汪亞勤， 殷嘉珺， 毛玉昌， 胡卓漢，*， 黃建明*（.復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院，上海003；.瑞德肝臟疾病研究 ［上海］有限公司，上海003）

?

［制 劑］

異佛司可林在人肝微粒體與人工胃腸液中的代謝與降解

汪亞勤1， 殷嘉珺1， 毛玉昌2， 胡卓漢1，2*， 黃建明1*
（1.復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院，上海201203；2.瑞德肝臟疾病研究 ［上海］有限公司，上海201203）

目的 研究異佛司可林在人肝微粒體及人工胃腸液中的代謝與降解動(dòng)力學(xué)。方法 將異佛司可林與人肝微粒體、人工胃液、人工腸液進(jìn)行體外共孵育，采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜 （HPLC-MS/MS）法測(cè)定人肝微粒體孵育體系中異佛司可林的剩余濃度，高效液相色譜-紫外檢測(cè) （HPLC-UV）法測(cè)定人工胃液、人工腸液中異佛司可林的剩余濃度。結(jié)果 異佛司可林在人肝微粒體的t1/2為 （34.90±3.42）min，CLint為 （16.71±1.64）mL/（kg·min）；在人工胃液和人工腸液中的t1/2分別為 （46.97±6.46）h和 （91.67±8.26）h。結(jié)論 異佛司可林在人肝微粒體中代謝顯著，在人工胃液和腸液中較穩(wěn)定。

異佛司可林；代謝；降解；人肝微粒體；人工胃液；人工腸液；HPLC-MS/MS；HPLC-UV

唇形科植物毛喉鞘蕊花Coleus forskohlii（wi11d）Briq具有下氣平喘，平肝之功效，可用于治療呼吸紊亂、心臟病、高血壓等疾?。?-4］，國(guó)內(nèi)以其干燥全草為君藥制成的復(fù)方制劑主治咳喘。該植物主產(chǎn)于中國(guó)、印度等地，中印品種的主要有效成分分別為異佛司可林和佛司可林，均為半日花烷型二萜類化合物，具有強(qiáng)大的腺苷酸環(huán)化酶激動(dòng)活性，顯示出平喘解痙、強(qiáng)心、降低眼壓、抗腫瘤、抗HIV活性等作用［2-13］。雖然對(duì)這兩種化合物藥理作用的研究較多，但在代謝方面的報(bào)道很少。張曼等［14］對(duì)佛司可林在肝微粒體中的體外代謝進(jìn)行了研究，但尚未見到關(guān)于異佛司可林的體外代謝報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)建立了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/ MS）法和高效液相色譜-紫外檢測(cè)（HPLC-UV）法分別考察異佛司可林在人肝微粒體中和人工胃腸液中的代謝，并與相同條件下佛司可林的代謝結(jié)果作比較，為藥物代謝性相互作用的研究以及國(guó)產(chǎn)毛喉鞘蕊花藥材的進(jìn)一步開發(fā)提供有價(jià)值的信息。

1　儀器與試劑

1.1儀器 Agi1ent 1200系列液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；AB SCIEX API 4000質(zhì)譜儀（美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)有限公司）；GHP-9050隔水式恒溫培養(yǎng)箱 （上海一恒科技有限公司）；XW-80A渦旋混合器 （海門市麒麟醫(yī)用儀器廠）；TGL-16B臺(tái)式離心機(jī) （上海安亭科學(xué)儀器廠）；FE20實(shí)驗(yàn)室PH計(jì) （梅特勒-托利多儀器上海有限公司）。

1.2藥品與試劑 異佛司可林 （自制，純度大于98%）；人肝微粒體 （上海瑞德肝臟疾病研究所）；睪酮 （上海淞虹化學(xué)試劑有限公司）；還原型輔酶Ⅱ（β-NADPH，美國(guó)Sigma公司）；Tris緩沖液（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；胃蛋白酶 （豬源，1∶3 000）、胰酶 （USP級(jí)）（阿拉丁試劑有限公司）。乙腈、甲醇為色譜純 （江蘇漢邦科技有限公司）；其他試劑均為分析純；超純水（Mi11i-Q超純水系統(tǒng)制得）。

2　方法與結(jié)果

2.1體外代謝體系和處理方法

2.1.1肝微粒體中的實(shí)驗(yàn)方法 溫孵體系總體積為0.2 m L/份，含人肝微粒體 （蛋白質(zhì)量濃度6 mg/mL）50μL、4μmo1/L異佛司可林50μL、2 mmo1/Lβ-NADPH 100μL，溶劑均為0.1 mo1/L Tris緩沖液，各溶液均在37℃預(yù)孵育5 min后混勻。以不含β-NADPH的樣品為陰性對(duì)照，以睪酮為陽(yáng)性對(duì)照，將配制好的溫孵液置于37℃下，于0、0.25、0.5、1、2 h取出，立即加入0.8 mL甲醇（4℃）終止反應(yīng)，渦旋混勻，離心 （4℃，10 000 r/min）5 min，取上清液進(jìn)行LC-MS/MS分析。

