姚振

(長江大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖北荊州434025 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子植物生理實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510640)

沈博然，彭新湘

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子植物生理實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640)

LoxP-Cre重組技術(shù)在構(gòu)建馬鈴薯光呼吸代謝支路中的應(yīng)用

姚振

(長江大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖北荊州434025 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子植物生理實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510640)

沈博然，彭新湘

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子植物生理實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640)

利用LoxP-Cre同源重組原理，以表達(dá)盒堆積的方式組合光呼吸代謝支路改造基因AtGDH、EcGCL和EcTSR，成功構(gòu)建了多基因轉(zhuǎn)化載體pYL-GCL-GDH-TSR，通過根癌農(nóng)桿菌侵染以及潮霉素篩選，獲得了馬鈴薯轉(zhuǎn)化植株。分子檢測表明，轉(zhuǎn)基因植株中3個(gè)目的基因在mRNA水平均能得到表達(dá)，但在蛋白水平無表達(dá)。轉(zhuǎn)基因植株在表型和微型薯的發(fā)育上與野生型植株無明顯區(qū)別，可能原因是由于多基因一次性轉(zhuǎn)化與葉綠體定位的雙重要求，增加了馬鈴薯遺傳轉(zhuǎn)化及蛋白有效表達(dá)的難度。

馬鈴薯；多基因轉(zhuǎn)化；光呼吸

在C3植物中，通過構(gòu)建光呼吸代謝支路以增加碳同化效率，從而提高生物量，這些支路包括Kebeish支路[1]、Maier支路[2]和Carvalho支路[3]。Nolke等[4]采用融合蛋白技術(shù)在馬鈴薯中表達(dá)的大腸桿菌GDH的3個(gè)亞基實(shí)質(zhì)上仍是屬于Kebeish支路。光呼吸代謝改造通常需要將2～4個(gè)基因引入葉綠體并協(xié)調(diào)表達(dá)。多基因轉(zhuǎn)化可以采用組合轉(zhuǎn)化、雜交、逐步轉(zhuǎn)化、質(zhì)體轉(zhuǎn)化等技術(shù)，這些技術(shù)的使用受限于植物的遺傳轉(zhuǎn)化體系、繁殖方式、工作量以及植物生長周期等條件。

馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)是茄科茄屬一年生草本，其塊莖可供食用，是重要的糧食、蔬菜和新興的能源作物。馬鈴薯的人類可食用部分高達(dá)85%，相比之下谷類作物大約為50%，馬鈴薯富含碳水化合物，使其成為良好的熱能來源。2011年，完成了馬鈴薯全基因組測序和分析[5]。破譯馬鈴薯基因組序列，對(duì)于科學(xué)家們從分子水平上了解馬鈴薯的生長、發(fā)育及繁殖過程具有重要的意義。該項(xiàng)研究同時(shí)表明栽培種經(jīng)歷了多次淘汰選擇，造成基因庫狹窄。馬鈴薯的遺傳轉(zhuǎn)化一直是研究熱點(diǎn)，多基因轉(zhuǎn)化載體特別是光呼吸改造的多基因轉(zhuǎn)化載體對(duì)馬鈴薯的遺傳轉(zhuǎn)化體系的影響具有很大的未知性。

在光呼吸代謝支路構(gòu)建過程中，引入代謝乙醇酸的酶是關(guān)鍵步驟。細(xì)菌的乙醇酸脫氫酶含有D、E、F 3個(gè)亞基，由3個(gè)基因編碼，在Kebeish等[1]和Nolke等[4]的研究中分別以二次轉(zhuǎn)化和融合蛋白的方式表達(dá)了細(xì)菌的乙醇酸脫氫酶。Maier等[2]的研究中，在采用植物的乙醇酸氧化酶的同時(shí)，引入了細(xì)菌的過氧化氫酶以分解過氧化氫。有報(bào)道[6]指出，AtGDH(GI：30681516)編碼擬南芥的D-乳糖脫氫酶，該酶同時(shí)具有乙醛酸脫氫酶的活性。

