王尹民 王秀俠 劉菲 楊軍

同種異體復合組織移植（Vascularized composite allograft transplantation，VCA），是指包括皮膚、肌肉、骨骼等帶血供的復合組織在同種異體間的移植。已有許多臨床應用同種異體復合組織移植，如面部移植、肢體移植及腹壁移植的報道，為創(chuàng)傷后外觀及功能恢復提供了新的可能[1]。而與實體器官的同種異體移植類似，VCA同樣面臨著免疫排斥造成的抑制物壞死和功能障礙等問題，因而免疫抑制劑的維持治療對于VCA是不可避免的[2]。接受異體復合組織移植的患者需終身服用免疫抑制劑，否則移植后短期內會面臨急性免疫排斥反應，長期將面臨慢性免疫排斥反應，從而導致移植物失去功能，并最終導致移植失敗。然而，免疫抑制劑的長期使用造成的機會感染、繼發(fā)腫瘤、影響代謝等副作用，是目前臨床應用中無法避免的問題。

因此，VCA術后如何減少免疫抑制劑的用量，從而減輕或避免免疫抑制劑所帶來的副作用，是臨床一直積極探索的問題。目前，聯(lián)合免疫抑制劑的細胞治療被認為能一定程度上減少長期免疫抑制劑的使用，并能同時維持移植物的存活和功能。

細胞治療種類包括干細胞治療和免疫細胞治療，其中間質干細胞作為干細胞治療的一種，多用于自身免疫性疾病以及炎癥性疾病的治療。相較胚胎干細胞等其他干細胞類型，間質干細胞涉及的倫理爭議更少，因而被用于臨床細胞治療的可行性更高；此外，由于間質干細胞具有向內胚層及外胚層組織分化的潛能，因此在修復重建過程中具有重要作用[3]。目前，間質干細胞已被用于幫助緩解造血干細胞移植后移植物抗宿主病以及治療炎癥性腸病、風濕性關節(jié)炎等免疫性疾病[4-6]，也有大量的臨床前研究在探討其抑制性免疫調節(jié)作用和相關機制[7]。在同種異體復合組織移植方面，間質干細胞治療的作用主要集中于抑制免疫排斥反應，以及減輕缺血再灌注損傷等方面。而脂肪干細胞近年來備受關注，其來源廣泛且具有免疫調節(jié)作用，有望用于改善VCA術后移植物的存活[8]。體外實驗發(fā)現，脂肪干細胞具有與骨髓間質干細胞相當的免疫抑制作用。Puissant等[9]的研究中顯示，脂肪干細胞不引起異體淋巴細胞增殖、抑制混合淋巴細胞反應，因而脂肪干細胞有可能替代較難獲取的骨髓間質干細胞，成為發(fā)揮抑制免疫排斥反應的重要細胞來源，從而用于同種異體復合組織移植后的治療。

1 脂肪干細胞及其在同種異體復合組織移植中的作用

脂肪干細胞來自于脂肪組織經消化離心沉淀所得的基質血管成分（Stromal Vascular Fraction，SVF），體外培養(yǎng)時呈成纖維細胞樣形態(tài)[10]。McIntosh等[11]的研究發(fā)現，其表達HLA-DR抗原量較原代細胞下降，不易引起異體免疫排斥反應，為體外擴增的異體脂肪干細胞用于細胞治療提供了重要前提。此外，在大鼠及豬的后肢移植模型中，多次應用脂肪干細胞治療組相比對照組，移植物存活時間延長。體內及體外實驗中，脂肪干細胞表現出與骨髓間質干細胞相當的抑制免疫排斥反應的能力[8，12]。已發(fā)現的相關作用機制包括：通過旁分泌細胞因子抑制免疫排斥反應、誘導調節(jié)性T細胞產生、通過形成嵌合體誘導免疫耐受以及通過改善移植物缺血再灌注損傷從而改善移植后功能恢復等。

1.1 通過旁分泌細胞因子抑制免疫排斥反應

Lee等[13]發(fā)現，在全厚皮移植的小鼠模型中，無論是給予脂肪干細胞或是脂肪細胞條件培養(yǎng)液，都能延長移植物存活時間，同時使得外周血炎癥因子IL-6及TNF-a含量下降，且實驗組體外分離所得的T細胞對異體抗原的反應性下降，說明脂肪干細胞可通過旁分泌途徑減輕移植后免疫排斥反應。此外，體外實驗證實，人脂肪干細胞能分泌前列腺素2（PGE2）、轉化生長因子β（TGF-β）等抑制性免疫調節(jié)細胞因子，并能夠抑制體外混合淋巴細胞的增殖反應，被認為具有抑制免疫排斥反應的能力[8，14]。有研究表明，脂肪干細胞在炎癥因子作用下吲哚胺2，3-二氧化酶（IDO）表達升高，在同混合淋巴細胞共培養(yǎng)條件下環(huán)氧合酶COX-2（參與合成PGE-2）表達升高，而這些分子正參與抑制性免疫調節(jié)作用[15]。以上研究結果為體內實驗中脂肪干細胞能減少移植后炎癥因子表達并減輕炎癥反應提供了解釋，提示脂肪干細胞受體內環(huán)境中炎癥因子的刺激，IDO及COX-2等免疫調節(jié)分子表達升高，從而分泌抑制性免疫調節(jié)分子減輕移植免疫排斥反應。

