肖君，張函，何丹，謝敏杰，王偉

重癥肌無力是一種T細(xì)胞依賴、自身抗體介導(dǎo)的獲得性自身免疫性疾病，主要表現(xiàn)為神經(jīng)肌肉接頭處的神經(jīng)沖動(dòng)的傳遞障礙，從而導(dǎo)致波動(dòng)性的骨骼肌無力[1]。兒童期重癥肌無力是指發(fā)病年齡＜15歲的重癥肌無力，其臨床表現(xiàn)有其自身的特點(diǎn)，如單純眼肌型等[2]。不同的臨床特點(diǎn)提示兒童期重癥肌無力可能有獨(dú)特的發(fā)病機(jī)制。既往研究數(shù)據(jù)顯示，和高加索人相比，亞洲人兒童期重癥肌無力的發(fā)病率明顯較高[3]。由于在高加索人中的發(fā)病率低，因此針對(duì)兒童期重癥肌無力的研究少之又少。

多項(xiàng)研究證實(shí)，Th細(xì)胞功能異常在重癥肌無力的發(fā)病中起重要作用[4]。Th17細(xì)胞是由幼稚的CD4+T細(xì)胞分化而來，Th17相關(guān)細(xì)胞因子包括IL-17、IL-21、IL-22、IL-23等[5-8]。其中，IL-17A是Th17細(xì)胞的標(biāo)識(shí)性細(xì)胞因子，由活化的記憶T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，在許多自身免疫性疾病的發(fā)病過程中起重要作用[9]；而IL-23促進(jìn)Th17細(xì)胞的存活，使活化的Th17細(xì)胞持續(xù)表達(dá)IL-17A[6,8,10]。有研究表明，Th17相關(guān)細(xì)胞因子在合并胸腺瘤的重癥肌無力患者中的水平明顯升高，提示其在重癥肌無力的發(fā)病中扮演重要角色[11,12]，但它是否參與兒童期重癥肌無力的發(fā)病過程尚不清楚。本研究旨在研究Th17相關(guān)細(xì)胞因子在兒童期重癥肌無力中的水平及其在兒童期重癥肌無力發(fā)病中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2013年1月至2015年6月期間在同濟(jì)醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科門診就診的兒童期重癥肌無力患者60例為試驗(yàn)組（CMG組）；診斷標(biāo)準(zhǔn)主要參照美國臨床分類協(xié)會(huì)發(fā)布的診斷標(biāo)準(zhǔn)及中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)會(huì)神經(jīng)病學(xué)分會(huì)神經(jīng)免疫學(xué)組及中國免疫學(xué)會(huì)神經(jīng)免疫學(xué)分會(huì)發(fā)布的《中國重癥肌無力診斷和治療專家共識(shí)2011版》[13,14]，包括：①波動(dòng)性的眼外肌、咽喉肌或四肢近端肌肉等橫紋肌無力及易疲勞，癥狀疲勞后加重，休息或膽堿酯酶抑制劑治療后減輕；②新斯的明試驗(yàn)陽性；③疲勞試驗(yàn)陽性；④乙酰膽堿受體抗體檢測(cè)陽性；⑤肌電圖重復(fù)神經(jīng)電刺激提示動(dòng)作電位波幅第5波比第1波在低頻刺激（3～5 Hz）時(shí)遞減10%以上；⑥如果上述步驟仍不能明確診斷，則進(jìn)行膽堿酯酶抑制劑診斷性治療以明確。參加門診體檢的年齡和性別相匹配的健康兒童50例為正常對(duì)照組（HC組），并排除急慢性感染和自身免疫病等系統(tǒng)性疾病。所有研究均已得到本院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，參與兒童均由監(jiān)護(hù)人簽署知情同意書。

1.2 主要試劑與材料

IL-23 ELISA試劑盒及人IL-17A超敏ELISA試劑盒（購于美國eBioscience公司）；IL-12/IL-23 p40 ELISA試劑盒（購于美國R&D systems公司）；臺(tái)式低溫高速大容量離心機(jī)（購于德國Eppendorf公司）；酶標(biāo)儀（購于瑞士Tecan公司）。

