張永輝++歐梁++鄺高艷++盧敏

摘要：目的 探討加味獨活寄生合劑促進膝骨關(guān)節(jié)炎（KOA）軟骨細胞增殖的臨床療效及其作用機制。方法 采用隨機數(shù)字表法將60例患者隨機分為治療組和對照組各30例。治療組予加味獨活寄生合劑，每次62.5 mL，每日2次，口服；硫酸氨基葡萄糖膠囊，每次1粒，每日3次，口服。對照組予雙醋瑞因膠囊，每次1粒，每日2次，口服；硫酸氨基葡萄糖膠囊，用法用量同治療組。囑患者行股四頭肌舒縮功能鍛煉，注意保暖。連續(xù)治療6周。觀察2組治療前后視覺模擬評分法（VAS）評分、西安大略和麥克馬斯特大學(xué)骨關(guān)節(jié)炎指數(shù)（WOMAC），檢測患膝關(guān)節(jié)液白細胞介素-1（IL-1）、一氧化氮（NO）、Wnt5a、β-連環(huán)蛋白（β-catenin）、Sox9、膠原蛋白Ⅱ（CollagenⅡ）含量，監(jiān)測不良反應(yīng)。結(jié)果 與本組治療前比較，2組治療后IL-1、NO、Wnt5a、β-catenin含量明顯降低（P<0.05），Sox9、CollagenⅡ含量明顯升高（P<0.05），VAS評分、WOMAC明顯降低（P<0.05），以上指標(biāo)2組治療后比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。2組均未見明顯不良反應(yīng)。結(jié)論 加味獨活寄生合劑可降低關(guān)節(jié)液中炎癥因子水平，抑制Wnt信號通路，通過調(diào)節(jié)通路中Sox9、CollagenⅡ表達促進KOA軟骨細胞的增殖分化，有效緩解疼痛并改善關(guān)節(jié)功能。

關(guān)鍵詞：加味獨活寄生合劑；膝骨關(guān)節(jié)炎；軟骨修復(fù)

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.01.007

中圖分類號：R274.94 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2018）01-0028-05

Clinic Efficacy and Action Mechanism of Promoting Repairment of Knee Osteoarthritiss Cartilage Corpuscle via Modified Duhuo Jisheng Mixture

ZHANG Yong-hui1， OU Liang1， KUANG Gao-yan1， LU Min2

1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410007， China；

2. The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410007， China

Abstract： Objective To discuss the clinic efficacy and its mechanism of action in promoting the cell proliferation of knee osteoarthritiss cartilage corpuscle via modified Duhuo Jisheng Mixture. Methods Totally 60 cases were divided into treatment group and control group by random number table method， with 30 cases in each group. Treatment group was given modified Duhuo Jisheng Mixture， 62.5 mL each time， twice a day， orally， and sulfoglycan sulfate capsules， 1 capsule a day， three times a day， orally； while control group was given diacerein capsules， 1 pill a day， twice a day， orally， and sulfoglycan sulfate capsules， the same as treatment group. Patients were required to do quadriceps muscle systolic and functional exercise， and keep warm. The treatment lasted for 6 weeks. VAS score and WOMAC of the two group were observed before and after treatment. IL-1， NO， Wnt5a， β-catenin， Sox9， Collagen Ⅱ in knee joint fluid were detected. Adverse reactions were monitored. Results Compared with pre-treatment， the contents of IL-1， NO， Wnt5a and β-catenin in two groups were reduces （P<0.05）； while the contents of Sox9 and Collagen Ⅱ were raised （P<0.05）. The VAS scores and WOMAC were reduced in two groups after treatment （P<0.05）. There was no statistical significance between the two group in the above indexes （P>0.05）. There were no obvious adverse reactions in both groups. Conclusion Modified Duhuo Jisheng Mixture can reduceendprint

基金項目：國家自然科學(xué)基金（81574004）；湖南省中醫(yī)藥管理局課題（201408）

通訊作者：盧敏，E-mail：lumin6563@163.com

inflammatory factors of the joint fluid and inhibit the Wnt signal pathway through regulating the expression of Sox9 and Collagen Ⅱ in the pathway， which can promote the cell proliferation of knee osteoarthritis's cartilage corpuscle and benefit the repairment of cartilage corpuscle in order to relieve pains and improve functions of knee joint.