本研究利用華南農(nóng)業(yè)大學(xué)劉耀光研究員提供的LoxP-Cre多基因組裝系統(tǒng)構(gòu)建多基因表達(dá)載體[7]，一次性將光呼吸改造需要的3個(gè)基因乳糖脫氫酶基因AtGDH、乙醛酸聚醛酶基因EcGCL(GI：49175990)和羥基丙二酸半醛還原酶基因EcTSR(GI：49175990)，以表達(dá)盒堆積(Cassette stacking)的方式導(dǎo)入馬鈴薯基因組，并對(duì)轉(zhuǎn)基因植株的基因表達(dá)及表型進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1多基因轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建

多基因轉(zhuǎn)化載體由2個(gè)供體載體pDonor1、pDonor2和1個(gè)受體載體pYL1305組成。供體質(zhì)粒和受體質(zhì)粒共轉(zhuǎn)攜帶重組酶基因的NS3529菌株，挑選發(fā)生重組的受體質(zhì)粒，基于LoxP-Cre重組的原理將目標(biāo)基因的表達(dá)盒逐步添加到受體載體。大腸桿菌乙醛酸聚醛酶基因(EcGCL)和水稻rbcS葉綠體定位信號(hào)肽基因序列RTPC(141bp，編碼47個(gè)氨基酸)連接直接連入pYL1305替換載體骨架的GUS基因；擬南芥乙醇酸脫氫酶基因(AtGDH)和RTPC連接到二元載體pOX(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)劉耀光研究員贈(zèng)送、提供ubi啟動(dòng)子和終止子)，然后表達(dá)盒連入pDonor1；羥基丙二酸半醛還原酶基因(EcTSR)和RTPC連入載體pCactF(提供Actin啟動(dòng)子和終止子)，然后表達(dá)盒連入pDonor2。供受體質(zhì)粒通過進(jìn)行2輪重組構(gòu)建目標(biāo)載體pYL-GCL-GDH-TSR(圖1)。

注：35S-HPT——35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的潮霉素抗性基因； 35S-GUS——35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的綠色熒光蛋白GUS；LoxP、1L、2L、1R、2R——重組位點(diǎn)；I-Sce I、PI-Sce I——?dú)w位內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)；TSR——大腸桿菌羥基丙二酸半醛還原酶EcTSR；AtGDH——擬南芥乙醇酸脫氫酶AtGDH；GCL——大腸桿菌乙醛酸聚醛酶EcGCL。圖1 多基因表達(dá)載體及目標(biāo)載體質(zhì)粒圖譜

1.2馬鈴薯的試管薯誘導(dǎo)

轉(zhuǎn)化品種為‘鄂馬鈴薯三號(hào)’，采用種薯建立無菌體系。試管苗莖段培養(yǎng)20d后，苗高3～6cm時(shí)，將試管苗再切段轉(zhuǎn)至試管薯誘導(dǎo)培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基添加80g/L的蔗糖，添加2g/L活性碳)，在光周期(光照8h、黑暗16h)，溫度周期(光照20℃、黑暗18℃)的條件下誘導(dǎo)試管薯。誘導(dǎo)約8～10周后，采收試管薯進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。

1.3馬鈴薯的遺傳轉(zhuǎn)化

將準(zhǔn)備好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌菌株LBA4404，準(zhǔn)備浸染菌液。試管薯切片厚度約1～2mm，侵染10min，將切片吸干浸染液轉(zhuǎn)入P1培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基，添加6-BA 0.5mg/L+ZT 2.0mg/L+GA30.2mg/L+IAA 1.0mg/L)。將浸染后的材料暗培養(yǎng)48h，轉(zhuǎn)入P1培養(yǎng)基(添加400mg/L頭孢霉素、潮霉素)上進(jìn)行分化篩選培養(yǎng)。轉(zhuǎn)化30d以后，待薯片表面分化出幼芽，將生長1～2cm的幼芽剪下，轉(zhuǎn)移到MS培養(yǎng)基(添加200mg/L頭孢霉素、篩選劑潮霉素)進(jìn)行生根篩選。通過試管薯切片作為外植體轉(zhuǎn)化，采用了2、4、6、8、10、12mg/L潮霉素篩選濃度進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，并最終采用2mg/L的潮霉素進(jìn)行篩選。通過篩選獲得的再生植株轉(zhuǎn)入含有10mg/L潮霉素的MS培養(yǎng)基進(jìn)行生根篩選，最后轉(zhuǎn)入泥炭土定植，觀察生長發(fā)育情況并采收微型薯。

