林龍云, 于曙光, 柯蘭蘭, 潘大仁

(1.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)與藥學(xué)院，山東 青島 266109)

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甾類化合物降解菌D61的分離鑒定及其降解特性

林龍云1, 于曙光2, 柯蘭蘭1, 潘大仁1

(1.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)與藥學(xué)院，山東 青島 266109)

從雜草土壤中分離得到利用甾類化合物作為唯一碳源的菌株D61.經(jīng)16S rDNA多態(tài)性分析鑒定菌株D61為腸桿菌科哈夫尼菌屬，在20～37 ℃、pH 2.0～9.0的環(huán)境中生長較好，無卡那霉素抗性.降解試驗和熒光定量PCR試驗結(jié)果表明，菌株D61可通過paaC基因的環(huán)氧化作用途徑對甾類化合物進(jìn)行降解轉(zhuǎn)化，其對睪丸酮的降解能力與陽性對照菌睪丸酮叢毛單胞菌相似，對雌酮的降解能力明顯優(yōu)于睪丸酮叢毛單胞菌.

甾類化合物; 降解; 菌株D61

隨著社會的不斷發(fā)展，特別是現(xiàn)代醫(yī)藥及化學(xué)工業(yè)的發(fā)展，包括睪丸酮、雌二醇和雌酮在內(nèi)的大量甾類化合物不斷地通過生產(chǎn)或生活等釋放并污染土壤和水，給地球上的生物包括人類的生長、發(fā)育和繁殖都構(gòu)成潛在的威脅和風(fēng)險[1].甾類化合物污染的研究始于上世紀(jì)90年代.我國2000年開始對環(huán)境甾類化合物污染、毒理學(xué)等方面進(jìn)行大量研究，發(fā)現(xiàn)我國重要河流、淡水湖泊，以及近海海域和污水灌溉土壤中，均存在不同程度的類固醇污染[2-4].因此，國內(nèi)外學(xué)者積極地從環(huán)境中篩選分離甾類化合物降解菌[5-9].陶玉貴等[10]從農(nóng)藥廠排污溝污泥中分離得到1株哈夫尼菌屬菌株，能以毒死蜱為唯一碳源降解毒死蜱.除此之外，鮮有以哈夫尼菌作為降解菌的研究報道，更無哈夫尼菌降解甾類化合物的相關(guān)研究報道.戴藝民、陳建秋等[11-12]對降解甾類化合物細(xì)菌——睪丸酮叢毛單胞菌進(jìn)行研究.本研究嘗試從周邊環(huán)境分離新甾類化合物降解菌，并對其降解特性進(jìn)行研究，為進(jìn)一步利用新分離菌株進(jìn)行環(huán)境修復(fù)及降解機(jī)理的研究提供依據(jù).

1　材料與方法

1.1材料和儀器

1.1.1材料以福建農(nóng)林大學(xué)生物樓前雜草土壤作為分離甾類化合物降解菌的材料.以本實驗室保存的睪丸酮叢毛單胞菌(ComamonastestosteroniATCC11996, Ampr)作為陽性對照菌株.無機(jī)鹽培養(yǎng)基(SIN)：1.0 g·L-1(NH4)H2PO4+1.0 g·L-1(NH4)2HPO4+2.0 g·L-1KH2PO4+0.2 g·L-1MgSO4·7H2O ，pH 7.0.LB培養(yǎng)基：10 g·L-1蛋白胨+5 g·L-1酵母膏+10 g·L-1NaCl，pH 7.0.固體培養(yǎng)基添加14 g·L-1瓊脂，相關(guān)培養(yǎng)基經(jīng)120 ℃高壓蒸汽滅菌25 min，備用.睪丸酮、雌二醇和雌酮由大連美侖生物公司提供.

