趙哲珊 黃華 邱榮敏 韋克珍 李麗媚

廣西醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院兒童牙病科，南寧 530021

聚乳酸可吸收根管樁膜生物相容性實(shí)驗(yàn)

趙哲珊 黃華 邱榮敏 韋克珍 李麗媚

廣西醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院兒童牙病科，南寧 530021

目的 檢測(cè)通過溶劑揮發(fā)成膜法制備的聚乳酸可吸收根管樁膜的生物相容性。方法 采用溶劑揮發(fā)成膜法制備聚乳酸根管樁膜，進(jìn)而制備聚乳酸樁膜浸提液，檢測(cè)聚乳酸樁膜的生物相容性。體外培養(yǎng)人牙齦成纖維細(xì)胞（HGF），用聚乳酸樁膜浸提液培養(yǎng)HGF，采用形態(tài)學(xué)觀察法、四甲基偶氮唑鹽（MTT）法、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HGF的形態(tài)學(xué)變化、細(xì)胞毒性反應(yīng)及活細(xì)胞率。將HGF接種于聚乳酸樁膜上，通過4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色觀察HGF在聚乳酸樁膜上的生長情況。將聚乳酸樁膜植入到SD大鼠皮下，于第1、4、8、12周從動(dòng)物背部取出植入材料及周圍皮下組織，觀察切口大體表現(xiàn)，并對(duì)組織行蘇木精-伊紅染色，通過觀測(cè)炎癥細(xì)胞浸潤程度檢驗(yàn)材料對(duì)局部組織炎癥和異物反應(yīng)的情況。結(jié)果 聚乳酸樁膜浸提液對(duì)HGF的增殖無明顯影響，無明顯細(xì)胞毒性；HGF可在聚乳酸樁膜上黏附和生長。皮下植入實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)組標(biāo)本的大體觀察和蘇木精-伊紅染色觀察結(jié)果均與對(duì)照組相似，符合生物安全性要求。結(jié)論 通過溶劑揮發(fā)成膜法制備的聚乳酸可吸收根管樁膜具有良好的生物相容性，可用于進(jìn)一步臨床研究。

溶劑揮發(fā)法； 聚乳酸； 根管樁； 乳牙； 生物相容性

隨著生物可吸收材料的發(fā)展，聚乳酸（polylacticacid，PLA）類材料已廣泛應(yīng)用于臨床，最常見的是用于骨科內(nèi)固定[1-2]。基于乳恒牙替換的生理現(xiàn)象，乳牙殘根殘冠的治療也逐漸向可吸收根管樁修復(fù)方向發(fā)展，并取得了良好的效果[3]。目前的主要問題在于沒有相應(yīng)的可吸收黏結(jié)劑，多使用玻璃離子黏結(jié)劑粘接修復(fù)乳牙殘根殘冠，但玻璃離子黏結(jié)劑是不可吸收性材料，對(duì)乳恒牙替換存在隱患。采用溶劑揮發(fā)成膜法制備成與PLA螺紋樁材質(zhì)相同的PLA樁膜，可作為PLA可吸收螺紋樁的輔助固位與封閉材料。由于在樁膜制備過程中使用了有機(jī)溶劑氯仿，因此本研究的目的在于觀察PLA根管樁膜的生物相容性，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

DMEM培養(yǎng)基（Hyclone公司，美國），胰蛋白酶（Sigma公司，美國），胎牛血清（維森特公司，加拿大），二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（上海生工生物工程有限公司），四甲基偶氮唑鹽[3-(4,5-dimethylthiazolyl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT]（Sigma公司，美國），鼠抗人波形絲蛋白抗體、鼠抗人細(xì)胞角蛋白抗體（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。Inion OTPS?醫(yī)用PLA可吸收接骨螺紋樁、細(xì)胞凋亡試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司）。4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）溶液（北京索萊寶科技有限公司），蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色劑（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司）。ELX-800型酶標(biāo)儀（Bio-Rad公司，美國），超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備廠），CO2培養(yǎng)箱（Forma scientific公司，美國），倒置顯微鏡（Olympus公司，日本）。AO-820型組織切片機(jī)（美國光學(xué)AO公司），OLYMPUSBX41型光學(xué)顯微鏡（Olympus公司，日本）。SD大鼠（廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心）。