1.4馬鈴薯陽性植株分子水平的檢測

檢測引物見表1。提取馬鈴薯植株總RNA的提取并反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。cDNA純度的檢測采用馬鈴薯RbcS基因，有基因組DNA污染的樣品可以擴(kuò)增到約500bp的片段，馬鈴薯的cDNA只能擴(kuò)增到約140bp的片段。轉(zhuǎn)錄水平檢測以馬鈴薯的細(xì)胞延長因子(Ef-1)作為內(nèi)參。轉(zhuǎn)基因株系和野生型株系取葉片提取蛋白。定量后的樣品等蛋白量上樣電泳，采用EcTSR、EcGCL、AtGDH蛋白相應(yīng)的抗體進(jìn)行Western blot分析。

表1 馬鈴薯轉(zhuǎn)基因植株分子檢測的引物

2 結(jié)果與分析

2.13個(gè)目標(biāo)基因的表達(dá)盒成功構(gòu)建到多基因表達(dá)載體

圖2 pYL-GCL-GDH-TSR構(gòu)建過程的酶切鑒定

通過兩輪的重組以及一次酶切連接，3個(gè)基因的表達(dá)盒成功連接到受體載體。兩個(gè)供體載體pDonor1、pDonor2在多克隆位點(diǎn)的兩端設(shè)計(jì)有限制性內(nèi)切酶NotI的識(shí)別位點(diǎn)，通過重組接入受體載體的表達(dá)盒可以通過NotI酶切檢測。從圖2可以看出，第1輪接入AtLDH表達(dá)盒和第2輪接入的TSR表達(dá)盒均在相應(yīng)大小的位置出現(xiàn)了條帶，表明二者均順利接入了受體載體。通過測序分析，認(rèn)為目標(biāo)載體沒有出現(xiàn)錯(cuò)配和序列丟失，3個(gè)目標(biāo)基因的表達(dá)盒成功構(gòu)建到多基因表達(dá)載體。

2.2馬鈴薯試管薯外植體潮霉素篩選體系的建立與轉(zhuǎn)基因植株的獲得

潮霉素通過抑制植物蛋白質(zhì)的合成，進(jìn)而影響植物的生理代謝。在誘導(dǎo)再生的培養(yǎng)基中添加1mg/L的潮霉素，經(jīng)過農(nóng)桿菌浸染的試管薯切片接觸培養(yǎng)基的一面邊緣出現(xiàn)發(fā)黑，隨著篩選時(shí)間的延長，切片大量死亡。在2mg/L潮霉素濃度以上的篩選壓力下，試管薯切片可以在不接觸培養(yǎng)基的另一側(cè)產(chǎn)生少量愈傷組織，但是這些愈傷組織不會(huì)分化，繼續(xù)篩選后，這些試管薯切片逐漸褐化死亡，但這個(gè)階段持續(xù)的時(shí)間很長。馬鈴薯試管薯切片在篩選培養(yǎng)基再生的芽有4種情況(圖3)，從試管薯切片不接觸培養(yǎng)基的一側(cè)直接分化的再生芽占很小比例。此外，相對(duì)于生根階段，馬鈴薯在愈傷組織的分化階段對(duì)潮霉素敏感程度較高。

2.3轉(zhuǎn)基因馬鈴薯材料的分子檢測

在獲得馬鈴薯的轉(zhuǎn)化陽性株系中，選擇株系PGLT進(jìn)行分子檢測。在DNA水平，篩選基因HPT和目標(biāo)基因EcGCL、EcTSR、AtGDH均能在PGLT株系中檢測到，而野生型無法擴(kuò)增到相應(yīng)的條帶。擴(kuò)增條帶的大小符合預(yù)計(jì)長度，并和陽性CK擴(kuò)增長度相同(圖4 A、B、C、D)。在RNA水平，PGLT和野生型植株的cDNA中，采用35個(gè)循環(huán)擴(kuò)增，沒有擴(kuò)增到含有內(nèi)含子的條帶(圖4 E)，表明cDNA中沒有基因組DNA的污染。通過半定量RT-PCR檢測，可以檢測到篩選基因HPT和3個(gè)目標(biāo)基因EcGCL、EcTSR、AtGDH的正常轉(zhuǎn)錄(圖4 F、G、H、I)。