1.1.2主要儀器設(shè)備96孔PCR儀(型號AG22331)，為德國艾本德股份公司產(chǎn)品；高效液相色譜儀(型號1260)，為安捷倫科技有限公司產(chǎn)品；冷凍離心機(jī)(型號5810R)，為德國艾本德股份公司產(chǎn)品；PikoReal熒光定量PCR儀(型號5100)，為賽默飛世爾科技(芬蘭)有限公司產(chǎn)品.

1.2方法

1.2.1甾類化合物降解菌株的分離稱取5 g土壤加到含有0.2 mmol·L-1睪丸酮的SIN液體培養(yǎng)基中，在37 ℃、180 r·min-1搖床中培養(yǎng).每3 d按1%的接種量,取前一次培養(yǎng)的菌液依次在含有0.4、0.6和1.0 mmol·L-1睪丸酮的SIN液體培養(yǎng)基中富集培養(yǎng).參考Sang et al[6]和于源華等[7]從海水中分離降解甾類化合物細(xì)菌的方法，將富集培養(yǎng)的菌液用無睪丸酮的SIN液體培養(yǎng)基按1∶106稀釋，取200 μL分別均勻涂于5個含有1.0 mmol·L-1睪丸酮的SIN固體培養(yǎng)基上，37 ℃過夜培養(yǎng).從每個過夜培養(yǎng)的培養(yǎng)皿中挑取10個以上的單菌落(依次編號)，用30 μL無睪丸酮的SIN液體培養(yǎng)基稀釋后，取5 μL分別置于無睪丸酮的1/10 SIN固體培養(yǎng)基A和含1.0 mmol·L-1睪丸酮的1/10 SIN固體培養(yǎng)基B中，挑選可有效利用睪丸酮作為碳源的菌株進(jìn)行純化及進(jìn)一步研究.

1.2.2新分離菌株的DNA提取及16S rDNA鑒定采用上海生工的細(xì)菌基因組DNA快速提取試劑盒進(jìn)行DNA提取.采用細(xì)菌16S rDNA PCR擴(kuò)增通用引物[13](溶解濃度均為10 μmol·L-1)對新分離菌株進(jìn)行種屬鑒定.上游引物27F：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3.下游引物1492R：5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3.PCR反體系為5 μL Buffer+1 μL dNTP+0.5 μL rTag+2 μL 27F引物+2 μL 1492R引物+38.5 μL dH2O，總體積為50 μL.PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min，94 ℃ 1 min，61 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min,30個循環(huán)，72 ℃延伸10 min.擴(kuò)增產(chǎn)物送至鉑尚生物公司進(jìn)行測序.將測序結(jié)果交至NCBI在線比對后，選擇相似度較高和具有代表性的相似菌種16S rDNA序列，用MEGA(版本號為6.06)進(jìn)行多序列比對及系統(tǒng)進(jìn)化樹繪制.

1.2.3新分離菌株的生長條件及抗性研究新分離菌株在LB培養(yǎng)基中經(jīng)37 ℃、180 r·min-1過夜培養(yǎng)后，用LB培養(yǎng)基將菌液調(diào)至D595 nm=1.0.取250 μL菌液加入5 mL LB培養(yǎng)基，在180 r·min-1搖床中分別按相應(yīng)條件進(jìn)行過夜培養(yǎng).溫度分別為15、20、27和37 ℃.pH值分別為2.0、5.0、7.0、9.0和11.0.抗生素條件分別為100 μg·mL-1氨芐青霉素(Amp)、30 μg·mL-1卡那霉素(Kan)、50 μg·mL-1鏈霉素(St)、50 μg·mL-1利福平(Rif)和300 μg·mL-1羧芐青霉素(Carb).