本研究于口腔頜面修復(fù)與重建研究實(shí)驗(yàn)室（廣西壯族自治區(qū)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）、頜面外科疾病診治研究實(shí)驗(yàn)室（廣西高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）中完成。

1.2 方法

1.2.1 PLA樁膜及PLA樁膜浸提液的制備 將Inion OTPS?醫(yī)用PLA可吸收接骨螺紋樁0.4 g和氯仿20 mL置于棕色瓶中，密閉保存，讓其充分溶解呈油狀；將0.2 mL溶解液涂布在7 mm×20 mm的醫(yī)用載玻片上，置于37 ℃干燥箱中干燥48 h后，得到寬7 mm、長20 mm的薄膜[4]。

將PLA樁膜經(jīng)環(huán)氧乙烷滅菌處理后，按照中華人民共和國醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定，將無菌試樣放入無菌試管，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h獲取浸提液。要求試樣浸提液量與試樣表面積的比率為6 cm2·mL-1，制備出PLA樁膜浸提液備用。陰性對(duì)照組為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，陽性對(duì)照組為含0.64%苯酚的10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基。

1.2.2 人牙齦成纖維細(xì)胞（human gingival fibroblasts，HGF）的培養(yǎng)及初步鑒定 牙齦組織取材于廣西醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院口腔頜面外科門診因正畸拔牙且無牙齦炎癥的患者（牙齦組織為正畸牙牙頸部粘連的部分牙齦組織，取材均經(jīng)患者知情同意后進(jìn)行）?；颊吣挲g12～18歲。獲取的牙齦組織用含青霉素和鏈霉素的PBS溶液和無血清培養(yǎng)液各反復(fù)沖洗3遍，去除血液，手術(shù)剪剪碎，要求組織塊大?。? mm3。將小塊組織均勻鋪開，接種于50 mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入少量含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，在飽和濕度、37 ℃并含5%CO2標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀況，當(dāng)鋪滿培養(yǎng)板面積的80%時(shí)，用0.25%的胰蛋白酶消化傳代，培養(yǎng)基更換為含胎牛血清的DMEM。

取生長狀態(tài)良好的第4代HGF，制備細(xì)胞爬片，用SABC法進(jìn)行波形絲蛋白和角蛋白染色，進(jìn)行細(xì)胞來源鑒定，光鏡觀察。

取生長狀態(tài)良好的第4代HGF，待細(xì)胞爬滿瓶底50%后，實(shí)驗(yàn)組更換為PLA可吸收根管樁膜浸提液培養(yǎng)，陰性對(duì)照組仍使用10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，陽性對(duì)照組更換為含0.64%苯酚的10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，待陰性對(duì)照組細(xì)胞爬滿瓶底80%時(shí)，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長情況。

1.2.3 細(xì)胞毒性試驗(yàn)（MTT 法） 取第4代生長良好的人HGF接種于96孔板，每塊孔板隨機(jī)分為陰性對(duì)照組（每孔加200 μL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液），實(shí)驗(yàn)組（每孔加200 μL PLA可吸收根管樁膜浸提液），陽性對(duì)照組（每孔加200 μL含0.64%苯酚的10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液）。在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，分別于誘導(dǎo)培養(yǎng)后1、3、5、7 d，向每孔加MTT液20 μL，每時(shí)間點(diǎn)各8孔。37 ℃孵育4 h后加DMSO（每孔150 μL），600 r·min-1振蕩10 min，用酶標(biāo)儀在490 nm處測(cè)定吸光度A值，求均值并記錄結(jié)果，得到各組的細(xì)胞生長曲線，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。按以下公式計(jì)算細(xì)胞相對(duì)增殖率（relative growth rate，RGR）。RGR=實(shí)驗(yàn)組A值/空白對(duì)照組A值×100%。根據(jù)細(xì)胞毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)（RGR≥100%，毒性分級(jí)為0級(jí)；RGR為75%～99%、50%～74%、25%～49%、1%～ 24%、0%時(shí)，毒性分級(jí)分別為1、2、3、4、5級(jí)），將各組RGR值轉(zhuǎn)化為0～5級(jí)材料毒性評(píng)級(jí)。