Keywords： modified Duhuo Jisheng Mixture； knee osteoarthritis； repairment of cartilage corpuscle

膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是中老年常見疾患，隨著病情逐漸加重，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。近年來，中醫(yī)藥治療KOA取得了良好療效[1-3]，但發(fā)病機制尚不明確，缺乏特異性療法。目前基礎(chǔ)研究主要針對中醫(yī)藥對KOA中軟骨的細胞因子某一基因?qū)用娴母深A(yù)作用，多局限于補腎活血類或補腎類藥物對KOA的干預(yù)作用，尚未系統(tǒng)闡明補腎活血、祛痹止痛中藥治療KOA的作用靶點基因和調(diào)控通路。本研究采用自擬加味獨活寄生合劑，治療肝腎虧虛、風(fēng)寒濕痹型KOA，觀察其療效及對關(guān)節(jié)液內(nèi)Wnt信號通路相關(guān)蛋白含量的影響，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2016年10月-2017年3月湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨傷科門診患者60例，采用隨機數(shù)字表法分為治療組和對照組各30例。治療組男性8例，女性22例，平均年齡（59.2±3.5）歲，平均病程（3.6±1.8）年；對照組男性11例，女性19例；平均年齡（58.1±3.4）歲，平均病程（3.7±1.6）年。本研究無脫落、退出病例。2組患者年齡、性別、病程、視覺模擬評分法（VAS）評分及西安大略和麥克馬斯特大學(xué)骨關(guān)節(jié)炎指數(shù)（WOMAC）比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。本研究經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會審查批準(zhǔn)。

1.2 西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)

參照《骨關(guān)節(jié)炎診治指南（2007年版）》[4]制定診斷標(biāo)準(zhǔn)。①近1個月內(nèi)反復(fù)膝關(guān)節(jié)疼痛；②X線片示關(guān)節(jié)間隙變窄，軟骨下骨硬化和/或囊變，關(guān)節(jié)緣骨贅形成；③關(guān)節(jié)液透明、黏性，檢查示白細胞<2000個/mL；④年齡≥40歲；⑤晨僵時間≤30 min；⑥活動時感覺有骨摩擦音。具備上述①②或①③⑤⑥或①④⑤⑥即可明確診斷。

X線分級采用骨關(guān)節(jié)炎Kellgren-Lawrance分級標(biāo)準(zhǔn)[5]。0級：正常；Ⅰ級：輕微骨贅；Ⅱ級：明顯骨贅，關(guān)節(jié)間隙可疑變窄；Ⅲ級：關(guān)節(jié)間隙中度變窄，軟骨下骨硬化；Ⅳ級：大量骨贅，關(guān)節(jié)間隙明顯變窄，嚴(yán)重軟骨下骨硬化及明顯畸形。

1.3 中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn)

參照《中醫(yī)病證診斷療效標(biāo)準(zhǔn)》[6]風(fēng)寒濕痹、肝腎虧虛證進行辨證。主癥：關(guān)節(jié)酸痛或部分肌肉酸重麻木，遷延日久可致肢體拘急，甚則關(guān)節(jié)腫大。次癥及舌脈：肢體關(guān)節(jié)走竄疼痛，痛無定處，有時兼有寒熱，舌苔黃膩、脈??；遍身或局部關(guān)節(jié)疼痛，痛有定處，得熱稍緩，遇冷則劇，苔白，脈弦緊；關(guān)節(jié)酸痛、肌膚麻木、痛有定處，陰雨風(fēng)冷可使其發(fā)作，苔白膩，脈濡緩。脈沉細或沉弱無力。具備主癥，參照次癥及舌脈即可辨證。

1.4 納入標(biāo)準(zhǔn)

①性別不限，年齡50～65歲；②符合上述西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)及中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn)者；③X線分級為0～Ⅱ級者；④無嚴(yán)重心、肺及肝、腎功能障礙者；⑤近2個月內(nèi)未服用相關(guān)藥物或采用相應(yīng)治療方案者；⑥患者自愿參加本研究并簽署知情同意書，依從性良好者。

1.5 排除標(biāo)準(zhǔn)

①對本研究藥物過敏者；②X線分級為Ⅲ、Ⅳ級者；③慢性結(jié)腸炎、腹瀉、服用改善腸道轉(zhuǎn)運和/或腸道內(nèi)容物性質(zhì)的藥物、服用含有氫氧化鋁和/或氫氧化鎂的藥物者；④創(chuàng)傷性膝關(guān)節(jié)炎者；⑤有嚴(yán)重的心、肺及肝、腎功能障礙者；⑥近期擬懷孕、妊娠期及哺乳期患者。

