朱漫漫 余玉明 劉艷君

(南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室,廣州 510515)

正常情況下，機(jī)體識(shí)別自身組織成分不對(duì)其產(chǎn)生免疫應(yīng)答，或僅產(chǎn)生輕微的免疫應(yīng)答，此為免疫耐受。在某些異常情況下(如病毒感染、體細(xì)胞基因突變)，自身耐受遭到破壞，導(dǎo)致機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)自身抗原產(chǎn)生免疫應(yīng)答，誘生自身抗體和(或)自身致敏淋巴細(xì)胞，此即自身免疫。若自身免疫應(yīng)答過(guò)強(qiáng)或持續(xù)時(shí)間過(guò)久，以致對(duì)表達(dá)自身靶抗原的細(xì)胞和組織發(fā)動(dòng)攻擊，導(dǎo)致?lián)p傷或功能障礙并出現(xiàn)相應(yīng)臨床癥狀時(shí)，就稱為自身免疫病。到目前為止，自身免疫病已成為第三大引起人類死亡的主要疾病[1]。自身免疫病的傳統(tǒng)治療方案主要是免疫抑制療法，其雖有利于緩解免疫細(xì)胞對(duì)自身組織的損傷，但仍存在著較多的副作用(如機(jī)會(huì)致病菌的感染以及惡性腫瘤等)，更重要的是對(duì)于大多數(shù)患者而言，它的臨床治療效果并不顯著[2,3]。因此，在最近的幾十年，越來(lái)越多的研究者將目光轉(zhuǎn)向于針對(duì)自身抗原、過(guò)敏原特異性的免疫耐受誘導(dǎo)方案，而ECDI修飾的同基因型脾細(xì)胞偶聯(lián)抗原(Ag-SPs)誘導(dǎo)的免疫耐受是近幾年出現(xiàn)的極具前景的誘導(dǎo)耐受方案。

1 自身免疫病的傳統(tǒng)治療方案

1.1免疫抑制療法

1.1.1非特異性免疫抑制療法 主要是指廣譜的免疫抑制劑，曾是治療自身免疫病最主要的方法。非特異性免疫抑制劑通過(guò)刪除或滅活全部的T/B淋巴細(xì)胞亞群，選擇性地抑制抗原的遞呈、促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生以及淋巴細(xì)胞的遷移，從而從整體上控制了自身淋巴細(xì)胞對(duì)自身抗原的免疫應(yīng)答[4,5]。但其非特異性抑制作用可導(dǎo)致機(jī)體免疫功能低下，從而使機(jī)會(huì)致病菌感染的風(fēng)險(xiǎn)增加。另外，非特異性免疫抑制劑對(duì)機(jī)體具有潛在的毒性作用[6]。

1.1.2特異性免疫抑制療法 (1)特異性抑制T細(xì)胞療法：現(xiàn)普遍認(rèn)為絕大多數(shù)自身免疫病是由于免疫耐受遭到破壞，免疫調(diào)節(jié)能力和抗原自身反應(yīng)之間失衡，導(dǎo)致自身的T淋巴細(xì)胞，尤其是CD4+T細(xì)胞對(duì)自身抗原發(fā)生免疫應(yīng)答，從而破壞自身正常組織結(jié)構(gòu)并引起相應(yīng)臨床癥狀[7]。因此特異性地阻斷自身反應(yīng)性T細(xì)胞的應(yīng)答，被認(rèn)為是最有希望誘導(dǎo)抗原特異性耐受的方法。傳統(tǒng)的特異性抑制T細(xì)胞療法包括：溶解性肽療法、變構(gòu)肽、共刺激阻斷、CD3抗體等[1,8]，然而這些方法大部分不能成功，或者只對(duì)部分患者有效。(2)特異性抑制B細(xì)胞療法：在非肥胖型糖尿病(Non-obese diabetic ，NOD)動(dòng)物模型以及人類Ⅰ型糖尿病(T1D)的發(fā)病機(jī)理中，B細(xì)胞最開(kāi)始并不被認(rèn)為是一個(gè)關(guān)鍵的致病因素[9]。直到有研究者在NOD小鼠中發(fā)現(xiàn)它的消融作用(Ablation)以及對(duì)自身抗原的遞呈作用而最終被證實(shí)[10,11]。后來(lái)，Luan等[12]將NOD小鼠血清中帶有致病性的自身抗體收集純化后作為抗原免疫BALB/c小鼠，再將免疫后產(chǎn)生的抗體注射到NOD小鼠體內(nèi)，他們發(fā)現(xiàn)這種抗體可殺傷與自身抗體分泌、遞呈相關(guān)的B細(xì)胞系，從而減輕胰島炎癥狀，最終延緩NOD小鼠糖尿病的發(fā)生[12]。