1.2.4 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 取第4代HGF置于75 cm2培養(yǎng)瓶中，加含10%胎牛血清的DMEM，在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞長至50%時(shí)，實(shí)驗(yàn)組更換PLA可吸收根管樁膜浸提液為培養(yǎng)基，對(duì)照組為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合至80%時(shí)，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的存活率。

1.2.5 DAPI染色 取第4代HGF，接種于PLA可吸收樁膜上，培養(yǎng)48 h后除去細(xì)胞培養(yǎng)液，4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗去固定液。加入DAPI染色液，常溫下避光染色10 min。PBS洗滌3次，每次5 min。置于熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.2.6 PLA可吸收樁膜皮下植入實(shí)驗(yàn) 將Inion OTPS?醫(yī)用PLA可吸收接骨螺紋樁截為3.5 mm長，PLA樁膜裁剪為3.5 mm×20 mm大小。將PLA樁膜以逆時(shí)針方向纏繞在PLA可吸收螺紋樁上，每截可吸收螺紋樁纏繞3片薄膜為實(shí)驗(yàn)組。對(duì)照組為不纏繞樁膜的PLA可吸收螺紋樁。

選擇24只180～220 g的雌性SD大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。大鼠經(jīng)1%戊巴比妥鈉（30 mg·kg-1）腹腔注射麻醉后，俯臥位固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，背部去毛，消毒后鋪無菌巾，沿脊柱兩側(cè)縱行做兩個(gè)長5 mm左右的切口，相互間距大于10 mm。用鈍器在皮下制備皮囊，使囊的末端距切口大于10 mm，且能輕松放入實(shí)驗(yàn)材料。按隨機(jī)法分組，一個(gè)皮囊內(nèi)植入實(shí)驗(yàn)組材料，另一個(gè)皮囊內(nèi)植入對(duì)照組材料，縫合手術(shù)切口，聚維酮碘消毒切口。所有動(dòng)物手術(shù)后繼續(xù)飼養(yǎng)。于第1、4、8、12周4個(gè)時(shí)間點(diǎn)從動(dòng)物背部取出植入材料及周圍皮下組織，觀察切口的大體表現(xiàn)。標(biāo)本用4%甲醛溶液固定，石蠟包埋，制備組織切片，HE染色，通過觀察炎癥細(xì)胞的浸潤程度檢測(cè)各組材料的局部組織炎癥和異物反應(yīng)情況。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞來源鑒定及形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

倒置顯微鏡下觀察可見，約7 d左右，HGF從組織塊游出，生長狀態(tài)良好，為成纖維樣細(xì)胞，傳代后細(xì)胞生長旺盛，性狀穩(wěn)定。第4代細(xì)胞呈長梭形，胞體豐滿，細(xì)胞質(zhì)均勻，細(xì)胞核呈圓形或卵圓形，核仁清晰。免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示：HGF抗波形絲蛋白染色陽性，抗角蛋白染色陰性（圖1），提示培養(yǎng)的細(xì)胞為間充質(zhì)來源細(xì)胞。PLA浸提液誘導(dǎo)培養(yǎng)后，實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組比較，細(xì)胞形態(tài)無明顯差異；陽性對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)改變，細(xì)胞凋亡增多。

2.2 細(xì)胞毒性檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組和陽性對(duì)照組的細(xì)胞生長曲線見圖2：陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組HGF在4個(gè)時(shí)間點(diǎn)的增殖能力差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但均高于陽性對(duì)照組（P＜0.05）。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組A值相應(yīng)增加，換算成細(xì)胞毒性級(jí)別如下：實(shí)驗(yàn)組在第1天細(xì)胞毒性分級(jí)為1級(jí)，第3、5、7天均為0級(jí)，陽性對(duì)照組均為4級(jí)。該結(jié)果提示，PLA根管樁膜無明顯的細(xì)胞毒性。

圖 1 HGF來源鑒定 光學(xué)顯微鏡 × 200Fig 1 HGF sources identification optical microscope × 200

圖 2 各組HGF的細(xì)胞生長曲線Fig 2 Cell growth curves of HGF in each group

2.3 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示，對(duì)照組活細(xì)胞百分率為92.5%，實(shí)驗(yàn)組活細(xì)胞百分率為88.8%，均在正常范圍內(nèi)，表明PLA根管樁膜浸提液對(duì)HGF的生長無明顯影響。