1.6 治療方法

治療組予加味獨活寄生合劑。藥物組成：獨活6 g，桑寄生18 g，制天南星6 g，黃芩6 g，木瓜12 g，威靈仙12 g，杜仲12 g，牛膝6 g，細辛3 g，秦艽6 g，茯苓12 g，肉桂3 g，防風(fēng)6 g，川芎6 g，黨參12 g，甘草3 g，當(dāng)歸12 g，白芍10 g，熟地黃15 g。湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑，批號201601。每次62.5 mL，每日2次，口服；硫酸氨基葡萄糖膠囊（浙江海正藥業(yè)股份有限公司，批號7108197，0.314 g/粒），每次1粒，每日3次，口服。

對照組予雙醋瑞因膠囊（TRB Pharma S.A.，昆明積大制藥股份有限公司，批號69577，50 mg/粒），每次1粒，每日2次，口服；硫酸氨基葡萄糖膠囊，用法用量同上。

囑患者行股四頭肌舒縮功能鍛煉，注意保暖，勿進行加重膝關(guān)節(jié)負重的活動。均連續(xù)治療6周。

1.7 觀察指標(biāo)

1.7.1 視覺模擬評分法評分

于治療前后對2組患者行VAS評分[7]。在設(shè)定好的評分表上劃一條10 cm的線，橫線的一端為0，表示無痛，另一端為10，表示劇痛，患者根據(jù)疼痛感覺進行評分。endprint

1.7.2 西安大略和麥克馬斯特大學(xué)骨關(guān)節(jié)炎指數(shù)

參考文獻[8]于治療前后評價WOMAC，包括疼痛、僵硬和關(guān)節(jié)功能3個部分，共24個項目（包括疼痛5個、僵硬2個、關(guān)節(jié)功能17個）。WOMAC越高，表示關(guān)節(jié)炎越嚴(yán)重。<80分為輕度，80～120分為中度，>120分為重度。

1.7.3 患膝關(guān)節(jié)液相關(guān)指標(biāo)

2組于治療前后行關(guān)節(jié)腔穿刺抽取關(guān)節(jié)液?；颊哐雠P位，膝下墊枕，取髕骨外上方入路，定位準(zhǔn)確后碘伏消毒，抽取關(guān)節(jié)液1 mL，置于無菌管。ELISA檢測IL-1、NO、Wnt5a、β-catenin、Sox9、CollagenⅡ含量，嚴(yán)格按照試劑盒（DG biotech公司，批號分別為E-EL-H0149c、A013-2、E-EL-H1038c、E-EL-H0666c、E-EL-H1349c、E-EL-H0787c）說明進行操作。

1.7.4 不良反應(yīng)

觀察2組治療期間有無腹瀉、腹脹等不良反應(yīng)并記錄。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以

—x±s表示，組間比較采用t檢驗及非參數(shù)檢驗；計數(shù)資料組間比較采用卡方檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 視覺模擬評分法評分及西安大略和麥克馬斯特大學(xué)骨關(guān)節(jié)炎指數(shù)比較

與本組治療前比較，2組治療后VAS評分、WOMAC均明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；2組治療后VAS評分、WOMAC比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

2.2 2組患膝關(guān)節(jié)液白細胞介素-1、一氧化氮含量比較

與本組治療前比較，2組患膝關(guān)節(jié)液IL-1、NO含量明顯降低（P<0.05），2組治療后比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

2.3 2組患膝關(guān)節(jié)液Wnt5a、β-連環(huán)蛋白、Sox9、膠原蛋白Ⅱ含量比較

與本組治療前比較，2組治療后患膝關(guān)節(jié)液Wnt5a、β-catenin含量明顯降低（P<0.05）；2組治療后比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表3。與本組治療前比較，2組治療后Sox9、CollagenⅡ含量明顯升高（P<0.05）；2組治療后比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表4。

2.4 不良反應(yīng)

對照組輕度腹瀉2例；治療組輕度腹脹、消化不良1例。2組均無明顯不良反應(yīng)。

3 討論

KOA屬于中醫(yī)“痹證”范疇，稱之為“膝痹”。《素問·痹論篇》認為“風(fēng)寒濕三氣雜至，合而為痹”，“骨痹不已，復(fù)感于邪，內(nèi)舍于腎”。《張氏醫(yī)通》認為：“膝者筋之府，膝痛無不因肝腎虧虛者，虛則風(fēng)寒濕氣襲之?！敝嗅t(yī)對該病的病機認識以腎虛邪實為主，治以補虛瀉實。

