李沛翰 李鵬 宋宏彬

（解放軍疾病預(yù)防控制所，北京 100071）

近年來，嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒（Sever acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV）、中東呼吸綜合征冠狀病毒（Middle East respiratory syndrome-related coronavirus，MERS-CoV）、埃博拉病毒（Ebola virus）、甲型流感病毒H7N9亞型（Influenza A virus subtype H7N9）等新發(fā)突發(fā)病原體造成的傳染病疫情給公共衛(wèi)生防控帶來嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。2002年國內(nèi)暴發(fā)了嚴(yán)重急性呼吸道感染疫情，初期病原體難以確定給疫情防控帶來極大困難。直至2003年4月，研究人員明確病原為SARS冠狀病毒，并制定針對性的診斷方法和預(yù)防措施，疫情才得到有效控制。此次疫情先后蔓延至37個國家，共導(dǎo)致約8 000人感染和774例死亡，造成了巨大的經(jīng)濟損失和社會恐慌［1-2］。因此在應(yīng)對公共衛(wèi)生突發(fā)事件，尤其是新發(fā)突發(fā)傳染病時，快速準(zhǔn)確識別致病病原對制定疫情防控策略至關(guān)重要。

傳統(tǒng)病原檢測以分離培養(yǎng)、顯微鏡觀察、血清學(xué)診斷及PCR等方法為主，存在諸多問題。分離培養(yǎng)方法適用于少數(shù)可培養(yǎng)微生物，但目前僅不足1%的細菌可以通過這種方式進行鑒定［3］；顯微鏡觀察從形態(tài)學(xué)上進行鑒定，但靈敏度較低［4］；血清學(xué)診斷容易出現(xiàn)交叉反應(yīng)，特異性差［5］；PCR方法無法檢測未知病原和變異較大病原［6］。基于傳統(tǒng)實驗室檢測，目前高達40%的腸胃炎和60%的腦炎臨床病例無法有效確定致病病原［7-8］。

20世紀(jì)90年代，Handelsman等［9］首次提出了宏基因組（Metagenome）的概念，其泛指環(huán)境樣本中所有微生物基因組的總和。隨后宏基因組學(xué)（Metagenomics）被定義為將現(xiàn)代基因組學(xué)技術(shù)應(yīng)用于直接研究自然狀態(tài)下的微生物群落，避免在實驗室單獨分離微生物的科學(xué)［10］。宏基因組學(xué)研究廣泛應(yīng)用于土壤、水體等環(huán)境樣本，以及與人類疾病相關(guān)的微生物群落的生物多樣性分析。此外，由于宏基因組學(xué)無需單獨對病原分離培養(yǎng)，通過核酸提取純化可以直接分析臨床樣本，其為傳染病病原尤其是未知病原檢測提供了新的技術(shù)手段和思路［11］。

本文對宏基因組學(xué)的技術(shù)進展及其在病原監(jiān)測、檢測和溯源等公共衛(wèi)生領(lǐng)域的應(yīng)用進行了綜述，旨在為傳染病預(yù)防和控制提供參考和新視角。

1 宏基因組技術(shù)進展

宏基因組學(xué)以樣本中所有核酸為研究對象，隨著各類技術(shù)的不斷發(fā)展，宏基因組學(xué)逐步走向成熟，并且在核酸提取、高通量測序和數(shù)據(jù)分析等方面均有較大發(fā)展空間。

1.1 核酸提取

臨床樣本包含多種微生物，且非核酸雜質(zhì)多，核酸提取的效率和純度相對較低，核酸提取是宏基因組研究的關(guān)鍵步驟。根據(jù)研究目的和樣本差異，選擇合適的提取方法得到高質(zhì)量核酸有利于后續(xù)病原的鑒定分析。