1.2替代療法 有些自身免疫介導(dǎo)的損傷具有器官特異性，如T1D是由于自身反應(yīng)性免疫細(xì)胞集聚并選擇性地破壞胰腺β細(xì)胞[13]，因此這些自身免疫病可通過(guò)修復(fù)或替代損害的細(xì)胞或組織進(jìn)行治療，這種治療方法就稱為替代療法。替代療法，尤其是激素替代療法，對(duì)早期某些自身免疫病(如T1D、甲狀腺炎等)具有顯著的療效[1]。以T1D為例，其傳統(tǒng)的治療方案主要以胰島素替代治療為主。但這種治療方法需要反復(fù)皮下注射，并且會(huì)出現(xiàn)酮癥酸中毒、低血糖反應(yīng)以及多器官衰竭等嚴(yán)重并發(fā)癥[11]。

1.3其他 (1)抗原肽的直接遞呈：最早在1920年Sulzberger[14]就提出并證實(shí)：以靜脈注射的方式將抗原肽直接傳遞給宿主，能夠在宿主體內(nèi)誘導(dǎo)出抗原特異性的T細(xì)胞無(wú)能。后來(lái)Chiller等[15]同樣證實(shí)溶解性抗原蛋白的直接呈遞可有效地誘導(dǎo)宿主外周T細(xì)胞耐受[3]。然而，致命性致敏的發(fā)生限制了其實(shí)際的臨床應(yīng)用[16]。(2)造血干細(xì)胞移植：是重建正常造血和免疫功能的一種有效手段，主要用于治療多種血液系統(tǒng)相關(guān)疾病[17]。近年來(lái)有研究者將其用于復(fù)發(fā)-緩解型多發(fā)性硬化癥(RRMS)的治療，但臨床研究表明：自體造血干細(xì)胞移植(aHSCT)效果并不顯著，并且難以獲得足夠數(shù)量的、穩(wěn)定的、特異性的干細(xì)胞[8]。

2 ECDI在自身免疫病中的應(yīng)用

ECDI即1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺[1-ethyl-3-(3′-dimethylaminopropyl)-carbodiimide]，是一種易潮濕、水溶性的化學(xué)藥物，含有N=C=N官能團(tuán)，其首先與肽鏈上游離的羧基反應(yīng)形成活化酯中間體，再與游離的氨基反應(yīng)，能夠加速羧基與氨基之間酰胺鍵的形成，從而廣泛應(yīng)用于偶聯(lián)反應(yīng)和肽的合成[18]。1966年時(shí)Johnson等[19]在間接血凝實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)：ECDI可以將牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)到兔紅細(xì)胞上。后來(lái)Wetzig等[20]在其研究中進(jìn)一步證實(shí)：ECDI作為一種有效的偶聯(lián)劑可穩(wěn)定地將卵清蛋白(OVA)與小鼠脾細(xì)胞偶聯(lián)?；谇叭说难芯?，最近有研究者將ECDI應(yīng)用于自身免疫病和器官移植模型中，并證實(shí)了ECDI修飾的同基因型脾細(xì)胞偶聯(lián)抗原(Ag-SPs)或ECDI修飾的同種異體/異種脾細(xì)胞(ECDI-SPs)，可以成功地在宿主體內(nèi)誘導(dǎo)出抗原特異性的免疫耐受，在預(yù)防和治療Th1/17介導(dǎo)的自身免疫病[8]、Th2介導(dǎo)的過(guò)敏性疾病[21]，同種/異種細(xì)胞移植[22,23]以及同種器官移植中[24]，Ag-SPs/ECDI-SPs所誘導(dǎo)的免疫耐受均取得了顯著療效，并且這種誘導(dǎo)耐受方案目前已在多發(fā)性硬化癥(MS)患者上進(jìn)行臨床Ⅰ/ⅡA期試驗(yàn)[25]。本文對(duì)ECDI在三種常見(jiàn)自身免疫病中的應(yīng)用進(jìn)行綜述。