1.2.4新分離菌株對不同甾類化合物的降解新分離菌株在37 ℃、180 r·min-1搖床中過夜培養(yǎng)后，以LB培養(yǎng)基稀釋至D595 nm=1.0.取250 μL菌液加入分別含有0.2 mmol·L-1睪丸酮、0.02 mmol·L-1雌二醇、0.02 mmol·L-1雌酮的5 mL SIN和LB液體培養(yǎng)基中，各種處理均為3次重復(fù)，在37 ℃、180 r·min-1搖床中培養(yǎng)19 h后，通過高效液相進(jìn)行各處理中甾類化合物的降解剩余量的檢測.菌株睪丸酮叢毛單胞菌(C. T.)按重復(fù)數(shù)和條件進(jìn)行處理，作為降解試驗的陽性對照.

1.2.5高效液相檢測培養(yǎng)液中甾類化合物含量的測定將經(jīng)降解處理的培養(yǎng)液置于85 ℃烘箱，烘干水分后，加入1 mL色譜甲醇充分溶解，經(jīng)尼龍濾膜(0.45 μm)過濾后，高效液相檢測甾類化合物含量.高效液相色譜條件為：流動相甲醇∶水=80∶20；流速為0.8 mL·min-1；上樣量為50 μL；柱溫為30 ℃.檢測睪丸酮波長為254 nm，出峰時間為6 min.檢測雌二醇和雌酮的波長均為205 nm，分別在5.2和5.5 min出峰.

1.2.6苯乙酸降解蛋白目的基因(paaC)的克隆及其降解甾類化合物的差異表達(dá)分析根據(jù)UniProtKB中報道的A0A038CSW7的苯乙酸降解蛋白，經(jīng)NCBI/BLAST/tblaxtn檢索，獲得相應(yīng)基因paaC序列后，使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計上下游引物.以D61菌株的DNA為模板，上游引物paaC XH F：5′-TGCTCTAGATTACCACTGCTGACCGGGATA-3′.下游引物paaC XH R：5′-CCCAAGCTTATGAACAACC TGAATCCCGT-3′.獲得paaC基因片段，將該片段與載體pMD 18-T連接并轉(zhuǎn)化到Trans5αChemically Competent Cell中，送至鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司進(jìn)行測序.根據(jù)測序結(jié)果輸入NCBI進(jìn)行對比，并使用Primer Premier 5.0軟件進(jìn)行熒光定量PCR引物設(shè)計.以D61菌株的16S rDNA基因作為熒光定量PCR內(nèi)參基因，內(nèi)參基因上游引物QD6 16s-F：5′-GGAGCAAACAGGATTAGATACCC-3′.內(nèi)參基因下游引物QD6 16s-R：5′-CGGAAGCCACGCCTCAA-3′.

新分離菌株以LB培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，對照添加甲醇進(jìn)行培養(yǎng).過夜培養(yǎng)后，分離菌體以全式金TransZolTM Up提取RNA，TaKaRa Prime ScriptTM 1ST Strand cDNA Synthesis Kit進(jìn)行cDNA第1鏈的合成后，以Perfect Real time染料法實時熒光定量試劑盒在PikoReal熒光定量PCR儀上對試驗樣品進(jìn)行熒光定量PCR分析.分析結(jié)果經(jīng)PikoRealTM Software 2.1軟件分析，獲得在閾值600條件下的PCR反應(yīng)循環(huán)數(shù)：Ct(處理目的基因)、Ct(處理內(nèi)參基因)、Ct(對照目的基因)和Ct(對照內(nèi)參基因).應(yīng)用相對定量方法計算特征基因表達(dá)的差異量2-△△Ct，其中：△△Ct=△Ct(處理)-△Ct(對照)；△Ct(處理)=Ct(處理目的基因)-Ct(處理內(nèi)參基因)；△Ct(對照)=Ct(對照目的基因)-Ct(對照內(nèi)參基因).