1.2 誘導調節(jié)性T細胞產生

體內及體外實驗發(fā)現，調節(jié)性T細胞（Regulatory T cell，Treg）可以抑制移植物免疫排斥反應的發(fā)生。Bozulic等[16]的動物實驗表明，免疫耐受的移植物中存在大量Treg浸潤，而在發(fā)生排斥反應的移植物中并沒有發(fā)現明顯的Treg浸潤；且在體外實驗中證實Treg具有抑制淋巴細胞增殖反應的作用，同時Treg能夠分泌抑制性免疫調節(jié)因子IL-10[17]。因而，在同種異體移植中誘導Treg產生，或外源性引入Treg，被認為是有效的抑制免疫排斥反應發(fā)生的手段。而脂肪干細胞在移植中的免疫抑制作用被認為與Treg產生并在移植物中累積相關。在動物實驗中，經輸注脂肪干細胞的實驗組相較對照組，外周血中的Treg水平更高，且較單獨使用免疫抑制劑更易達到免疫耐受狀態(tài)[18]。Song等[19]的體外實驗證實，經脂肪干細胞共培養(yǎng)處理的外周血單個核細胞中Treg比例上調，表明脂肪干細胞可誘導T細胞表達Treg特異性轉錄調節(jié)分子Foxp3，從而促進Treg產生，為體內實驗中脂肪干細胞促進Treg產生從而誘導移植物免疫耐受提供了依據。脂肪干細胞可能通過旁分泌機制誘導Treg的產生，但具體何種旁分泌因子發(fā)揮作用有待進一步研究。

1.3 通過誘導嵌合體形成促進免疫耐受

在同種異體移植中，嵌合體包括完全嵌合和混合嵌合，其中混合嵌合是指供體和受體的細胞在受體共存且彼此耐受。Leto等[20]的研究發(fā)現，在移植骨髓細胞后可被檢測到的混合嵌合體存在時，受體免疫細胞對供體抗原刺激無反應，即暫時達到免疫耐受狀態(tài)。該結果提示，誘導嵌合體產生及維持是引導免疫耐受形成的重要手段，而誘導嵌合的方式主要為聯(lián)合免疫抑制劑的供體骨髓細胞移植[21]。Mathes等[22]的研究表明，通過在胎兒期輸注供體骨髓細胞誘導嵌合體產生，可引導長期供體特異的免疫耐受產生。在動物實驗中，脂肪干細胞及少量骨髓間充干細胞的聯(lián)合應用，延長了移植物存活時間，維持了一定時間內穩(wěn)定的淋巴細胞嵌合狀態(tài)，其中嵌合狀態(tài)的維持被認為與移植物存活延長密切相關[23]。因此，我們推測促進嵌合狀態(tài)的產生及維持也可能是脂肪干細胞能誘導免疫耐受的重要原因之一，但其機制有待進一步研究。

1.4 通過改善缺血再灌注損傷促進移植物功能恢復

與實體器官移植類似，獲取移植物及移植過程涉及移植物缺血再灌注損傷這一病理過程。在VCA缺血再灌注損傷中，皮膚、肌肉及神經系統(tǒng)均有累及，其中神經系統(tǒng)損傷在缺血早期較為明顯。隨缺血時間延長肌肉損傷加重，甚至會導致移植后室筋膜綜合癥的發(fā)生。其病理生理過程涉及氧化應激損傷及再灌注損傷導致的炎癥反應。在移植免疫這一特定條件下，由于炎癥反應導致的固有免疫及適應性免疫系統(tǒng)的激活，將使得急慢性免疫排斥反應更易發(fā)生[24]。而急慢性免疫排斥反應的發(fā)生將阻礙術后移植物功能恢復，甚至導致術后移植物壞死。Wang等[25]的研究表明，脂肪干細胞上清能減輕再灌注引起的微循環(huán)改變，包括改善血管痙攣及小動脈血流停滯等。Shih等[26]的實驗顯示，脂肪干細胞灌注改善了腎臟缺血再灌注模型的細胞凋亡，且發(fā)揮抗氧化應激的作用。我們推測，在同樣具有缺血再灌注損傷的同種異體復合組織移植過程中，脂肪干細胞或其條件培養(yǎng)基能夠改善缺血再灌注損傷造成的微循環(huán)障礙及細胞損傷，也同樣是其能夠延長移植物存活時間及促進移植術后功能恢復的原因之一。