2.1多發(fā)性硬化癥 多發(fā)性硬化癥(Multiple sclerosis，MS)是一種以中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性脫髓鞘為特點(diǎn)、由CD4+T細(xì)胞對(duì)髓鞘抗原自身應(yīng)答所介導(dǎo)的自身免疫病[26]。

實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)是人類MS應(yīng)用最廣泛，同時(shí)也是最經(jīng)典的動(dòng)物模型，因此常將小鼠的EAE模型用于人類MS的發(fā)病機(jī)理研究、治療以及預(yù)防等。Smith等[27]在其實(shí)驗(yàn)中選用了4種致腦炎性髓鞘抗原肽(PLP139-151、PLP178-191、MBP84-104和MOG92-106)免疫SJL小鼠制備EAE動(dòng)物模型。他應(yīng)用ECDI將這4種抗原肽分別或者混合與小鼠的脾細(xì)胞偶聯(lián)(Ag-SPs)，預(yù)先7 d將Ag-SPs靜脈注射到小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是在單個(gè)還是混合髓鞘肽免疫的EAE模型中，Ag-SPs都能有效預(yù)防臨床EAE的發(fā)生。研究者認(rèn)為Ag-SPs主要通過(guò)抑制外周特異性T細(xì)胞的記憶應(yīng)答，降低促炎性細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ的水平以及炎性細(xì)胞對(duì)脊髓的浸潤(rùn)等機(jī)制，極大降低了腦脊髓炎的發(fā)病率。接下來(lái)研究者在用PLP139-151或PLP178-191免疫的復(fù)發(fā)型EAE(R-EAE)模型中，用同樣的處理方法，發(fā)現(xiàn)Ag-SPs仍然能夠明顯改善EAE的復(fù)發(fā)[28]。因此研究者認(rèn)為，在EAE動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭校鄬?duì)于傳統(tǒng)治療方法而言，Ag-SPs是一種更有效預(yù)防EAE發(fā)生、改善R-EAE復(fù)發(fā)的誘導(dǎo)耐受方法。其他研究者Turley等[29]也發(fā)現(xiàn)了同樣的現(xiàn)象。在單用PLP139-151制備的EAE模型中，他們應(yīng)用上述的處理方法觀察到，Ag-SPs能夠特異性抑制致病性T細(xì)胞的應(yīng)答，預(yù)防EAE的發(fā)生。

2.2Ⅰ型糖尿病 Ⅰ型糖尿病(Type 1 diabetes，T1D)是由自身反應(yīng)性CD4+和CD8+T細(xì)胞集聚并選擇性地破壞胰腺β細(xì)胞所導(dǎo)致的一種慢性免疫性疾病[11]。在T1D動(dòng)物模型制備中，NOD小鼠是最常用的一種小鼠品系[30]。

Prasad等[13]在NOD小鼠模型中，選用了多種T1D自身抗原：胰島素(Ins B9-23、Ins B15-23)，IGRP(IGRP205-214)和GAD65(GAD65509-524、GAD65524-543)，應(yīng)用ECDI將這些自身抗原偶聯(lián)到小鼠SPs上，在幼齡小鼠未發(fā)病前(4～5周)靜脈注射到小鼠體內(nèi)，繼而觀察其發(fā)病情況。他們發(fā)現(xiàn)，Ins-SPs，尤其是Ins B9-23-SPs能夠明顯降低T1D的發(fā)生率，抑制IFN-γ的分泌，減少免疫細(xì)胞對(duì)胰腺胰島細(xì)胞的浸潤(rùn)，從而對(duì)年幼的小鼠起到保護(hù)作用。

為了更好地研究Ag-SPs對(duì)人類T1D的治療療效，Niens等[31]人引用了一種人源化T1D小鼠-NOD.β2mnull.HHD。他們用ECDI將小鼠SPs與多肽混合物偶聯(lián)(INS+IGRP)或與單個(gè)抗原(INS/IGRP)偶聯(lián)，仍然在小鼠未發(fā)病(4～6周)時(shí)給予靜脈處理。他們發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，INS/IGRP-SPs能明顯降低糖尿病的發(fā)病率，并進(jìn)一步明確主要是IGRP-SPs在其中發(fā)揮了關(guān)鍵的保護(hù)作用。IGRP-SPs通過(guò)降低CD8+T細(xì)胞對(duì)IGRP特異性的應(yīng)答，抑制IFN-α的分泌等機(jī)制抑制了糖尿病的發(fā)生發(fā)展[32]。這些結(jié)果均表明，無(wú)論在NOD小鼠，還是在人源化NOD.β2mnull.HHD 模型中，Ag-SPs都能特異性誘導(dǎo)出有效的、穩(wěn)定的自身免疫耐受，從而保護(hù)幼鼠，避免T1D的發(fā)生[32]。