本研究選用獨活寄生湯加黃芩、木瓜、威靈仙、制南星，制成加味獨活寄生合劑。本方重用善治久痹伏風(fēng)的獨活，加大桑寄生、杜仲、牛膝用量以補益肝腎；木瓜、威靈仙祛風(fēng)散寒除濕，二藥配伍剛?cè)嵯酀?，入腑通絡(luò)，善治濕邪久病入絡(luò)、病變位置較深者；制南星善入經(jīng)絡(luò)，辛溫散寒燥濕止痛，黃芩取反佐之意，苦寒清熱，制約全方溫燥之性。諸藥合用，共奏補益肝腎、祛風(fēng)除濕、散寒止痛之功。

IL-1、NO是關(guān)節(jié)液中炎癥因子，二者可引起關(guān)節(jié)液和滑膜的免疫炎癥反應(yīng)，NO是促細胞凋亡的重要因子，IL-1β可依賴內(nèi)源性NO誘導(dǎo)細胞凋亡，進一步促進關(guān)節(jié)軟骨的凋亡破壞，在KOA發(fā)病中具有重要作用。藥理研究表明，黃芪苷能夠明顯降低血清中IL-1含量，木瓜三萜可抑制RAW264.7細胞分泌IL-1等促炎因子而發(fā)揮抗炎作用，威靈仙水提取液可降低兔KOA局部IL-1β、TNF-α，大劑量制天南星可降低兔KOA關(guān)節(jié)液中IL-1含量，減輕滑膜炎癥[9-12]。鄺高艷等[13]認為，加味獨活寄生合劑可減少關(guān)節(jié)液中IL-1、IL-6、TNF-α及NO含量，抑制炎癥反應(yīng)，改善臨床癥狀，這可能是加味獨活寄生合劑治療KOA的作用機制。

雙醋瑞因膠囊是目前臨床治療KOA的陽性藥物，研究表明，應(yīng)用4～6周即能對膝關(guān)節(jié)的疼痛和臨床功能的改善取得良好效果，可降低IL-1含量，同時誘導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨的增殖分化。本研究表明，2組患者IL-1、NO及VAS評分、WOMAC在治療后均明顯降低，表明加味獨活寄生合劑可降低患膝關(guān)節(jié)液中炎癥因子含量，對KOA有良好的療效。2組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，也在一定程度上表明加味獨活寄生合劑與雙醋瑞因膠囊療效相當(dāng)。

KOA主要是由于關(guān)節(jié)軟骨退變磨損產(chǎn)生炎癥介質(zhì)刺激所致，是力學(xué)和生物學(xué)因素共同作用的結(jié)果。KOA的嚴(yán)重程度與軟骨細胞凋亡密切相關(guān)。現(xiàn)代研究表明，Wnt信號通路在骨骼發(fā)育、軟骨及骨生物學(xué)中起著關(guān)鍵作用，通過Wnt信號通路調(diào)節(jié)能夠促進軟骨細胞的增殖、分化，從而改善KOA的臨床癥狀。彭旭等[14]研究表明，Wnt3a/β-catenin信號阻斷后，CollagenⅡ、aggrecan、Sox9表達明顯恢復(fù)，細胞增殖能力和向軟骨誘導(dǎo)分化的能力有所恢復(fù)。Gurusinghe S等[15]提取8～12個月健康雄性犬的軟骨細胞進行隨機對照研究發(fā)現(xiàn)，Sox9組能恢復(fù)軟骨細胞表型的擴張，此外，軟骨細胞經(jīng)Sox9和CollagenⅡ作用后，其特異性表達明顯增強。卓群豪等[16]研究也表明，Sox9轉(zhuǎn)染小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞對小鼠膝關(guān)節(jié)炎病變軟骨修復(fù)有促進作用。以上研究表明，Wnt信號通路在調(diào)節(jié)軟骨細胞增殖方面具有一定作用，而Sox9和CollagenⅡ在軟骨細胞的增殖分化中具有重要作用。

近年來，中醫(yī)藥在治療KOA方面取得了較好的療效，但其是否通過Wnt信號通路調(diào)節(jié)尚不明確。2組在評價臨床效果的同時，重點檢測了Wnt信號通路相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白，尤其是Sox9基因蛋白和CollagenⅡ，以觀察加味獨活寄生合劑是否能夠通過調(diào)節(jié)該信號通路來促進軟骨細胞增殖修復(fù)。Wnt信號通路中Wnt5a、β-catenin蛋白較治療前明顯降低，Sox9和CollagenⅡ較治療前明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。這說明應(yīng)用加味獨活寄生合劑后Wnt信號通路被抑制，尤其是其關(guān)鍵蛋白β-catenin含量降低。有研究指出，β?catenin能與Sox9的C端轉(zhuǎn)錄激活域結(jié)合，從而抑制Sox9啟動目的基因的轉(zhuǎn)錄[17]，而β-catenin含量降低，相應(yīng)能夠促使Sox9蛋白分泌增多，利于CollagenⅡ蛋白產(chǎn)生，誘導(dǎo)軟骨細胞的增殖和向軟骨組織分化，從而修復(fù)KOA磨損的軟骨組織。endprint

