姚令文+石巖+孫冬梅+程顯隆+魏鋒+馬雙成

[摘要] 建立了人工牛黃薄層指紋圖譜，對其圖像進行數(shù)字化和化學(xué)計量學(xué)研究。首先采用以環(huán)己烷-乙酸乙酯-乙酸-甲醇（2∶7∶1∶2）為展開劑，10%硫酸乙醇溶液為顯色劑，105 ℃加熱至斑點清晰，并在366 nm下采集數(shù)碼圖像。然后將該圖像轉(zhuǎn)換成為灰度圖像，得到指紋圖譜的灰度曲線圖多元數(shù)據(jù)，并采用主成分分析法對多元數(shù)據(jù)進行分析。結(jié)果表明薄層指紋圖譜可表征不同生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)的人工牛黃，并且分析得到圖譜上表征來源的特征區(qū)域。該方法簡便，快速，適合用于不同來源的人工牛黃質(zhì)量差異的評價。

[關(guān)鍵詞] 人工牛黃；薄層色譜；指紋圖譜；膽汁酸；化學(xué)計量學(xué)；主成分分析

[Abstract] A method of thin-layer fingerprinting chromatogram of artificial cow-bezoar was established with the developing solvent consisting of cyclohexane，ethyl acetate，acetic acid and methanol （2∶7∶1∶2），and 10% sulfuric acid ethanol solution sprayed as colour-developing agent. After heated at 105 ℃，TLC was recorded as an image in ultraviolet light at 366 nm which was converted into grayscale. By the gray value extracted from the grayscale，the multivariate data obtained from TLC of samples could be analyzed by chemometric method. The results indicated that samples from different manufacturers could be distinguished by this method and some specific bands were found out. All in one，this simple and practical method was suitable for the evaluation of quality difference.

[Key words] artificial cow-bezoar；TLC；fingerprinting；bile acids；chemometrics；principle component analysis

人工牛黃是目前最常用的牛黃替代品，多用作成藥復(fù)方的原料，據(jù)筆者統(tǒng)計，在《中國藥典》2010年版一部中有近40個品種的成藥配方中使用了人工牛黃，涉及國藥生產(chǎn)準(zhǔn)字文號達(dá)100余個[1]。人工牛黃由牛膽粉、膽酸、豬去氧膽酸、?；撬帷⒛懠t素、膽固醇、微量元素等加工而成，具有清熱解毒，化痰定驚之功效[2]。其生產(chǎn)企業(yè)較多，生產(chǎn)工藝和原料質(zhì)量參差不齊，目前對其質(zhì)量評價或控制的研究多為膽酸類和膽紅素等成分的測定[3-12]，采用的方法也多為高效液相色譜法。本文在以上研究的基礎(chǔ)之上，采用圖像的灰度數(shù)字化分析方法對人工牛黃的薄層色譜圖片進行處理，并使用化學(xué)計量學(xué)的信號處理技術(shù)及模式識別方法對其進行了進一步的處理以及分析，以期為人工牛黃的生產(chǎn)工藝的規(guī)范和質(zhì)量控制的研究提供思路及參考。

1 材料

Camag Linomat 5型半自動點樣儀（瑞士Camag公司）；Digistore 2數(shù)碼成像系統(tǒng)（瑞士Camag公司）；ChemDataSolution軟件（大連達(dá)碩信息技術(shù)有限公司）。

對照品豬去氧膽酸（批號100087-200610）、膽酸（批號100078-200414）、鵝去氧膽酸（批號110806-201105）、去氧膽酸（批號724-200207）、牛磺膽酸鈉（批號110815-201309）均來自中國食品藥品檢定研究院；甘氨膽酸鈉（批號：PSMEN-AS）來自東京TCI公司。供試品為5個生產(chǎn)企業(yè)，共19個批次人工牛黃樣品（經(jīng)檢驗均符合《中國藥典》2015年版標(biāo)準(zhǔn)），見表1。薄層色譜硅膠G板（德國Merck公司）；環(huán)己烷、乙酸乙酯、乙酸、甲醇、乙醇、硫酸等試劑均為分析純。

實驗材料，見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備 分別取各供試品約0.1 mg，置于具塞錐形瓶中，加甲醇10 mL，超聲提取10 min，過濾，即得。