2.1.2人工胃液、腸液中的實(shí)驗(yàn)方法 取5.6 mmo1/L異佛司可林溶液50μL與人工胃腸液（依據(jù) 《中國(guó)藥典》2010版一部附錄 XA配制）950μL，在37℃預(yù)孵育5 min后混勻，于0、 0.25、0.5、1、2、4、6 h取出0.1 mL，立即加入0.3 m L冰乙腈 （-20℃）終止反應(yīng)，離心（4℃，12 000 r/min）5 min，取上清液進(jìn)行HPLC-UV分析。

2.2HPLC-MS/MS法測(cè)定肝微粒體孵育體系中異佛司可林的濃度

2.2.1色譜與質(zhì)譜條件 色譜分析采用Diamonsi1 C18色譜柱 （2.1 mm×50 mm，5μm）；流動(dòng)相為甲醇（A）-10 mmo1/L乙酸銨（B），梯度洗脫（0～2 min，40%～98%A；2～4 min，98%A）；柱溫35℃；體積流量0.45 mL/min；進(jìn)樣量5μL。

質(zhì)譜檢測(cè)采用電噴霧離子源 （ESI），正離子掃描；定量分析采用多反應(yīng)離子 （MRM）模式，m/z428.4→375.3；碰撞能量 （CE）18 V；氣簾氣206.85 kPa；電壓4 000 V；溫度300℃。

2.2.2方法學(xué)考察 在選定的檢測(cè)條件下，異佛司可林的保留時(shí)間為3.4 min（圖1），孵育液中的雜質(zhì)不干擾測(cè)定，方法專屬性良好。

圖1　LC-MS/MS色譜圖（人肝微粒體）Fig.1 LC-MS/M S chrom atogram s（human liver m icrosomes）

取不同濃度的異佛司可林溶液，加到失活的肝微粒體溶液中，按 “2.1.1”項(xiàng)下方法配制含10、20、40、100、200、400、1 000、2 000 nmo1/L該成分的標(biāo)準(zhǔn)樣品，加入甲醇0.8 mL，渦旋混勻，離心，取上清液進(jìn)行LC-MS/MS分析。以峰面積（A）對(duì)濃度（C，nmo1/L）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程A=513.56C-3 086.74，r=0.999 9，表明異佛司可林在10～2 000 nmo1/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，方法定量限為10 nmo1/L（S/N≥10）。

配制含10、25、200、1 600 nmo1/L該成分的標(biāo)準(zhǔn)樣品用于精密度、準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性的考察。每個(gè)濃度日內(nèi)測(cè)3次，連續(xù)測(cè)3 d，日內(nèi)測(cè)定各濃度的RSD分別為2.7%、2.6%、2.3%、2.7%，日間分別為4.6%、1.1%、4.2%、2.3%，方法回收率在94.3%～109.8%之間。4℃貯存條件下，各濃度在0、8、16 h測(cè)定的RSD值均小于8.9%（n=3），表明異佛司可林在16 h內(nèi)穩(wěn)定。

按以下方法制備組1～組3樣品，并分別計(jì)算提取回收率與基質(zhì)效應(yīng)。組1：異佛司可林對(duì)照品溶液；組2：取失活肝微粒體甲醇沉淀后的上清液，加入異佛司可林對(duì)照品溶液；組3：失活肝微粒體甲醇沉淀前加異佛司可林對(duì)照品溶液?；|(zhì)效應(yīng)=（組2/組1）×100%，提取回收率=（組3/組2）×100%。結(jié)果，25、200、1 600 nmo1/L異佛司可林的提取回收率分別為91.8%、101.1%、92.3%，基質(zhì)效應(yīng)分別為 94.1%、93.8%、103.0%（n=5），RSD在0.9%～8.4%之間，表明該方法的提取回收率符合要求，而且無(wú)基質(zhì)效應(yīng)。

2.3HPLC-UV法測(cè)定人工胃液、腸液中異佛司可林的濃度

2.3.1色譜條件 Phenomenex Luna C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm），保護(hù)柱Phenomenex C18色譜柱（4.0 mm×3.0 mm，5μm）；流動(dòng)相乙腈-水 （65∶35）；柱溫40℃；進(jìn)樣量20μL；體積流量1 m L/min；檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm。

2.3.2方法學(xué)考察 在選定的檢測(cè)條件下，異佛司可林的保留時(shí)間為4.9 min（見圖2和圖3），人工胃腸液對(duì)測(cè)定均無(wú)干擾，方法的專屬性符合要求。