2.3過(guò)敏性疾病 過(guò)敏性哮喘是由嗜酸性粒細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞參與的慢性氣道炎癥性疾病，而食物過(guò)敏是由肥大細(xì)胞介導(dǎo)的消化系統(tǒng)內(nèi)或全身性的免疫反應(yīng)性疾病[33]，它們都屬于由Th2型細(xì)胞介導(dǎo)的免疫性疾病。

Smarr等[21]在其實(shí)驗(yàn)體系中用了兩個(gè)過(guò)敏癥模型：卵清蛋白(OVA)誘導(dǎo)的過(guò)敏性氣道炎癥模型以及花生提取物(WPE)誘導(dǎo)的食物過(guò)敏模型。在過(guò)敏性氣道炎癥模型中，他們觀察了OVA-SPs對(duì)局部炎癥的控制情況，在第28天連續(xù)3 d給予霧化OVA吸入后，對(duì)支氣管肺泡灌洗液分析發(fā)現(xiàn)，OVA-SPs處理的小鼠肺部嗜酸性粒細(xì)胞的數(shù)量明顯下降，并且Th2細(xì)胞分泌IL-4、IL-5的水平也明顯降低。不僅如此，全身性的過(guò)敏反應(yīng)在OVA-SPs處理小鼠中也得到了有效抑制，血液中的嗜酸性粒細(xì)胞的數(shù)量以及血清OVA特異性抗體IgE的水平均明顯降低。同樣，在食物過(guò)敏模型中，預(yù)先給予WPE-SPs處理的小鼠，即使口服WPE后，仍能有效控制過(guò)敏癥狀，防止體溫的驟降以及減少小鼠肥大細(xì)胞蛋白酶-1(mMCP-1)的釋放，從而預(yù)防了全身性過(guò)敏反應(yīng)的發(fā)生[19]。

綜上所述，Ag-SPs誘導(dǎo)的特異性的自身免疫耐受不僅能有效預(yù)防、治療由Th1/17介導(dǎo)的自身免疫病(如EAE、T1D)，對(duì)由Th2型細(xì)胞介導(dǎo)的過(guò)敏性疾病同樣有效。

3 ECDI作用機(jī)制研究

ECDI作為一種傳統(tǒng)的化學(xué)偶聯(lián)劑，好像一架橋梁將抗原肽或蛋白偶聯(lián)到細(xì)胞上，或者直接與細(xì)胞偶聯(lián)，在多種自身免疫病以及器官移植模型中都成功地誘導(dǎo)出了針對(duì)抗原的特異性的免疫耐受。然而，在此種方法的基礎(chǔ)上，Ag-SPs誘導(dǎo)免疫耐受的機(jī)制尚不完全明確，其可能的機(jī)制包括：

3.1誘導(dǎo)凋亡機(jī)制 近年來(lái)，有較多研究者在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，ECDI可快速誘導(dǎo)偶聯(lián)的細(xì)胞發(fā)生凋亡[29,34]。凋亡的Ag-SPs通過(guò)靜脈注射的方式進(jìn)入到宿主體內(nèi)后，迅速被脾臟邊緣區(qū)的巨噬細(xì)胞吞噬、加工，經(jīng)處理后的凋亡細(xì)胞免疫原性減弱，致耐受性增強(qiáng)，最后經(jīng)宿主的抗原提呈細(xì)胞(APCs)以非炎性的方式重新遞呈給自身抗原特異性CD4+T細(xì)胞，從而導(dǎo)致其克隆無(wú)能，失去或減弱對(duì)自身抗原的應(yīng)答能力[29]。另一方面，在有抗原存在的情況下，ECDI首先與同基因型供體的脾細(xì)胞偶聯(lián)，再與抗原游離的氨基與羧基交聯(lián)，從而使抗原肽固定到供體細(xì)胞表面上，形成一個(gè)個(gè)“肽包裹著的細(xì)胞”，而這些細(xì)胞作為抗原的“載體”，經(jīng)ECDI誘導(dǎo)發(fā)生凋亡后同樣具有強(qiáng)大的致耐受性功能[25,35]。此外，Getts等[8]還發(fā)現(xiàn)，在ECDI處理3 h內(nèi)幾乎所有細(xì)胞失去其胞膜的完整性，并且Ag-SPs在進(jìn)入宿主18 h內(nèi)能被脾臟邊緣區(qū)吞噬細(xì)胞完全吞噬清除，因此脾臟在Ag-SPs成功誘導(dǎo)耐受等方面也具有重要的作用。