2.2 薄層色譜條件 分別取對照品溶液和供試品溶液各5 μL，條帶狀點樣于薄層色譜硅膠G板，條帶寬6 mm，間距5 mm。以環(huán)己烷-乙酸乙酯-乙酸-甲醇（2∶7∶1∶2）為展開劑展開，10%硫酸乙醇溶液為顯色劑，105 ℃加熱至斑點清晰，366 nm下用Digistore 2數(shù)碼成像系統(tǒng)觀測并采集數(shù)碼圖像，見圖1。

2.3 薄層特征圖譜的數(shù)字化 將366 nm下檢視采集得到的數(shù)碼圖像進行灰度轉(zhuǎn)化，對生成的灰度圖像進行軌道劃分以及背景選擇，以比移值（Rf）為橫坐標(biāo)，以灰度值為縱坐標(biāo)，即可得到各批樣品的薄層色譜圖像灰度值色譜數(shù)據(jù)，見圖2。

2.4 數(shù)據(jù)的預(yù)處理 將以上所得數(shù)據(jù)導(dǎo)入ChemDataSolution進行平滑濾波處理，采用Savitzky-Golay法，窗口及多項式階數(shù)分別選擇9和2，平滑濾波前后見圖3。

采用COW（correlation optimized warping）法對平滑濾波后的數(shù)據(jù)進行色譜峰峰位（薄層色譜斑點的比移值）的校準(zhǔn)處理，參數(shù)segment Length和slack size分別選擇16和5，見圖4。

將原點（第1個至第38個變量）及前沿附近（第574個至第641個變量）的數(shù)據(jù)切除，選取第39個至第573個的變量作為待分析數(shù)據(jù)，見圖5。

2.5 數(shù)據(jù)的分析 將經(jīng)過2.4項處理所得的數(shù)據(jù)導(dǎo)入ChemDataSolution進行主成分分析，選取主成分?jǐn)?shù)為7，累計方差情況及樣品的第1和第2主成分得分分布見圖6。

3 討論

3.1 展開系統(tǒng)與檢視條件的選擇 由于人工牛黃中不僅含有游離型膽汁酸，還含有結(jié)合型膽汁酸[13]，這兩種膽汁酸極性差異很大，較難保證在相同的薄層色譜中都位于適當(dāng)?shù)谋纫浦捣秶?.3～0.8），本研究所采用的展開系統(tǒng)可使人工牛黃中的膽汁酸類成分基本得到較適宜的分離，能夠滿足本研究所需的特征性研究。在本研究的基礎(chǔ)之上，后續(xù)研究可以針對特征比移值范圍相應(yīng)地對展開系統(tǒng)進行調(diào)整。

由圖1可明顯的觀察到，薄層硅膠板上膽汁酸類成分的斑點經(jīng)硫酸顯色后，可在日光、254 nm和366 nm下檢視，不同膽汁酸類成分的斑點顏色存在一定的差異。通過這3種檢視方法可分別檢出人工牛黃樣品薄層色譜中的6，7，8個斑點，可見366 nm下檢視靈敏度最高，因此后續(xù)的數(shù)字化處理以及分析研究均是以366 nm下獲得的色譜圖為對象。

3.2 色譜斑點的指認(rèn) 圖1表明，根據(jù)對照品斑點定位，可指認(rèn)出斑點b，e，g，h所對應(yīng)的成分分別為?；悄懰徕c、甘氨膽酸鈉、膽酸和豬去氧膽酸，而斑點i則為鵝去氧膽酸和去氧膽酸的混合斑點。對于斑點c，d，f來說，其成分還有待進一步研究。

3.3 圖像數(shù)字化方法的設(shè)計 彩色圖像是由紅（R）、綠（G）、藍(lán)（B）三原色通道在各個像素點呈現(xiàn)組合而成。RGB的每個通道都有256階亮度，根據(jù)三通道亮度階數(shù)可將彩色圖像轉(zhuǎn)換成為灰度圖像，灰度值與RGB三通道亮度階數(shù)均相關(guān)。如圖2所示，根據(jù)這一原理可將樣品復(fù)雜的TLC彩色圖像轉(zhuǎn)換成為簡單的灰度圖像，并從原點至前沿依次讀取每個像素點的灰度值即可將其數(shù)字化。由于薄層色譜經(jīng)常會出現(xiàn)背景干擾的情況，因此選擇在每個展開軌道之間選取背景去除，以盡可能減小背景引起的誤差。