細菌結(jié)構(gòu)差異會給測序結(jié)果帶來較大影響。研究表明使用研磨珠裂解法比酶裂解法獲得更多雙歧桿菌核酸，并導(dǎo)致結(jié)果中梭菌屬和放線菌群組成差異［12］。20世紀(jì)90年代的幾項研究表明細菌的16S rDNA序列是病原體發(fā)現(xiàn)和鑒定的重要依據(jù)［13-14］，早期的宏基因組學(xué)以16S rDNA測序為主，常用來分析樣本中菌群分布特征。16S rDNA擴增子測序采用通用引物擴增，引物選擇至關(guān)重要。Marchesi等［15］對兩種引物進行比較發(fā)現(xiàn)，63f-1387r引物能比27f-1392r擴增得到更多的物種。通過測試175個引物和512個引物對，Klindworth等［16］發(fā)現(xiàn)僅有10個引物能擴增較多種微生物，但這些引物對古細菌擴增效果差，仍需進行額外引物設(shè)計。高變區(qū)（V區(qū)）的選擇策略不同也會造成結(jié)果差異。Claesson等［17］發(fā)現(xiàn)V6區(qū)域可變性高，有利于分析物種多樣性，但V4區(qū)域比V6區(qū)域獲得更高準(zhǔn)確度。

相比原核和真核生物，病毒基因組較短，其在臨床感染樣本中豐度較低，且與多種其它類型生物核酸混雜，如何排除干擾提取濃度較高的病毒核酸對于宏基因組研究至關(guān)重要。Thurber等［18］提出了使用SYBR-Gold試劑染色，實時監(jiān)測處理樣品中病毒顆粒的數(shù)量，濃縮來自各種類型樣品的病毒顆粒，消除污染細胞和游離核酸。此外，對于研究某一生態(tài)群落的病毒，可使用隨機PCR進行擴增，其關(guān)鍵點在于需要針對某一病毒群體如呼吸道病毒、腸道病毒等設(shè)計通用引物。對于DNA病毒核酸富集提取采用CTAB法、氯仿抽提法等，前者使用十六烷基三甲基溴化銨（Cetyl-trimethylammonium bromide，CTAB）溶液提取，并通過“三合一”溶液（酚:氯仿:異戊醇=25∶24∶1）等步驟實現(xiàn)病毒DNA的提純［19］；后者則采用十二烷基磺酸鈉（Sodium dodecyl sulfonate，SDS）和苯酚-氯仿萃取，最終實現(xiàn)樣本DNA病毒的提?。?0］。RNA病毒核酸提取常采用Trizol 法，該方法使用異硫氰酸胍、苯酚和氯仿形成三相溶液，進一步通過分離中間相和有機相中的DNA和蛋白質(zhì)，然后可沉淀得到水相中的病毒RNA［21］。此外，大量商業(yè)化試劑盒和自動化制備儀器的出現(xiàn)，使病毒核酸提取更加方便快捷，如專門純化提取RNA病毒的試劑盒QIAamp Viral RNA Mini Kit，以及自動化核酸提取工作站Qiagen BioRobot 9604 等［22］。

1.2 高通量測序

受限于測序技術(shù)，16S rDNA擴增子測序早期使用Sanger法，隨后出現(xiàn)基于焦磷酸測序方法的商業(yè)化測序平臺454，其通量比傳統(tǒng)Sanger法高，在16S rDNA高變區(qū)測序和病原鑒定中具有廣泛的應(yīng)用［23］。

隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，Illumina與Ion Torrent測序平臺作為第二代測序平臺主導(dǎo)，與454相比其成本大幅下降，在宏基因組測序中展示出巨大潛力。研究顯示Ion Torrent PGM測序速度比Illumina MiSeq更高，且能比MiSeq獲得更高的讀長，但是MiSeq的覆蓋度較高［24］。

二代測序需要對樣本進行建庫及擴增，初始樣本中的物種豐度差異導(dǎo)致擴增后出現(xiàn)高豐度物種覆蓋過高和低豐度物種覆蓋不足的情況。臨床樣本包含多種復(fù)雜微生物，數(shù)據(jù)分析受到讀長限制，較長讀長能夠使組裝更加準(zhǔn)確。PacBio等三代測序平臺采用單分子測序技術(shù)，無需擴增DNA分子即可測得基因序列，并且讀長更長，有效彌補了二代測序的局限性。PacBio對16S rDNA的準(zhǔn)確度和覆蓋度都較低［25］，但通過改進可直接測得16S rDNA全長，準(zhǔn)確度可由之前的80%提高到99%［26］。

