率，公式為清除率=（1-A樣品/A陰性對照）×100%

1.2.8黃連多糖對羥自由基清除作用的測定 吸取不同質量濃度的黃連多糖樣品液1 mL，依次加入pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液（含0.1 mmo1/L FeC13和0.1 mmo1/L EDTA）1.5 mL和20 mmo1/L H2O20.35 mL，37℃下放置40 min后終止反應，在532 nm波長處測定吸光度，蒸餾水取代樣品液作為陰性對照，計算清除率，公式同“1.2.7”項。

1.2.9黃連多糖對DPPH自由基清除作用的測定 吸取不同質量濃度的黃連多糖樣品液1m L，加入0.004%DPPH甲醇溶液3 mL，反應完全后避光靜置20min，517 nm波長處測定吸光度值 （A），陰性對照用蒸餾水替代樣品溶液，計算清除率，公式同 “1.2.7”項。

2　實驗結果

2.1不同提取及樣品處理方法 （表2） 由表可知，回流提取法的多糖得率高于超聲及冷浸，故本實驗采用回流提取法；粉碎過40目篩后的多糖得率高于粉碎過100目篩和未粉碎，故本實驗選取過40目篩粉碎黃連后再進行提取。

表2　不同提取及樣品處理方法的比較

2.2正交試驗結果 （表3） 由表可知，最佳提取條件為A2B3C2D3，即料液比1∶10，提取溫度100℃，提取時間45min，提取次數(shù)3次。

表3　正交試驗結果

2.3驗證實驗 按最佳提取條件平行驗證3次，測得黃連多糖的平均得率為1.52% （3次得率分別為1.55%、1.50%和1.52%），高于正交試驗各組，表明該工藝重復性較好。

2.4黃連多糖對超氧陰離子自由基清除作用的測定 （圖1） 由圖可知，隨著黃連多糖質量濃度的不斷增加，對超氧陰離子自由基的清除率逐步上升，呈現(xiàn)明顯的劑量依賴關系。

2.5黃連多糖對羥自由基清除作用的測定 （圖2） 由圖可知，黃連多糖對羥自由基的清除效果也具有劑量依賴關系，但弱于相同質量濃度的維生素C。

2.6黃連多糖對DPPH自由基清除作用的測定（圖3）由圖可知，隨著黃連多糖質量濃度的不斷增加，對DPPH自由基的清除率逐步上升，其清除作用接近同質量濃度的維生素E。

圖1　黃連多糖對超氧陰離子自由基的清除作用

圖2　黃連多糖對羥自由基的清除作用

圖3　黃連多糖對DPPH自由基的清除作用

3　討論

多糖為天然大分子物質，是單糖通過糖苷鍵連接而成的聚合物，由于組成多糖的元素主要為碳和氧，所以多糖又稱為 “碳水化合物”，其抗氧化作用被廣泛報道［9-11］。本實驗通過評價黃連多糖對超氧陰離子自由基、羥自由基和DPPH自由基的清除作用，初步探討黃連多糖其體外抗氧化作用。超氧陰離子自由基可以作為多種活性氧的前體，雖然其本身氧化性較弱，但它在一定條件下會分解成氧化性很強的單線態(tài)氧自由基或羥自由基，均能使DNA單股鏈斷裂，最終造成機體的氧化損傷［12-13］。羥自由基作為體內最活躍的活性氧，可引發(fā)多種疾病，故對其的檢測也是體外抗氧化活性的重要指標之一［14］。DPPH自由基在517 nm波長處有強吸收峰，它是以氮原子為中心的較穩(wěn)定的自由基，抗氧化劑可以和其孤對電子配對結合，使其在517 nm波長處的吸收減弱，通過判定其程度的可以評價抗氧化活性［15］。本實驗顯示，黃連多糖對超氧陰離子自由基、羥自由基和DPPH自由基均有一定清除作用，表明該成分具有體外抗氧化作用。

綜上所述，本實驗建立了黃連多糖的最佳提取工藝，同時證實了其具有體外抗氧化作用，可為將來更好開發(fā)和利用該成分奠定相關的工作基礎。

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R284.2

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2015-10-16

吉林省衛(wèi)生廳青年科研課題 （2013Q13）；吉林省中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥科技項目 （2014-ZC14）

姜 爽 （1982—），男，博士，講師，從事天然活性產(chǎn)物提取及抗糖尿病作用研究。Te1：18604498616，E-mai1：jiangshuang _2000@163.com

包 楊，女，碩士，副主治醫(yī)師，從事糖尿病的診斷與治療工作。Te1：13943188320，E-mai1：17800509@qq.com