3.2Treg的誘導(dǎo)調(diào)節(jié)機(jī)制 凋亡的Ag-SPs被宿主脾臟邊緣區(qū)吞噬細(xì)胞吞噬的同時(shí)，也能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌IL-10，IL-10可能通過(guò)自分泌的方式進(jìn)一步上調(diào)PD-L1的表達(dá)。不僅如此，Ag-SPs還能明顯誘導(dǎo)CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)的產(chǎn)生，Treg通過(guò)大量分泌IL-10和TGF-β等細(xì)胞因子發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。多個(gè)自身免疫病和器官移植模型的研究均表明，PD-1/PD-L1信號(hào)[36]和Treg[8,22]是維持其長(zhǎng)期耐受的關(guān)鍵機(jī)制。Prasad等[13]在其研究中還發(fā)現(xiàn)，在Ag-SPs耐受誘導(dǎo)的起始階段，Treg同樣具有重要的調(diào)節(jié)作用，如果一旦缺乏Treg的表達(dá)，則會(huì)打破Ag-SPs的免疫耐受效應(yīng)。

3.3共刺激信號(hào)分子通路機(jī)制 自身反應(yīng)性CD4+T細(xì)胞逃避胸腺的陰性選擇，在外周活化的APCs的遞呈作用下，仍維持其對(duì)自身抗原的應(yīng)答能力，而這也依賴于APCs表面共刺激信號(hào)分子的表達(dá)，即一旦缺乏共刺激信號(hào)分子，自身免疫性CD4+T細(xì)胞則活化無(wú)能。Podojil等[37]發(fā)現(xiàn)，Ag-SPs能明顯降低偶聯(lián)的APCs表面共刺激信號(hào)分子CD80/CD86的表達(dá)，從而在EAE等多個(gè)自身免疫病模型中安全、有效地誘導(dǎo)出了自身抗原特異性的免疫耐受。

當(dāng)然，除了上述機(jī)制外，Ag-SPs還可能通過(guò)其他機(jī)制誘導(dǎo)抗原特異性的免疫耐受。比如，Ag-SPs可以直接調(diào)節(jié)TCR(宿主CD4+T細(xì)胞)與抗原肽MHC-Ⅱ類分子復(fù)合體的相互作用，從而阻斷自身反應(yīng)性T細(xì)胞的活化[38]；Eagar等[39]還報(bào)道，CTLA-4對(duì)于誘導(dǎo)和維持Ag-SPs介導(dǎo)的免疫耐受具有重要的調(diào)節(jié)作用。總之，Ag-SPs誘導(dǎo)耐受的機(jī)制并不是單一的，而是多種機(jī)制協(xié)同作用的最終結(jié)果。

4 小結(jié)與展望

相比傳統(tǒng)的自身免疫病的治療方案，ECDI修飾的同基因型脾細(xì)胞偶聯(lián)抗原(Ag-SPs)誘導(dǎo)的免疫耐受主要具有以下優(yōu)勢(shì)：①較少的毒性作用和嚴(yán)重過(guò)敏反應(yīng)；②能誘導(dǎo)抗原特異性的免疫耐受，個(gè)體化、特異性的治療方案減少了傳統(tǒng)免疫抑制劑廣泛的藥理作用所帶來(lái)的副作用；③能夠維持長(zhǎng)期的免疫耐受，大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以及臨床試驗(yàn)已證明，這種誘導(dǎo)耐受的方法對(duì)絕大多數(shù)自身免疫病均有明顯療效[37]。綜上所述，關(guān)于Ag-SPs用于自身免疫病的治療和機(jī)制的研究意義重大，是極具前景的研究方向。

參考文獻(xiàn)：

[1] Chatenoud L,Bluestone JA.CD3-specific antibodies:a portal to the treatment of autoimmunity[J].Nat Rev Immunol，2007,7(8):622-632.