1.3 數(shù)據(jù)分析

宏基因組學(xué)數(shù)據(jù)分析內(nèi)容包括擴增子測序分析以及全基因組測序分析。擴增子測序首先生成操作性分類單位（Operational taxonomic unit，OTU），之后進行物種群落和多樣性分析，包括Alpha多樣性、Beta 多樣性分析和系統(tǒng)發(fā)育分析等［27］。全基因組測序產(chǎn)生海量數(shù)據(jù)，涉及大量不同物種，數(shù)據(jù)分析難度大，主要包括數(shù)據(jù)的拼接組裝、基因預(yù)測、功能注釋等［28］?；蚪M裝（Genome assembly）將測序得到的堿基片段經(jīng)過拼接和組裝得到較長片段堿基序列，目前針對第二代測序技術(shù)，主流算法是基于圖論的de Bruijn Graph（DBG）算法［29］；基因預(yù)測一般用于預(yù)測 DNA 序列中編碼蛋白質(zhì)氨基酸序列的部分，即預(yù)測結(jié)構(gòu)基因，目前有基于序列相似性和基于統(tǒng)計學(xué)模型的兩種預(yù)測方法［30］；在進行基因預(yù)測之后，將基因或蛋白序列在特定的數(shù)據(jù)庫中搜索比對，從而完成功能注釋分析。

目前已有專門用于宏基因組分析的流程化軟件和工具，如 QIIME［31］、MEGAN［32］等，但分析計算量巨大，通常依賴于大型高性能計算平臺，可以部署在高性能計算機上，并可在完成拼接、比對等高計算要求后，將結(jié)果傳輸?shù)絺€人電腦進行后續(xù)進化、聚類、生物多樣性等分析。也可以利用宏基因組云計算平臺，如 IMG-M（http://img.jgi.doe.gov/m）［33］，Galaxy（http://g2.bx.psu.edu）［34］和 MG-RAST（http://metagenomics.anl.gov/）［35］等進行常規(guī)宏基因組分析，通過在線儲存、定位進行數(shù)據(jù)共享，使海量資源得到充分利用。宏基因組測序數(shù)據(jù)中包含多類物種，通過算法優(yōu)化來解決海量數(shù)據(jù)快速分析問題，如Li等［36］開發(fā)的針對宏基因組大數(shù)據(jù)量的快速聚類算法，這類生物信息學(xué)分析工具極大促進了宏基因組的發(fā)展。

2 宏基因組在傳染病防控中的應(yīng)用

基于高通量測序的宏基因組學(xué)可以得到樣本中全部物種的基因組，從而能同時識別所有致病病原體，極大減少逐個排除可疑病原所耗費的時間及人力物力，并可對未知病原或已知變異較大病原進行識別，為傳染病防控帶來新的思路。目前，宏基因組在公共衛(wèi)生監(jiān)測、病原檢測以及傳染病溯源等方面得到了廣泛應(yīng)用。

2.1 病原監(jiān)測

采集某一地區(qū)或人群的臨床樣本、食品和媒介生物等各類樣本進行宏基因組學(xué)測序，監(jiān)測潛在致病病原，對可能出現(xiàn)的疫情進行預(yù)測預(yù)警，可有效預(yù)防突發(fā)公共衛(wèi)生事件發(fā)生。

宏基因組能夠克服傳統(tǒng)方法的局限性，實現(xiàn)病原的高精度識別，為日常病原監(jiān)測提供指導(dǎo)。Fischer等［37］收集了24例季節(jié)性流感患者支氣管肺泡灌洗液、痰液和咽拭子樣本，實時定量PCR結(jié)果顯示H3N2和H1N1呈陽性，但不能進一步分型，通過宏基因組測序并與已報道的基因組比對，能精確其具體型別，而且在部分樣本中發(fā)現(xiàn)其它病毒或細菌的混合感染。此外，對特定癥候人群進行病原監(jiān)測，能預(yù)測傳染病暴發(fā)，并對出現(xiàn)相似癥狀的患者預(yù)警。研究者使用波多黎各、剛果、加利福尼亞等地區(qū)急性發(fā)熱病人的血液樣本，未分離培養(yǎng)直接提取核酸后進行測序，分別檢測到基孔肯雅病毒，埃博拉病毒和丙型肝炎病毒，并且使用PCR驗證結(jié)果［38］。一項研究使用宏基因組監(jiān)測呼吸道疾病，采集210例患者鼻咽抽吸樣本，提取核酸后分別進行DNA和RNA建庫測序，在樣本中檢測到副黏病毒科、正黏病毒科和小RNA病毒科等多種病毒，發(fā)現(xiàn)一種新型鼻病毒，收集這些臨床樣本信息能建立預(yù)警機制，在出現(xiàn)異常時能快速判斷可能造成疫情的病原微生物，防止新突發(fā)傳染病的發(fā)生［39］。