2.4轉(zhuǎn)基因馬鈴薯株系的表型

轉(zhuǎn)基因植株P(guān)GLT表現(xiàn)為潮霉素抗性(圖5A)，說明潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶可以正常表達(dá)蛋白并表現(xiàn)潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶活性。試管苗經(jīng)過快速繁殖，移栽到蛭石后，存活并生長發(fā)育良好，將幼苗移栽到泥炭土基質(zhì)后，轉(zhuǎn)基因植株和野生型均能正常的生長，在約90d后，采收到微型薯(圖5B)。整個(gè)移栽體系可以滿足馬鈴薯遺傳轉(zhuǎn)化的需要。經(jīng)過兩代的種植，轉(zhuǎn)基因植株相對(duì)于野生型沒有明顯差異。轉(zhuǎn)基因株系的微型薯偏小，但差異不顯著(圖5C)。

3 討論

3.1潮霉素可以用作馬鈴薯遺傳轉(zhuǎn)化的篩選劑，但效率較低

在馬鈴薯的遺傳轉(zhuǎn)化中，既可用葉片、葉柄、莖段為外植體，通過愈傷組織途徑建立再生體系，也可以試管薯、微型薯、薯塊為外植體，建立直接分化再生轉(zhuǎn)化系統(tǒng)[8～11]。本研究在預(yù)實(shí)驗(yàn)階段發(fā)現(xiàn)莖段的再生體系極不穩(wěn)定，葉片浸染的操作難度較大，最終放棄了采用莖段和葉片作為外植體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，改為采用試管薯作為外植體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。

在多基因轉(zhuǎn)化的方法中，可以采用進(jìn)行逐步轉(zhuǎn)化，但是需要2個(gè)以上的篩選標(biāo)記。潮霉素和卡那霉素是植物遺傳轉(zhuǎn)化中兩種常用的篩選劑，但是一般認(rèn)為單子葉植物如水稻一般使用潮霉素作為篩選劑。采用試管薯切片作為外植體，卡那霉素作為篩選劑可以取得較好的效果[12～14]。本研究采用潮霉素作為篩選劑，發(fā)現(xiàn)馬鈴薯試管薯切片再生階段對(duì)其極為敏感，采用2mg/L的篩選壓力仍然較高，這與馬鈴薯生根階段10mg/L的篩選壓力以及塊莖作為外植體再生的篩選壓力相比有很大的差別[15]。如果降低篩選壓力，就會(huì)造成大量的芽再生，一方面增加篩選的難度，另一方面由于轉(zhuǎn)化苗具有代謝上的負(fù)擔(dān)，從而競爭不過非轉(zhuǎn)化苗，最終造成篩選失敗。

圖4 馬鈴薯轉(zhuǎn)基因株系PGLT的PCR檢測

圖5 馬鈴薯野生型和轉(zhuǎn)基因株系試管苗移栽與微型薯

潮霉素可以用作馬鈴薯遺傳轉(zhuǎn)化的篩選劑，但效率沒有卡那霉素作為篩選劑的高。馬鈴薯的多基因轉(zhuǎn)化中，潮霉素篩選體系的低效率使逐步轉(zhuǎn)化法難以實(shí)現(xiàn)。另一方面，由于馬鈴薯使用無性繁殖，并且馬鈴薯是四倍體，不能采用雜交的方法進(jìn)行多基因轉(zhuǎn)化。因此，在馬鈴薯的多基因遺傳轉(zhuǎn)化中，如果將多基因轉(zhuǎn)化載體改造為卡那霉素抗性，然后進(jìn)行多基因的組裝，可能會(huì)具有更高的轉(zhuǎn)化效率。

3.2多基因一次性轉(zhuǎn)化與葉綠體定位的雙重要求增加了蛋白有效表達(dá)的難度

在本研究中，通過多基因表達(dá)載體成功地在RNA水平表達(dá)了抗性篩選標(biāo)記基因和3個(gè)目標(biāo)基因。但是在馬鈴薯轉(zhuǎn)基因株系的蛋白檢測中，3個(gè)目標(biāo)基因均沒有檢測到蛋白水平的表達(dá)。經(jīng)過2代的種植，轉(zhuǎn)基因植株表型與野生型植株也沒有出現(xiàn)明顯表型差異。出現(xiàn)上述情況，可能有以下2方面的原因。