[2] Godsel LM,Wang K,Schodin BA,etal.Prevention of autoimmune myocarditis through the induction of antigen-specific peripheral immune tolerance[J].Circulation，2001,103(12):1709-1714.

[3] Luo X,Miller SD,Shea LD.Immune tolerance for autoimmune disease and cell transplantation[J].Annual Rev Biomed Engineer，2016,18(1):181-205.

[4] Van Gelder H,Charles-Schoeman C.The heart in inflammatory myopathies[J].Rheumatic Disease Clin North Am，2014,40(1):1-10.

[5] Hackstein H,Thomson AW.Dendritic cells:emerging pharma-cological targets of immunosuppre-ssive drugs[J].Nat Rev Immunol，2004,4(1):24-35.

[6] Davidson A,Diamond B.Autoimmune diseases[J].N Engl J Med，2001,345(5):340-350.

[7] Kohm AP,Turley DM,Miller SD.Targeting the TCR:T-cell receptor and peptide-specific tolerance-based strategies for restoring self-tolerance in CNS autoimmune disease[J].Int Rev Immunol，2009,24(5-6):361-392.

[8] Getts DR,Turley DM,Smith CE,etal.Tolerance induced by apoptotic antigen-coupled leukocytes is induced by PD-L1+and IL-10-producing splenic macrophages and maintained by T regulatory cells[J].J Immunol，2011,187(5):2405-2417.

[9] Driver JP,Serreze DV,Chen Y.Mouse models for the study of autoimmune type 1 diabetes:a NOD to similarities and differences to human disease[J].Semin Immunopathol，2011,33(1):67-87.

[10] Leeth CM,Racine J,Chapman HD,etal.B-lymphocytes expressing an immunoglobulin specificity recognizing the pancreatic β-cell autoantigen peripherin are potent contributors to type 1 diabetes development in NOD mice1[J].Diabetes，2016,65(7):1977-1987.

[11] Haller MJ,Atkinson MA,Schatz D.Type 1 diabetes mellitus:etiology,presentation,and management[J].Pediatric Clinics of North America，2005,52(6):1553-1578.

[12] Luan L,Xue R,Lu C,etal.Anti-serum with anti-autoantibody activity decreases autoantibody-positive B lymphocytes and type 1 diabetes of female NOD mice[J].Autoimmunity，2016,49(1):21-30.

[13] Prasad S,Kohm AP,Mcmahon JS,etal.Pathogenesis of NOD diabetes is initiated by reactivity to the insulin B chain 9-23 epitope and involves functional epitope spreading[J].J Autoimmunity，2012,39(4):347-353.

[14] Sulzberger MB.Experiments in prevention and in desensitization[J].Arch Dermatol Syphilol,1929,20(5):669-697.

[15] Chiller J M,Weigle W O.Cellular events during induction of immunologic unresponsiveness in adult mice[J].J.Immunol，1971,106(6):1647-1653.

[16] Burstein HJ,Shea CM,Abbas AK.Aqueous antigens induce in vivo tolerance selectively in IL-2- and IFN-gamma-producing (Th1) cells[J].J Immunol，1992,148(12):3687-3691.

[17] Gratwohl A,Niederwieser D.History of hematopoietic stem cell transplantation:evolution and perspectives[J].Curr Probl Dermatol，2012,43(2):81-90.

[18] Rahimi N,Etchells S,Elliott B.Hepatocyte growth factor (HGF) is a copper-binding protein:a facile probe for purification of HGF by immobilized Cu(II)-affinity chromatography[J].Protein Exp Purif,1996,7(3):329-333.

[19] Johnson HM,Brenner K,Hall HE.The use of a wate-soluble carbodiimide as a coupling reagent in the passive hemagglutination test[J].J Immunol，1966,97(6):791-796.

[20] Wetzig R,Hanson DG,Miller SD,etal.Binding of ovalbumin to mouse spleen cells with and without carbodiimide[J].J Immunol Methods，1979,28(3-4):361-368.