將含2.4、4.9、12.2、24.4、60.9、121.8μmo1/L異佛司可林的對(duì)照品溶液按 “2.3.1”項(xiàng)下方法測(cè)定，以峰面積（A）對(duì)濃度（C，μmo1/L）作線性回歸，得回歸方程A=0.857 3C+0.531 8，r= 0.999 8，表明異佛司可林在2.4～121.8 mmo1/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，方法定量限為2.4μmo1/L（S/N≥10）。

圖2　HPLC-UV色譜圖（人工胃液）Fig.2 HPLC-UV chromatograms（simulated gastric fluid）

圖3　HPLC-UV色譜圖（人工腸液）Fig.3 HPLC-UV chromatograms（simulated intestinal fluid）

取含4.9、24.4、121.8μmo1/L異佛司可林的對(duì)照品溶液考察精密度、準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性，每個(gè)濃度日內(nèi)測(cè)3次，連續(xù)測(cè)3 d，日內(nèi)測(cè)定各濃度的RSD分別為2.39%、0.88%、0.62%，日間分別為2.22%、1.27%、1.17%，日間和日內(nèi)的方法回收率在97.6%～102.4%之間。室溫 （25℃）條件下，各濃度在0、1、2 h測(cè)定的RSD值均小于2.44%；4℃貯存條件下，在0、24、48 h測(cè)定的RSD值均小于2.90% （n=3）。

2.4異佛司可林在人肝微粒體、人工胃腸液中的代謝與降解 按 “2.1”項(xiàng)下方法，將異佛司可林與人肝微粒體或人工胃腸液共孵育，以各時(shí)間點(diǎn)母體剩余濃度相對(duì)于初始濃度的百分比對(duì)時(shí)間作圖，結(jié)果見圖4。

圖4　濃度-時(shí)間曲線（±s，n=3）Fig.4 Concentration-time curves（±s，n=3）

以濃度的自然對(duì)數(shù) （1n C）對(duì)反應(yīng)時(shí)間 （t）進(jìn)行線性回歸，如果線性關(guān)系良好則符合表觀一級(jí)動(dòng)力學(xué)過(guò)程，直線斜率的絕對(duì)值為一級(jí)降解速率常數(shù)（k），由公式t1/2=0.693/k可得代謝半衰期t1/2。在肝微粒體孵育體系中，異佛司可林0～1 h的1n C-t線性關(guān)系良好，符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)；1 h后，肝微粒體酶因消耗而減少，活性也降低，從而使代謝速率逐漸減小，因此采用1 h內(nèi)的數(shù)據(jù)計(jì)算k與t1/2。固有清除率CLint和肝清除率CLh按式 （1）和

（2）計(jì)算。

其中，相關(guān)的理化參數(shù)為肝微粒體蛋白質(zhì)量（mg）/肝質(zhì)量 （g）25.7，肝質(zhì)量 （g）/體質(zhì)量（kg）48.8，肝血流（Qh）20.7 mL/（kg·min）［15］。

結(jié)果，異佛司可林在人肝微粒體中的 k為（0.020±0.002）/min，t1/2為 （34.90±3.42）min，孵育2 h的母體剩余量為 （18.80±0.79）% （陽(yáng)性對(duì)照睪酮孵育2 h的剩余量為9.2%），CLint為（16.71±1.64）mL/（kg·min），CLh為（9.23± 0.50）mL/（kg·min），提示異佛司可林在肝臟的首過(guò)代謝顯著。

異佛司可林在人工胃液和腸液中的k分別為（0.014 9±0.001 9）/h和 （0.007 6±0.000 7）/h，t1/2分別為 （46.97±6.46）h和 （91.67±8.26）h，孵育2 h的母體剩余量分別為 （97.01± 1.26）%和 （98.83±0.75）% （n=3），提示異佛司可林在人工胃腸液中穩(wěn)定。

3　討論

3.1分析方法的選擇 本實(shí)驗(yàn)采用HPLC-UV法測(cè)定人工胃腸液中的降解樣品，因?yàn)楫惙鹚究闪值臐舛容^高，人工胃腸液對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。但是，對(duì)于肝微粒體的降解樣品，異佛司可林的濃度較低，本底噪音較大，難以用HPLC-UV法準(zhǔn)確測(cè)定，故建立了更專屬、靈敏的HPLC-MS/MS法進(jìn)行測(cè)定。

在HPLC-MS/MS的方法學(xué)考察中，比較了內(nèi)標(biāo)法 （內(nèi)標(biāo)為柳胺酚）和外標(biāo)法，發(fā)現(xiàn)兩種計(jì)算方法的各項(xiàng)分析效能指標(biāo)均符合分析要求，但外標(biāo)法更簡(jiǎn)便，而且精密度略優(yōu)于內(nèi)標(biāo)法，故選擇外標(biāo)法。另外，還比較了電噴霧離子源的正離子和負(fù)離子檢測(cè)方式，發(fā)現(xiàn)異佛司可林在正離子模式下的響應(yīng)顯著高于負(fù)離子，因此選取正離子進(jìn)行測(cè)定。