2　結(jié)果與分析

2.1甾類化合物降解菌的分離和純化

富集培養(yǎng)后，經(jīng)涂板挑菌分離篩選的63株細(xì)菌，在無睪丸酮的1/10 SIN固體培養(yǎng)基A上無法生長或生長明顯緩慢，而有6個菌株在含1.0 mmol·L-1睪丸酮的1/10 SIN固體培養(yǎng)基B中能夠以睪丸酮為唯一碳源，較好地生長(圖1).本試驗對上述6個菌株進(jìn)行初步甾類化合物降解對比試驗，選取編號61的菌株(圖1箭頭所指示)，將其命名為D61，并進(jìn)行劃線純化和進(jìn)一步的生長條件研究和降解能力鑒定.

2.2新分離菌株D61的16S rDNA鑒定

D61經(jīng)16S rDNA PCR擴(kuò)增和測序，獲得的序列長度為1 391 bp，在GenBank中比對后，選擇相似度較高的菌種及C. T.等有代表性的菌種16S rDNA序列，經(jīng)MEGA(版本號為6.06)進(jìn)行多序列比對，并繪得系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖2).從圖2可知，其與數(shù)據(jù)庫中的腸桿菌科哈夫尼菌屬的大多數(shù)菌種的16S rDNA序列的相似度達(dá)到了98%以上，鑒定菌株D61屬于腸桿菌科哈夫尼菌屬.

2.3菌株D61的生長條件及抗性

通過測定15～37 ℃菌株D61的生長量可知：菌株D61在15 ℃下，生長量明顯減少，而在20～37 ℃，可以正常生長，生長量接近15 ℃時的3倍(圖3).通過不同pH值條件試驗可知，D61在pH值2.0～9.0范圍內(nèi)均能較好生長，但在pH達(dá)到11時，其無法生長(圖4).D61在添加一定量的氨芐青霉素、鏈霉素、利福平和羧芐青霉素的LB培養(yǎng)基內(nèi)均能較好地生長，而在添加卡那霉素的LB培養(yǎng)基中幾乎無法生長(圖5).由此可確定菌株D61后續(xù)試驗的培養(yǎng)條件為：pH值7.0，氨芐青霉素100 μg·m L-1，溫度37 ℃.

2.4菌株D61對不同甾類化合物的降解效果

菌株D61和C. T.在pH值7.0、100 μg·mL-1氨芐青霉素、培養(yǎng)溫度37 ℃條件下培養(yǎng)19 h后，通過高效液相測定培養(yǎng)基內(nèi)剩余甾類化合物的含量，進(jìn)而計算獲得相應(yīng)菌株甾類化合物的降解率(圖6).在營養(yǎng)物質(zhì)匱乏的SIN液體培養(yǎng)基中，菌株D61和C. T.對睪丸酮的降解率分別為30.9%和30.5%，對雌二醇降解率分別為15.2%和16.4%，對雌酮降解率分別為60.6%和37.2%.在富營養(yǎng)的LB液體培養(yǎng)基中，菌株D61和C. T.對睪丸酮的降解率分別為70.5%和70.3%，對雌二醇降解率分別為21.1%和32.7%，對雌酮降解率分別為44.0%和35.1%.

2.5paaC基因克隆及熒光定量PCR驗證

D61菌株與C. T.菌株同樣具有降解甾類化合物的能力，但PCR和ELISA試驗結(jié)果表明，D61菌株中不含有3α-HSD基因.而以paaC基因特異引物對D61菌株的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得756 bp的特征片段，經(jīng)測序比對分析，結(jié)果表明其與paaC基因的同源性達(dá)到99%(圖7).根據(jù)測序結(jié)果，設(shè)計熒光定量PCR引物.paaC QF：5′-CTGTTCCACCAGCAGGAGATTG-3′.下游引物paaC QR：5′-CTGAGTTGGCGGGGAGCGGCGA-3′.熒光定量PCR結(jié)果顯示，在含有睪丸酮、雌二醇和雌酮的LB培養(yǎng)基中，paaC基因的表達(dá)量分別提高1.9、1.3和3.0倍，證明D61在降解以上3個甾類化合物時paaC基因具有一定活性.