1.3 方法

2組的相關(guān)輔助檢查，如胸腺M(fèi)RI/CT平掃、甲狀腺功能檢測(cè)（FT3、FT4、TSH）等均于初次就診時(shí)在同濟(jì)醫(yī)院檢驗(yàn)科進(jìn)行，血乙酰膽堿受體（acetylcholine receptor，AChR）抗體檢測(cè)于武漢康圣達(dá)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所進(jìn)行。

1.3.1 外周血提取及處理 抽取受試者肘部或頭皮靜脈血4～5 mL于促凝劑采集管中，室溫靜置30 min，于低溫高速離心機(jī)中以4℃ 3 000 r/min的速度離心15～20 min，獲取上層血清，用高壓消毒過的1.5 mL EP管分裝（120 μL/管），于－80℃冰箱保存，避免反復(fù)凍融。所有受試兒童在抽血當(dāng)日均無發(fā)熱或感染的臨床表現(xiàn)，所有外周血標(biāo)本均未發(fā)生溶血。

1.3.2 外周血IL-23,IL-12/23p40及IL-17A ELISA檢測(cè) ELISA檢測(cè)按照各ELISA試劑盒操作說明書進(jìn)行，每個(gè)標(biāo)本取100 μL血清標(biāo)本，分別檢測(cè)2組外周血血清中IL-23、IL-12/23p40及IL-17A的水平。具體步驟：取出－80℃低溫冰箱中的外周血血清樣本及4℃冰箱中的ELISA試劑盒，所有樣本及試劑在使用前均回復(fù)至室溫；配制標(biāo)準(zhǔn)品，在ELISA酶標(biāo)板中分別加入標(biāo)準(zhǔn)品、空白對(duì)照或樣本，均設(shè)置復(fù)孔。貼紙覆蓋，室溫孵育，后洗脫，每孔內(nèi)加入配好的二抗，用貼紙覆蓋酶標(biāo)板，室溫孵育；再經(jīng)過洗脫、顯色，終止液終止反應(yīng)后，快速放入酶標(biāo)儀上讀取各孔OD值，以標(biāo)準(zhǔn)品及空白對(duì)照的濃度作為橫坐標(biāo)，相應(yīng)OD值作為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，依據(jù)樣品的OD值，應(yīng)用Curvexpert軟件計(jì)算出相應(yīng)細(xì)胞因子的濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）表示；獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料

CMG組60例患兒中，男26例，女34例，男女比約為3∶4；平均年齡（6.8±3.4）歲。HC組50例，男26例，女24例；平均年齡（8.2±1.2）歲。2組年齡、性別差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

CMG組中患兒的發(fā)病年齡在4歲前25例（41.7%，男11例，女14例），4～7歲發(fā)病19例（33.7%，男10例，女9例），7～15歲發(fā)病16例（26.7%，男5例，女11例）；AChR抗體陽性42例（70.0%，男19例，女23例）；通過胸部CT/MRI檢查，所有病例均未發(fā)現(xiàn)胸腺瘤，合并胸腺增生10例（16.7%，男4例，女6例），其中行胸腺切除手術(shù)3例（男1例，女2例）；胸腺正常50例（83.3%，男22例，女28例）；根據(jù)患者臨床表現(xiàn)及甲狀腺功能檢查結(jié)果，合并甲狀腺功能亢進(jìn)6例（10.0%，男3例，女3例）。

2.2 外周血IL-17A、IL-23及IL-12/23 p40 ELISA檢測(cè)結(jié)果

CMG組和HC組的外周血血清中IL-17A濃度分別為（3.17±0.12）ng/mL、（1.36±0.16）ng/mL，CMG組外周血血清中IL-17A含量高于HC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。CMG組和HC組的外周血血清中IL-23含量分別為（9.83±1.11）pg/mL、（3.96±0.28）pg/mL，CMG組的血清IL-23濃度是HC組的近3倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。CMG組和HC組的血清IL-12/23 p40表達(dá)量分別為（178.49±10.37）pg/mL、（109.78±9.21）pg/mL，CMG組較HC組血清IL-12/23p40含量明顯升高，有顯著性差異（P＜0.01）。