隨著全球化貿(mào)易的發(fā)展，病原借助于食品進行傳播的風(fēng)險加大，食品監(jiān)測日益重要，但受限于檢測范圍，不能完全排除食物攜帶病原的可能性。Temmam等［40］通過對進口動物肉制品進行宏基因組測序，檢測到冠狀病毒、黃病毒、痘病毒、漢坦病毒等可能感染人類的病毒，表明其可能存在致病風(fēng)險。Ng等［41］對墨西哥灣捕獲的12只健康北方粉紅蝦進行宏基因組檢測，在樣本中發(fā)現(xiàn)了諾達病毒和一種新型的環(huán)狀單鏈DNA病毒，需要對食品可能造成的病原傳播提高警惕。宏基因組對食品的病原監(jiān)測有助于阻止病原體從境外流入和擴散，預(yù)防食源性傳染病的發(fā)生。

相同策略的宏基因組研究方法也可監(jiān)測媒介生物，評估病原體感染人類的可能性，預(yù)防人畜共患病發(fā)生。為評估野生老鼠攜帶病毒對人類的致病風(fēng)險，研究者采集了德國柏林地區(qū)20只野生老鼠的腸道提取物樣本并進行測序，檢測到博卡病毒、沙波病毒、諾瓦克病毒和輪狀病毒等多種病原，其中的輪狀病毒株與人類致病密切相關(guān)［42］。Coffey等［43］對澳大利亞蚊子進行研究，分別提取其DNA和RNA進行深度測序，檢測到羅斯河病毒、黃病毒、環(huán)狀病毒等多種潛在致病微生物，這對于預(yù)防蟲媒傳染病，防止其大規(guī)模暴發(fā)具有重要意義。

2.2 病原檢測

不明原因疾病和未知病原增加了臨床診斷難度，無法進行有效治療，導(dǎo)致患者病情加重甚至死亡。通過測序樣本，并結(jié)合傳統(tǒng)實驗室診斷方法進行驗證，宏基因組學(xué)在病原檢測中發(fā)揮日益重要的作用。

宏基因組檢測能夠得到病原全部基因信息，在更深入的層次上探究病原感染原因。研究顯示，埃博拉病毒治愈后，病毒抗體可在體內(nèi)持續(xù)至少10年，復(fù)發(fā)幾率極低［44］。一名埃博拉患者治愈出院9個月之后出現(xiàn)復(fù)發(fā)癥狀，用PCR檢測到了埃博拉病毒，但是不能確定是原病毒還是新變異病毒的感染。為了研究再次感染的原因，研究者采取病人腦脊液和血清進行宏基因組測序，檢測到的序列與初次發(fā)病的序列僅有兩個非編碼區(qū)的變化，調(diào)整治療方案后患者病情好轉(zhuǎn)［45］。這項研究重新說明了埃博拉病毒具有復(fù)發(fā)的可能性，不能停止對埃博拉康復(fù)患者的檢測，這對于疫情治療和控制具有重要作用。

2011年德國暴發(fā)了急性腸出血性流行病，疫情初期沒有特異性手段檢測病原感染，而分離培養(yǎng)耗時長且比較困難。在對此次疫情進行回顧性研究中，Loman等［46］采用宏基因組檢測方法，采取40例疫情暴發(fā)期間的產(chǎn)志賀毒素型大腸桿菌（STEC）陽性糞便樣本，并使用5例STEC陰性腹瀉樣本作為對照，未經(jīng)分離培養(yǎng)直接提取DNA進行測序。于STEC陽性患者的樣本中檢測到該疾病的致病菌株STEC O104∶H4，并且進一步檢測到產(chǎn)志賀毒素的基因片段，在5例對照組中也檢測到了艱難梭菌、空腸彎曲桿菌和沙門氏菌的感染。表明了宏基因組使用非培養(yǎng)樣本檢測病原體并分析其毒力的潛力。