總之，本研究中加味獨活寄生合劑能降低關(guān)節(jié)液中的炎癥因子含量，且通過調(diào)節(jié)Wnt信號通路促進KOA軟骨細胞增殖，起到保護關(guān)節(jié)軟骨的作用。但本研究樣本量較小，觀察時間有限，仍有待進一步深入研究。

參考文獻：

[1] 時晶，簡文佳，魏明清，等.王永炎活血、化瘀、通絡(luò)三步法[J].中醫(yī)雜志，2014，55（23）：1993-1995.

[2] 唐萌芽，翁祝承，邵利芳.中藥治療膝骨關(guān)節(jié)炎臨床療效和安全性的系統(tǒng)評價[J].中醫(yī)正骨，2014，26（1）：43-48.

[3] 譚開云，盧敏.加味獨活寄生合劑治療風(fēng)寒濕痹、肝腎虧虛型膝骨關(guān)節(jié)炎臨床療效觀察[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2016，34（2）：425-427.

[4] 中華醫(yī)學(xué)會骨科學(xué)分會.骨關(guān)節(jié)炎診治指南（2007年版）[J].中華骨科雜志，2007，27（10）：793-796.

[5] KELLGREN J H， LAWRENCE J S. Radiological assessment of osteo- arthrosis[J]. Ann Rheum Dis，1957，16（4）：494-502.

[6] 國家中醫(yī)藥管理局.中醫(yī)病證診斷療效標(biāo)準(zhǔn)[M].南京：南京大學(xué)出版社，1994：30.

[7] SVENSSON I， SJ?STR?M B， HALJAM?E H. Assessment of pain experiences after elective surgery[J]. J Pain Symptom Manage， 2000，20（3）：193-201.

[8] BELLAMY N， BUCHANAN W W， GOLDSMITH C H， et al. Validation study of WOMAC：a health status instrument for measuring clinically important patient relevant outcomes to antirheumatic drug therapy in patients with osteoarthritis of the hip or knee[J]. J Rheumatol，1988，15（12）：1833-1840.

[9] 高金靈，李振英，劉瑋，等.黃芩苷對佐劑性關(guān)節(jié)炎血清中IL-1、IL-17、TGF-β表達的影響[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2016，39（2）：63-64.

[10] 石孟瓊，覃慧林，張永峰，等.木瓜三萜對脂多糖誘導(dǎo)下RAW264.7細胞炎癥模型細胞因子的影響[J].中藥藥理與臨床，2016，32（3）：76-80.

[11] 周效思，周凱，封芬，等.威靈仙對兔膝骨關(guān)節(jié)炎IL-1β、TNF-α、PGE2的影響[J].時珍國醫(yī)國藥，2011，22（5）：1143-1144.

[12] 劉艷平，李曉成，李引剛.制天南星對兔膝骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)液IL-1和關(guān)節(jié)滑膜的影響[J].河南中醫(yī)，2013，33（8）：1253-1255.

[13] 鄺高艷，嚴(yán)可，柴爽，等，加味獨活寄生合劑治療膝骨關(guān)節(jié)炎臨床療效及對關(guān)節(jié)液中IL-1，IL-6，TNF-α及NO的影響[J].中國實驗方劑學(xué)雜志， 2017，23（1）：174-178.

[14] 彭旭，陳光興，楊柳，等.Wnt3a/β-catenin信號通路誘導(dǎo)人關(guān)節(jié)軟骨間充質(zhì)祖細胞增殖能力和向軟骨分化的能力[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報， 2013，35（6）：477-481.

[15] GURUSINGHE S， YOUNG P， MICHELSEN J， et al. Suppression of dedifferentiation and hypertrophy in canine chondrocytes through lentiviral vector expression of Sox9 and induced pluripotency stem cell factors[J]. Biotechnol Lett，2015，37（7）：1495-1504.

[16] 卓群豪，張偉娜，李艦，等.膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射Sox9轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細胞修復(fù)膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎[J].中國組織工程研究，2017，38（5）：736-741.

[17] AKIYAMA H， LYONS J P， MORI-AKIYAMA Y， et al. Interactions between Sox9 and beta-catenin control chondrocyte differentiation[J]. Genes Dev，2004，18（9）：1072-1087.

（收稿日期：2017-05-18）

（修回日期：2017-06-05；編輯：季巍?。〆ndprint