3.2與佛司可林代謝動(dòng)力學(xué)的比較 本實(shí)驗(yàn)同時(shí)考察了國(guó)外品種主要成分佛司可林的代謝穩(wěn)定性，測(cè)得其t1/2為 （18.37±1.16）min（文獻(xiàn) ［14］報(bào)道為 ［11.9±1.8］min），孵育2 h僅剩余 （4.86± 0.35）%，CLint為（31.63±2.01）mL/（kg·min），CLh為（12.50±0.31）mL/（kg·min），提示佛司可林在肝臟的首過(guò)代謝顯著。在人工胃液和腸液中，佛司可林的t1/2分別為（9.68±0.73）h和（53.37±7.08）h，孵育2 h的母體剩余量分別為（89.52±1.73）%和 （96.60±0.80）%，表明佛司可林在人工胃液、腸液中較穩(wěn)定。

由此可知，兩者均可被肝微粒體藥物代謝酶顯著代謝，速度快，而在人工胃腸液中較穩(wěn)定。并且在三種介質(zhì)中，異佛司可林均比佛司可林穩(wěn)定。

3.3異佛司可林的代謝及其潛在的藥物相互作用

異佛司可林可被人肝微粒體顯著代謝，在2 h的孵育后，母體僅剩余18.80%，提示80%以上母體被代謝，其CLint為16.71 mL/（kg·min），即為快代謝化合物。異佛司可林的代謝不穩(wěn)定性對(duì)生物利用度及血漿濃度有潛在影響，一旦與其代謝途徑的抑制劑同時(shí)服用，其血漿濃度及相應(yīng)的藥效可能會(huì)受到顯著影響。因此，后續(xù)將進(jìn)一步分析異佛司可林的代謝途徑，為正確評(píng)估臨床藥物代謝性的相互作用提供數(shù)據(jù)。

異佛司可林在人工胃液和人工腸液中孵育2 h，其母體剩余量分別為97.01%和98.83%，即較為穩(wěn)定，對(duì)潛在的臨床藥物相互作用影響不大。

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M etabolism and degradation of isoforskolin in human liver m icrosomes and simulated gastrointestinal fluids

WANG Ya-qin1， YIN Jia-jun1， MAO Yu-chang2， HU Zhuo-han1，2*， HUANG Jian-ming1*

（1.Schoolof Pharmacy，F(xiàn)udan University，Shanghai201203，China；2.Ruide Research Institute for Liver Diseases［Shanghai］Co.，Ltd.，Shanghai 201203，China）

AIM To investigate the in vitro metabo1ism and degradation of isoforsko1in in human 1ivermicrosomes and simu1ated gastrointestina1 f1uids.METHODS Isoforsko1in was incubated with human 1iver microsomes，simu1ated gastric f1uid（SGF）and simu1ated intestina1 f1uid（SIF），respective1y.The residua1 concentrations of isoforsko1in in microsoma1incubateswere determined by HPLC-MS/MS，and the concentrations in SGF and SIF were detected by HPLC-UV.RESULTS In human 1iver microsomes，the t1/2and CLintof isoforsko1in were（34.90±3.42）min and（16.71±1.64）mL/（kg·min），respective1y.The t1/2va1ues of isoforsko1in in SGF and SIF were（46.97±6.46）h and（91.67±8.26）h，respective1y.CONCLUSION Isoforsko1in can bemetabo1ized significant1y in human 1ivermicrosomes，whi1e it remains stab1e in SGF and SIF.

isoforsko1in；metabo1ism；degradation；human 1ivermicrosomes；simu1ated gastric f1uid；simu1ated intestina1 f1uid；HPLC-MS/MS；HPLC-UV

R969.1

A

1001-1528（2016）06-1244-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2016.06.009

2015-08-17

上海市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)科技支撐項(xiàng)目 （13401900502）

汪亞勤 （1983—），女，實(shí)驗(yàn)師，從事中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)與活性成分研究。Te1：13585543024，E-mai1：wangyq1219@126.com

胡卓漢 （1953—），男，教授，博士生導(dǎo)師，從事中藥代謝性/轉(zhuǎn)運(yùn)性相互作用的研究。Te1：（021）50800743，E-mai1：huzh@ri1d-biotech.com

黃建明 （1971—），女，副教授，碩士生導(dǎo)師，從事中藥有效成分及其體內(nèi)外分析的研究。Te1：（021）51980132，E-mai1：jmhuang@shmu.edu.cn