值得一提的是，本文所采用的薄層色譜數(shù)字化的方法與薄層色譜掃描法所得結(jié)果具有本質(zhì)的區(qū)別。薄層色譜掃描法是指用一定波長的光照射在薄層板上，對薄層色譜中可吸收紫外光或可見光的斑點，或經(jīng)激發(fā)后能發(fā)射出熒光的斑點進行掃描[14]；而本文所采用的方法是基于薄層色譜的圖像，采用的數(shù)字信號是源于圖像本身的像素點的灰度強度。顯然，本文研究方法采用的薄層色譜的數(shù)字信號與實驗人員肉眼檢視更具有一致性，但是對于實驗人員的肉眼檢視來講，又具有一定的可量化性、可描述性以及分析便利性。

3.4 數(shù)據(jù)的預(yù)處理方法 原始數(shù)據(jù)存在噪音過大和色譜峰（薄層斑點）漂移的問題，無法直接進行分析。Savitzky-Golay法是Savitzky和Golay于20世紀(jì)60年代共同提出的，其原理是對數(shù)據(jù)中N個量測點進行多項式最小二乘擬合，該法既能有效提高數(shù)據(jù)信號的信噪比又能較好對有效信息進行保留，目前在分析化學(xué)信號預(yù)處理中被廣泛的使用。對于信號峰漂移的問題，目前國際上最常用的方法有COW法、DTW（dynamic time warping）法、PWA（piecewise alignment）法和PTW（parametric time warping）法等，其中COW法最早由Nielsen等人開發(fā)[15]，目前在色譜信號校正工作中最為常用[16-17]。在本研究中首先采用了Savitzky-Golay法對原始數(shù)據(jù)進行濾波平滑處理，而后使用了COW法對色譜峰的漂移問題進行了修正，經(jīng)過以上處理較好的解決了噪音誤差問題以及色譜峰的漂移問題。此外，由于原點以及展開前沿在TLC色譜分析中意義不大，故將這兩處數(shù)據(jù)變量除去之后做進一步的分析研究。

3.5 主成分分析結(jié)果 第1和第2主成分的累計方差貢獻率盡管只有61.9%，但是這2個主成分卻表征了不同來源（不同廠家）人工牛黃的薄層色譜的特征性差異，而第3個主成分則特征性差異的特點不明顯，見圖7。可見第1和第2主成分包含了薄層色譜數(shù)據(jù)中的大多數(shù)特征信息。其中第1主成分表征了生產(chǎn)企業(yè)A和C與生產(chǎn)企業(yè)B，D和E的產(chǎn)品差異特征，而第2主成分表征了生產(chǎn)企業(yè)C，E與生產(chǎn)企業(yè)A，B與生產(chǎn)企業(yè)D的產(chǎn)品差異特征。 主成分分析中的主成分是所有變量的線性組合，其指向及意義具有一定的抽象性，但是根據(jù)載荷圖可判斷主成分與變量之間的相關(guān)性進而會對變量特征性指認(rèn)有所幫助見圖8。橫坐標(biāo)為各變量，也就是薄層色譜圖中由原點向展開前沿方向的各像素點，因此可將圖8中的橫坐標(biāo)轉(zhuǎn)換為實際的比移值，據(jù)此將圖8中的相關(guān)變量轉(zhuǎn)換為比移值后，可知比移值在0.14～0.23以及0.37～0.51的薄層色譜與第1主成分相關(guān)性最大，即存在較大的A和C與B，D和E的產(chǎn)品差異特征，同理可得到比移值在0.29～0.33以及0.85～0.90的薄層色譜與第2主成分相關(guān)性最大，即存在較大的C和E與A和B與D的產(chǎn)品差異特征。

4 結(jié)論

作為牛黃的替代品，人工牛黃處方是比較明確的，但經(jīng)調(diào)查了解，各生產(chǎn)企業(yè)在生產(chǎn)過程中，具體工藝是嚴(yán)格保密的，各生產(chǎn)企業(yè)的原料的投料比例以及原料采購均有差異，因此客觀上造成不同生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)的人工牛黃客觀存在一定的差異。筆者在之前研究中[13，18-21]曾因膽汁酸類物質(zhì)的紫外吸收較弱而采用了柱前衍生以及蒸發(fā)光檢測器等方法對膽汁酸類成分進行檢測和研究，然而從定性角度對膽汁類藥品進行質(zhì)量控制以及評價來講，薄層色譜法具有無可比擬的簡便，快速、直觀等特點。本研究表明不同來源樣品的薄層色譜是存在一定規(guī)律性的差異的，并且按照本文的方法能夠找到表征不同來源樣品的特征比移值區(qū)域，希望本文能夠?qū)υ撈贩N藥品的來源質(zhì)量差異的研究提供一些參考。

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[責(zé)任編輯 丁廣治]