[21] Smarr CB,Hsu CL,Byrne AJ,etal.Antigen-fixed leukocytes tolerize Th2 responses in mouse models of allergy[J].J Immunol，2011,187(10):5090-5098.

[22] Luo X,Pothoven KL,Mccarthy D,etal.ECDI-fixed allogeneic splenocytes induce donor-specific tolerance for long-term survival of islet transplants via two distinct mechanisms[J].Proc Natl Acad Sci U S A，2008,105(38):14527-14532.

[23] Wang S,Tasch J,Kheradmand T,etal.Transient B-cell depletion combined with apoptotic donor splenocytes induces xeno-specific T-and B-cell tolerance to islet xenografts[J].Diabetes，2013,62(9):3143-3150.

[24] Bryant J,Lerret NM,Wang JJ,etal.Preemptive donor apoptotic cell infusions induce IFN-gamma-producing myeloid-derived suppressor cells for cardiac allograft protection[J].J Immunol，2014,192(12):6092-6101.

[25] Miller SD,Turley DM,Podojil JR.Antigen-specific tolerance strategies for the prevention and treatment of autoimmune disease[J].Nat Rev Immunol，2007,7(9):665-677.

[26] Sospedra M,Martin R.Immunology of multiple sclerosis[J].Annu Rev Immunol,2005,23(4): 683-747.

[27] Smith CE,Eagar TN,Strominger J L,etal.Differential induction of IgE-mediated anaphylaxis after soluble vs.cell-bound tolerogenic peptide therapy of autoimmune encephalomyelitis[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2005,102(27): 9595-9600.

[28] Smith CE,Miller SD.Multi-peptide coupled-cell tolerance ameliorates ongoing relapsing EAE associated with multiple pathogenic autoreactivities[J].J Autoimmun,2006,27(4): 218-231.

[29] Turley DM,Miller SD.Peripheral tolerance induction using ethylenecarbodiimide-fixed APCs uses both direct and indirect mechanisms of antigen presentation for prevention of experimental autoimmune encephalomyelitis[J].J Immunol，2007,178(4):2212-2220.

[30] Dilorenzo TP.Multiple antigens versus single major antigen in type 1 diabetes:arguing for multiple antigens[J].Diabetes/Metabolism Res Rev，2011,27(8):778-783.

[31] Niens M,Grier AE,Marron M,etal.Prevention of "humanized" diabetogenic CD8 T-Cell responses in HLA-transgenic NOD mice by a multipeptide coupled-cell approach[J].Diabetes，2011,60(4):1229-1236.

[32] Prasad S,Xu D,Miller SD.Tolerance strategies employing antigen-coupled apoptotic cells and carboxylated plg nanoparticles for the treatment of type 1 diabetes[J].Rev Diabetic Studies，2012,9(4):319-327.

[33] Trautmann A,Schmid-Grendelmeier P,Krüger K,etal.T cells and eosinophils cooperate in the induction of bronchial epithelial cell apoptosis in asthma[J].J Allergy Clin Immunol，2002,109(2):329-337.

[34] Vandenbark AA,Barnes D,Finn T,etal.Differential susceptibility of human T(h)1 versus T(h) 2 cells to induction of anergy and apoptosis by ECDI/antigen-coupled antigen-presenting cells[J].Int Immunol，2000,12(1):57-66.

[35] Podojil JR,Miller SD.Molecular mechanisms of T-cell receptor and costimulatory molecule ligation/blockade in autoimmune disease therapy[J].Immunol Rev，2009,229(1):337-355.

[36] Fife BT,Guleria I,Gubbels Bupp M,etal.Insulin-induced remission in new-onset NOD mice is maintained by the PD-1-PD-L1 pathway[J].J Exp Med，2006,203(12):2737-2747.

[37] Podojil JR,Miller SD.Molecular mechanisms of T-cell receptor and costimulatory molecule ligation/blockade in autoimmune disease therapy[J].Immunol Rev，2009,229(1):337-355.

[38] Eagar TN,Turley DM,Padilla J,etal.CTLA-4 regulates expansion and differentiation of Th1 cells following induction of peripheral T cell tolerance[J].J Immunol，2004,172(12):7442-7450.

[39] Eagar TN,Karandikar NJ,Bluestone JA,etal.The role of CTLA-4 in induction and maintenance of peripheral T cell tolerance[J].Eur J Immunol，2002,32(4):972-981.