3　討論

本研究成功篩選分離出能夠利用睪丸酮作為碳源快速生長的菌株D61.通過16S rDNA序列的測定分析，初步鑒定菌株D61為腸桿菌科哈夫尼菌屬.

本研究分離的哈夫尼菌屬D61菌株，在富營養(yǎng)的LB培養(yǎng)基和營養(yǎng)物質(zhì)匱乏的SIN培養(yǎng)基中，對睪丸酮、雌二醇和雌酮均有一定的降解能力；且在相同試驗條件下，降解雌酮的效率明顯大于C. T.菌株，降解睪丸酮的效率基本與C. T.菌株相同.Teufel et al[14]研究指出，paaC等基因的環(huán)氧化作用使芳香族化合物的芳香族環(huán)上1個雙鍵兩端碳原子被加上一原子氧形成三元環(huán)，破壞芳香族環(huán)的穩(wěn)定性；并在其他酶作用下芳香族環(huán)開環(huán)，最終被逐步降解.對D61菌株的paaC基因克隆及熒光定量PCR驗證結(jié)果表明，加入睪丸酮和雌酮后paaC基因表達(dá)量顯著增加.因此，環(huán)氧化反應(yīng)的代謝途徑可能是D61菌株降解甾類化合物的重要途徑.通過對D61菌株的生長溫度、pH值和抗性等特點的研究，結(jié)果表明D61菌株可以應(yīng)用于20～37 ℃、pH值酸性或弱堿性的環(huán)境中進(jìn)行環(huán)境甾類化合物污染修復(fù).同時，因D61菌株不適于在強(qiáng)堿性條件下生長和不抗卡那霉素的特點，故在環(huán)境修復(fù)后期，可以通過pH值調(diào)節(jié)或加入一定量的卡那霉素抑制該菌株生長，以免對環(huán)境造成二次污染.因此，可以利用菌株D61進(jìn)行后續(xù)環(huán)境甾類化合物污染的修復(fù).

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(責(zé)任編輯:葉濟(jì)蓉)

Isolation and degradation characteristics of steroid-degrading bacterial strain D61

LIN Longyun1, YU Shuguang2, KE Lanlan1, PAN Daren1

(1.College of Life Sciences, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China; 2.College of Chemistry and Medicine, Qingdao Agricultural University, Qingdao, Shandong 266109, China)

Bacteria that effectively degrades anthropogenic steriod merges to be an environmental friendly tool in pollution abatement. In this study, bacterial strain D61 was isolated from weed soil and fed on 0.2 mmol·L-1exogenous steroid as the only carbon source, and followed by 16S rDNA polymorphism analysis to identify its species. The optimum growing condition was detected by growing the strain in ambient temperature between 15 ℃ and 37 ℃ under pH from 2 to 11. Futhermore, resistance of strain D61 to antibiotics and its degradation efficacy on steriod, inclduing testosterone, estradiol and oestrone, were evaluated. Results showed that strain D61 belonged to genusHafniaof familyEnterobacteriaceae. Strain D61 favored growing condition of 20-37 ℃ and pH 2.0-9.0. Strain D61 showed no resistance to Kanamycin. Degradation experiment and quantitative PCR analysis showed that strain D61 degraded steroids via epoxidation ofpaaCgene. Degradation rate on testosterone was similar to that of strainComamonastestosteronewhich was used as positive control, but was significantly higher than that of estrone.

steroid; degradation; strain D61

2016-01-10

2016-02-20

國家自然科學(xué)基金資助項目(31270676).

林龍云(1981-)，男，講師.研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué).Email:9884318@qq.com.通訊作者潘大仁(1949-)，男，教授，博士生導(dǎo)師.研究方向：生物技術(shù).Email:pdr8598@163.com.

Q89

A Q89

1671-5470(2016)03-0320-05

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2016.03.014