2.4 DAPI染色

DAPI染色結(jié)果見圖3：細(xì)胞核呈典型藍(lán)色熒光，提示PLA可吸收根管樁膜表面有成纖維細(xì)胞黏附和生長。

2.5 PLA可吸收樁膜皮下植入實(shí)驗(yàn)

2.5.1 手術(shù)后大體標(biāo)本觀察結(jié)果 1）術(shù)后1周，實(shí)驗(yàn)組可見背部皮膚切口愈合良好，切口無膿腫、感染。肉眼觀察大體標(biāo)本可見植入材料與周圍組織接觸良好，未見明顯移位，材料周圍有大量的炎癥肉芽組織增生。對(duì)照組標(biāo)本所見與實(shí)驗(yàn)組基本相同。2）術(shù)后4周，實(shí)驗(yàn)組可見大鼠背部切口完全愈合，局部無紅腫和積液；材料未見移位，周圍被致密纖維組織包裹，囊壁較厚。對(duì)照組標(biāo)本所見與實(shí)驗(yàn)組基本相同。3）術(shù)后8周，實(shí)驗(yàn)組材料未移位，可見纖維結(jié)締組織包裹，組織與材料結(jié)合緊密。對(duì)照組標(biāo)本所見與實(shí)驗(yàn)組基本相同。4）術(shù)后12周，實(shí)驗(yàn)組材料未移位，可見大量纖維結(jié)締組織包裹，與材料接觸緊密，分離困難。對(duì)照組標(biāo)本所見與實(shí)驗(yàn)組基本相同。

2.5.2 HE染色 兩組的HE染色結(jié)果見圖4。1）術(shù)后1周，實(shí)驗(yàn)組材料周圍組織可見較多的炎癥細(xì)胞浸潤，以中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞為主，無組織壞死；對(duì)照組材料周圍也有類似反應(yīng)。2）術(shù)后4周，實(shí)驗(yàn)組可見淋巴細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、漿細(xì)胞和單核細(xì)胞浸潤；對(duì)照組也有類似反應(yīng)。3）術(shù)后8周，實(shí)驗(yàn)組以纖維結(jié)締組織增生為主，炎癥細(xì)胞數(shù)目明顯減少，纖維細(xì)胞的數(shù)目和比例均增大；對(duì)照組也有類似反應(yīng)。4）術(shù)后12周，實(shí)驗(yàn)組炎癥反應(yīng)不明顯，可見大量的成纖維細(xì)胞和較少量的炎癥細(xì)胞；與對(duì)照組沒有明顯區(qū)別。

圖 3 DAPI染色 熒光顯微鏡 × 100Fig 3 DAPI staining fluorescence microscope × 100

圖 4 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的組織學(xué)檢測(cè) HE × 200Fig 4 Histology detection of experimental group and control group HE × 200

3 討論

乳牙殘冠殘根常因無可吸收修復(fù)材料而拔除，乳牙早失不僅會(huì)影響患兒的美觀和發(fā)音，還會(huì)影響乳恒牙替換與頜骨發(fā)育[5-6]。隨著生物材料學(xué)的發(fā)展，越來越多的可吸收材料應(yīng)用于臨床。目前常用的可吸收材料主要為聚乳酸類，例如PLA、聚乙醇酸、乳酸-乙醇酸共聚物等制品。因?yàn)檫@些材料具有良好的力學(xué)性能、生物降解性能和生物學(xué)性能，所以得到越來越多的關(guān)注[7]。

目前尚無與乳牙可吸收樁配套的可吸收粘接系統(tǒng)。借鑒水暖安裝工程[8]中以高分子材料聚四氟乙烯生料帶封閉螺紋連接管道，使管內(nèi)物質(zhì)不向外泄露的方法，采用溶劑揮發(fā)成膜法制備與PLA可吸收樁材質(zhì)相同的PLA可吸收樁膜，可以作為樁的固位與封閉材料，為PLA可吸收樁提供了可以同步吸收的粘接系統(tǒng)。研究[9-10]表明，PLA可吸收樁膜的封閉性能與玻璃離子粘接劑相似，對(duì)根管封閉性能良好，且可吸收根管樁纏繞樁膜修復(fù)殘根后的抗折力能滿足臨床需求，可用于乳牙殘根殘冠的修復(fù)。