第一，在植物的葉綠體中構(gòu)建一個(gè)新的代謝步驟，基因表達(dá)量的不協(xié)調(diào)，會(huì)造成中間產(chǎn)物的積累，以致對(duì)葉綠體造成毒害。采用表達(dá)盒堆積法在植物中進(jìn)行多基因表達(dá)，表達(dá)的不協(xié)調(diào)將更加明顯，這與啟動(dòng)子的使用、表達(dá)盒的位置、表達(dá)盒的方向均有關(guān)系[16～18]。在Kebeish等[1]的研究中，通過逐步轉(zhuǎn)化以及利用雜交的方法轉(zhuǎn)入了5個(gè)基因。在本研究中，采用擬南芥的AtGDH將乙醇酸轉(zhuǎn)化為乙醛酸，而細(xì)菌的乙醇酸代謝途徑中的乙醇酸脫氫酶含有3個(gè)亞基，這樣做減少了需要轉(zhuǎn)入基因的數(shù)目，減輕了遺傳轉(zhuǎn)化的壓力。然而，如果AtGDH的表達(dá)量過高，而GCL和TSR基因表達(dá)量較低，可能會(huì)導(dǎo)致乙醛酸在葉綠體中積累。要解決上述問題，必須在啟動(dòng)子的使用、表達(dá)盒的位置方向安排上進(jìn)行調(diào)整，同時(shí)，也需要大量的轉(zhuǎn)化株系進(jìn)行篩選。

第二，目的基因的葉綠體定位異常。細(xì)胞核編碼的蛋白質(zhì)需要運(yùn)輸?shù)饺~綠體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、液泡等細(xì)胞器發(fā)揮作用，在蛋白質(zhì)的各級(jí)結(jié)構(gòu)中，有部分氨基酸用來編碼蛋白質(zhì)定位信號(hào)。質(zhì)體定位的蛋白質(zhì)出現(xiàn)定位信號(hào)肽是質(zhì)體進(jìn)化上的關(guān)鍵步驟[19]。定位信號(hào)肽的出現(xiàn)是一個(gè)漫長的進(jìn)化過程，物種之間、蛋白之間的定位信號(hào)肽會(huì)存在極大差異。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，由核編碼的質(zhì)體蛋白其N端的信號(hào)肽包含有其定位及切割的全部信息[20]。定位外源蛋白在研究中應(yīng)用的比較多的是馬鈴薯rbcs的小亞基葉綠體定位信號(hào)肽。此外，番茄、水稻，擬南芥的葉綠體定位信號(hào)肽也是比較常用的信號(hào)肽[21～23]。Lee等[20]對(duì)擬南芥的208種葉綠體定位信號(hào)肽序列進(jìn)行了聚類分析發(fā)現(xiàn)，這些定位序列可以分為多個(gè)序列亞群，對(duì)其中的7個(gè)序列亞群進(jìn)行實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，定位序列具有高度的特異性；蛋白的定位實(shí)驗(yàn)表明，每種蛋白包含了嚴(yán)格的葉綠體定位序列區(qū)。該研究認(rèn)為，信號(hào)肽是由多個(gè)包含了特異序列的序列亞群組成的。本研究中，使用水稻rbcS的葉綠體定位信號(hào)肽在馬鈴薯中定位3個(gè)目標(biāo)蛋白，目標(biāo)蛋白在RNA表達(dá)量極高的情況下沒有在蛋白水平檢測到表達(dá)，這可能是由于不同物種的不同蛋白對(duì)葉綠體定位信號(hào)肽具有特異性而造成的。

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2017-04-17

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31470343)；長江大學(xué)青年基金項(xiàng)目(2015cqn83)。

姚振(1980-)，男，博士，講師，研究方向?yàn)橹参飳W(xué)和植物生理學(xué)。通信作者: 彭新湘，xpeng@scau.edu.cn。

[引著格式]姚振,沈博然，彭新湘.LoxP-Cre重組技術(shù)在構(gòu)建馬鈴薯光呼吸代謝支路中的應(yīng)用[J].長江大學(xué)學(xué)報(bào)(自科版)，2017,14(18)：37～43.

Q945.19

A

1673-1409(2017)18-0037-07

[編輯] 李啟棟