2 脂肪干細胞臨床應用于VCA術后的可能性

間質干細胞在實體器官移植中已被用于臨床試驗，而這也引發(fā)了關于臨床使用的時機、干細胞來源與擴增方式及與免疫抑制劑的相互作用等實際應用的相關問題的討論[27]。以往臨床試驗中，骨髓間質干細胞（多采用體外擴增培養(yǎng)的第3或 4 代細胞，1～2×106cells/Kg，20 min 內靜脈推注）作為誘導治療方法之一，聯(lián)合抗IL-2抗體和鈣調磷酸酶抑制劑有效減少了急性免疫排斥反應的發(fā)生，并可改善術后1年的腎功能[28]；同時，骨髓間質干細胞能有效減少病理水平的小管炎、間質纖維化和小管萎縮[29]。由于脂肪干細胞與骨髓間質干細胞具有相當的免疫調節(jié)功能，因此也被研究用于VCA的臨床治療，但仍然面臨著細胞治療使用頻數、劑量及安全性等問題。大鼠后肢移植模型的結果提示，術后多次使用脂肪干細胞治療移植物，其存活情況優(yōu)于單次或不使用干細胞的對照組，且在動物實驗中脂肪干細胞治療無明顯不良反應[30]。

此外，免疫抑制藥物與脂肪干細胞的相互作用也影響脂肪干細胞在體內的作用，而這一點也與脂肪干細胞使用時機相關。Hoogduijn等[31]已經證實，在體外高劑量免疫抑制劑可誘導間質干細胞凋亡，但用小劑量他克莫司預處理的間質干細胞在體外實驗中對混合淋巴細胞反應有更好的抑制效果，而雷帕霉素則沒有這一效果，因而免疫抑制劑對間質干細胞的影響可能是雙向的。也有研究表明，在體外脂肪干細胞的活性及增殖能力相較骨髓間質干細胞更易受他克莫司及抗淋巴細胞血清等免疫抑制劑的影響，因而在將來可能的脂肪干細胞臨床應用中更需加強免疫抑制劑種類的選擇[32]。脂肪干細胞的臨床效果需要在進一步的臨床前實驗（如大動物模型）中證實，合理選擇細胞用量、使用時機、聯(lián)合使用的免疫抑制劑是研究中需要謹慎考慮的問題。

不同于實體器官移植，VCA由于包含了皮膚、肌肉、骨骼等多種組織，其急性免疫排斥反應發(fā)生率更高，其中原因包括皮膚的特殊免疫原性和VCA患者相較實體器官移植患者基礎免疫防御功能更強[33]。脂肪干細胞治療在現階段體內實驗中有助于提高移植物存活時間、誘導移植物免疫耐受、減少免疫排斥反應的發(fā)生，在體外能抑制淋巴細胞增殖反應。而在發(fā)生急性免疫排斥反應時，脂肪干細胞是否具有抑制免疫排斥反應的效果還有待進一步體內實驗證實。其他細胞治療普遍存在的安全問題，如致瘤性、細胞異位遷徙分化以及細胞體外擴增可能造成的污染等也有待排除。此外，脂肪干細胞真正用于治療時的經濟效益也需審慎考量。

3 結論與展望

Lalande等[34]在研究中引入了對細胞功能表現幾乎無影響的細胞體內示蹤技術，通過磁性納米微粒標記特定用于組織修復重建的細胞群，并通過磁共振成像技術體外動態(tài)監(jiān)測細胞在體內的分布可持續(xù)4周以上。類似的示蹤技術，其標記的細胞被磁性微粒標記后可受磁場作用，在體外支架上重新分布再定位并能被監(jiān)測[35]。這些技術有望被用于脂肪干細胞治療的進一步研究中，觀察如何通過細胞趨化等作用使得細胞在特定組織器官發(fā)揮作用，從而改善單純靜脈輸注細胞治療的針對性不足的問題，減少不必要的損耗。

脂肪干細胞由于具有與骨髓間充質干細胞相當的免疫調節(jié)能力，以及改善移植過程中組織損傷的功能，且來源廣泛，具有一定的體外擴增能力，可能被用于同種異體復合組織移植的治療，從而減少長期免疫抑制劑的用量，但這仍需臨床應用前進一步的評估及安全考量。新近的細胞追蹤技術為脂肪干細胞體內應用后的分布定位和功能狀態(tài)觀察提供了依據，或可應用于脂肪干細胞的細胞治療作用及安全性的評估，相信將有利于細胞治療在臨床的進一步開展。