2007-2010年河南暴發(fā)了發(fā)熱伴血小板減少綜合征（Fever，thrombocyte-penia and leukopenia syndrome，F(xiàn)TLS）疫情，初始使用反轉(zhuǎn)錄PCR、PCR和免疫熒光血清學(xué)分析檢測了黃病毒科、日本腦炎病毒、披膜病毒科等可能微生物，均未能確定致病病原。Xu等［47］收集了285例患者的急性期血清樣本，之后將未分離培養(yǎng)的樣本直接進行宏基因組測序，檢測到了一種新型病毒序列，通過比對和系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)其與已知布尼亞病毒科具有遺傳相似性，是布尼亞病毒科白蛉病毒屬的新成員。隨后根據(jù)測得的基因序列設(shè)計引物進行PCR檢測，以及使用免疫熒光血清學(xué)分析，結(jié)果均呈陽性，并對患者血清進行病毒分離培養(yǎng)，成功分離出此病毒，最終確定了導(dǎo)致此次疫情的就是新型布尼亞病毒。

德國一名患者出現(xiàn)急性呼吸窘迫綜合征（Acute respiratory distress syndrome，ARDS）的癥狀，使用PCR和分離培養(yǎng)方法檢測流感病毒、腺病毒、肺炎支原體、肺炎衣原體等多種病原均為陰性，使用抗生素治療無效，患者在6日后死亡。當(dāng)?shù)诙嗤Y狀患者出現(xiàn)時，F(xiàn)isher等［48］使用宏基因組方法，采集患者的支氣管肺泡灌洗樣本，提取核酸后進行二代測序，在50 h內(nèi)快速確定了致病病原是鸚鵡熱衣原體，隨后根據(jù)基因序列設(shè)計引物，使用PCR驗證了檢測結(jié)果，并對患者進行針對性的抗生素治療，患者病情減輕。第三例患者曾與第二例患者進行接觸，并出現(xiàn)同樣癥狀，推測是第二例患者導(dǎo)致的感染，采用前述抗生素治療后患者迅速好轉(zhuǎn)。宏基因組對不明原因疾病患者的診斷，有助于及時求治患者，并為后續(xù)患者的診斷治療提供指導(dǎo)。

病毒、細菌和真菌等多種病原微生物均可引起腦膜炎，逐一排查可疑病原體費時費力。北京協(xié)和醫(yī)院4例患者臨床診斷為疑似病毒性腦膜炎，通過測序2例患者腦脊液樣本，檢測到單純皰疹病毒1型（HSV-1），另外兩名患者樣本中檢測到單純皰疹病毒2型（HSV-2）和人類皰疹病毒3型（HHV-3），并隨后通過PCR對其中3例進行確認［49］。2014年北京3例腦膜炎患者被診斷為疑似李斯特菌感染，但對樣本進行細菌培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)結(jié)果為陰性，研究者對患者的腦脊液進行了直接測序，檢測到李斯特菌序列，并利用PCR進一步驗證，確認是李斯特菌引起的感染［50］。以上研究表明宏基因組具有檢測罕見病原感染的能力，基于測序的快速診斷對于應(yīng)對未知原因且致命的腦膜炎感染至關(guān)重要。