因?yàn)樵诳晌諛赌ぶ苽溥^程使用了有機(jī)溶劑氯仿，故需進(jìn)行生物相容性實(shí)驗(yàn)，以便檢測(cè)其安全性。生物學(xué)評(píng)價(jià)包括細(xì)胞毒性試驗(yàn)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床前試驗(yàn)[11]。體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)對(duì)口腔材料的初級(jí)篩選起到了非常重要的作用，節(jié)約了大量的資源和時(shí)間。此外，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)還可直接觀察細(xì)胞與材料的復(fù)合生長情況，操作相對(duì)簡(jiǎn)單，可控性強(qiáng)[12]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)較細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果更接近人體實(shí)際，彌補(bǔ)了體外實(shí)驗(yàn)難以模擬的綜合反應(yīng)。由于沒有一種實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蛲耆从吵霾牧系纳锵嗳菪?，故?xì)胞毒性試驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均是口腔材料生物相容性評(píng)價(jià)不可或缺的環(huán)節(jié)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：PLA可吸收根管樁膜對(duì)HGF生長無明顯影響，毒性評(píng)級(jí)為0～1級(jí)，無毒；HGF可在樁膜上生長；加入浸提液培養(yǎng)后，活細(xì)胞百分率與對(duì)照組無明顯差別；大鼠組織大體觀察和HE染色觀察結(jié)果與對(duì)照組相似，符合生物安全性要求。由此可以推測(cè)，PLA根管樁膜的出現(xiàn)可以推進(jìn)PLA根管樁在臨床上的使用，為乳牙殘根殘冠修復(fù)提供了新的手段。

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（本文編輯 吳愛華）

Biocompatibility of polylactic acid-absorbable root post film

Zhao Zheshan, Huang Hua, Qiu Rongmin, Wei Kezhen, Li Limei.
(Dept. of Pediatric Dentistry, Hospital of Stomatology, Guangxi Medical University, Nanning 530021, China)

Supported by: Clinical Research Funds Project for Oral Health Promotion and Oral Medicine Development in Western of China Hold by Chinese Stomatological Association (CSA-W2012-01). Correspondence: Huang Hua, E-mail: huanghua58430@ 126.com.

Objective To study the biocompatibility of the polylactic acid (PLA)-absorbable root post film prepared by solvent evaporation film. Methods The PLA post film-leaching liquor was prepared by the solvent evaporation of PLA root post films, and its biocompatibility was measured. Sources of human gingival fibroblasts (HGF) were cultivated in vitro and identified initially by the immunohistochemistry method. The toxicity reaction, survival rate, and morphological change of HGF incubated in PLA post film-leaching liquor were observed and tested by morphological observation, 3-(4,5-dimethylthiazolyl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay, and flow cytometry. The HGF were implanted on the PLA post film and observed by 4’,6-diamidino-2-phenylindole staining. After implanting the PLA post film, the surrounding subcutaneous tissue of SD rats and the implants were removed from the back of the rats in the 1st, 4th, 8th, and 12th weeks to observe the general condition of the incisions. The organization was given the hematoxylin-eosin (HE) stain to find the organization condition of local tissue inflammation and foreign body reaction through the infiltration degree of inflammatory fibroblasts. Results The effects of the PLA post film-leaching liquor on the proliferation of HGF and fibroblast toxicity were insignificant. The living fibroblast rate was similar to the normal control group. The HGF were able to grow on the PLA film. The results of the organization general observation and HE staining of the rats were similar to the results for the control group, which met all the demands made by biological safety. Conclusion The PLA-absorbable root post film prepared by the solvent evaporation film has good biocompatibility and can be used for further clinical research.

solvent evaporation method; polylactic acid; root post; deciduous teeth; biocompatibility

R 788

A [doi] 10.7518/hxkq.2016.05.006

2016-04-05；

2016-07-02

中華口腔醫(yī)學(xué)會(huì)口腔健康促進(jìn)與口腔醫(yī)學(xué)發(fā)展西部行臨床科研基金（CSA-W2012-01）

趙哲珊，碩士，E-mail：zhaozheshan@126.com

黃華，主任醫(yī)師，碩士，E-mail：huanghua58430@126.com