3 討論

重癥肌無力是一種T細(xì)胞依賴、自身抗體介導(dǎo)的獲得性自身免疫性疾病，癥狀可波及眼外肌和其他骨骼肌。兒童期重癥肌無力以單純眼肌型多見。既往數(shù)據(jù)顯示，在中國，39%～50%以上的重癥肌無力患者在15歲以前發(fā)病[15,16]，而在高加索人當(dāng)中，重癥肌無力主要在成年期發(fā)病，青春期發(fā)病的僅占10%～15%[17]。本研究納入60例兒童期重癥肌無力患者，4歲之前發(fā)病的占47.1%。筆者推斷，中國兒童期重癥肌無力的發(fā)病年齡＜4歲者，即嬰兒期發(fā)病居多，且其比例遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于高加索人，這一結(jié)論與既往研究相符。CMG組的外周血AChR抗體陽性率為70%，與報(bào)道的成人重癥肌無力患者AChR抗體陽性率相比略低，但是高于歐美等國家兒童期重癥肌無力的抗體陽性率[6,8]，提示其可能具有獨(dú)特的免疫發(fā)病機(jī)制。

近期研究表明，在重癥肌無力的發(fā)病過程中，細(xì)胞免疫發(fā)揮重要的作用[18]。Th17細(xì)胞是新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)輔助性CD4+T細(xì)胞亞群，Th17相關(guān)細(xì)胞因子在多種自身免疫性疾病，如克羅恩病、多發(fā)性硬化、系統(tǒng)性紅斑狼瘡及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等的發(fā)病過程中起重要作用[9,19-21]。其中，IL-17A作為首個(gè)被發(fā)現(xiàn)的Th17相關(guān)細(xì)胞因子，可以上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶和一些趨化因子的水平，募集中性粒細(xì)胞，從而發(fā)揮促炎因子的作用，進(jìn)而參與自身免疫反應(yīng)的發(fā)生[22]。為了驗(yàn)證IL-17A在兒童期重癥肌無力中的具體作用，本研究通過ELISA檢測(cè)CMG組及HC組外周血中IL-17A的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)外周血血清中IL-17A在CMG組中明顯增加。此外，Th17相關(guān)細(xì)胞因子IL-23是IL-12家族的新成員，由IL-12/23 p40和IL-23p19這兩個(gè)亞基組成，通過活化的樹突狀細(xì)胞來調(diào)節(jié)T細(xì)胞依賴的免疫應(yīng)答。研究表明，IL-23主要是通過刺激Th17細(xì)胞分泌Th17相關(guān)細(xì)胞因子如IL-17A和IL-17F發(fā)揮作用[23]。IL-23能維持Th17細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)和擴(kuò)增，促進(jìn)其持續(xù)分泌IL-17A，是其賴以生存的必需的細(xì)胞因子[6,8,10]。Schlapbach等[24]通過免疫組織化學(xué)及半定量PCR發(fā)現(xiàn)，在化膿性汗腺炎患者的皮損處，乳頭層和網(wǎng)狀真皮層均有IL-23和IL-17A的表達(dá)，且表達(dá)水平較正常皮膚升高，提示Th17相關(guān)細(xì)胞因子可能參與該病的免疫病理過程。He等[25]的研究結(jié)果顯示，在超敏性氣道炎癥患者中，通過上皮途徑吸入后的抗原可促進(jìn)樹突狀細(xì)胞產(chǎn)生IL-23，并使IL-17A表達(dá)增加。本研究通過ELISA檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)CMG患者血清中IL-23及其活性亞單位IL-12/23p40的含量較HC組明顯升高，表明IL-23可能參與兒童期重癥肌無力的發(fā)病。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)，中國兒童期重癥肌無力以嬰兒期發(fā)病居多，且在患兒外周血血清中IL-23、L-12/23p40及IL-17A的水平明顯升高，提示Th17相關(guān)細(xì)胞因子可能參與兒童期重癥肌無力的發(fā)病過程。

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