器官移植患者容易發(fā)生異常感染，宏基因組方法能夠確定感染患者的致病病原。一名2歲男孩在干細胞移植后出現(xiàn)高燒，紅疹和全身皮膚變黑等癥狀，使用分離培養(yǎng)和PCR檢測可疑病原均為陰性，常規(guī)抗生素治療均無效，Ye等［51］對患者血液樣本進行二代測序，檢測出痤瘡丙酸桿菌感染，并在臨床治療上調(diào)整抗生素治療方法，患者迅速好轉(zhuǎn)。三名患者接受同一位捐贈者的肝移植或腎移植，捐贈者之后因腦出血死亡，三名接受者也先后因腦病死亡，推測可能由病原感染造成。使用分離培養(yǎng)和PCR方法檢測皰疹病毒、狂犬病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、弓形蟲、結(jié)核桿菌等病原體，均未檢測到致病病原。Palacios等［52］采取捐贈者和接收者腦脊液、血液、腎臟、肝臟等樣本，提取RNA進行測序，檢測到一種新型沙粒病毒，隨后設(shè)計引物進行PCR、分離培養(yǎng)和血清學(xué)檢測，均證實了結(jié)果。此外，一例12歲患者在腎臟移植后出現(xiàn)發(fā)燒、畏寒、身體疼痛等癥狀，使用PCR和血清學(xué)檢測一系列病原均為陰性，研究者通過對腦脊液樣本進行宏基因組測序，檢測到了西尼羅病毒的序列，在進行針對性治療后患者迅速好轉(zhuǎn)，并在恢復(fù)期檢測到西尼羅病毒抗體，證實了西尼羅病毒的感染［53］。值得關(guān)注的是，在病人急性期使用血清學(xué)檢測西尼羅病毒，可能由于免疫抑制作用，結(jié)果呈現(xiàn)假陰性，并且由于腦脊液中西尼羅病毒的反轉(zhuǎn)錄PCR敏感性較差，未使用反轉(zhuǎn)錄PCR檢測西尼羅病毒。宏基因組方法在此情況下發(fā)揮作用，說明其具有較強的病原檢測能力。

此外，許多新型病原可導(dǎo)致臨床病例，難以通過傳統(tǒng)微生物技術(shù)進行檢測，而宏基因組測序使發(fā)現(xiàn)新病原成為可能。一名澳大利亞兒童的急性腹瀉樣本在使用分離培養(yǎng)、免疫學(xué)診斷、PCR等方法檢測后，輪狀病毒、星狀病毒、腺病毒和常見細菌等病原體結(jié)果均為陰性。Holtz等［54］采用宏基因組方法直接從糞便樣本提取RNA進行測序，發(fā)現(xiàn)了一種與已知柯薩奇病毒相似的序列，通過系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)其基因序列不符合納入現(xiàn)有物種的標(biāo)準(zhǔn)，推測其為柯薩奇病毒屬內(nèi)新的物種并命名為Human Cosavirus E1（HCoSV-E1）。雖然這些病毒的流行和臨床意義目前未知，但這些病毒可能對人類健康產(chǎn)生影響，而宏基因組檢測能夠幫助了解這些病毒的免疫和發(fā)育信息并為預(yù)防和控制帶來新思路。

2.3 病原溯源

在調(diào)查傳染病疫情時，宏基因組學(xué)在對樣本進行測序后，還可以構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹等對病原進行追溯，找到潛在傳播途徑，及時確定和切斷感染源，進而為制定公共衛(wèi)生策略提供重要依據(jù)。

寨卡病毒通過蚊蟲叮咬傳播，孕婦感染后可導(dǎo)致新生兒小頭癥，2016年寨卡病毒疫情暴發(fā)引起了廣泛的關(guān)注［55］。研究者通過對兩例孕婦患者的羊水樣本直接進行高通量測序，檢測到寨卡病毒的全基因組，表明寨卡病毒可以穿過胎盤屏障感染胎兒，隨后利用PCR和ELISA驗證檢測結(jié)果，進一步全基因組系統(tǒng)發(fā)育分析顯示其與法屬波利尼西亞的寨卡病毒具有97-100%的相似度，這為建立寨卡病毒和小頭癥的聯(lián)系及確定病毒來源提供了重要參考［56］。此外，Quick等［57］發(fā)展了直接對臨床樣本測序的方法，通過多重PCR富集病毒基因組，并同時采用MinION和Illumina進行測序分析，可以得到病毒全部序列。基于上述方法，Guerbois等［58］獲得感染患者的寨卡病毒序列，通過比對及溯源分析，發(fā)現(xiàn)該序列和北美地區(qū)埃及伊蚊中的病毒序列相似，推測病毒從危地馬拉傳入，并可能繼續(xù)向北擴散，這為防止寨卡病毒進一步傳播提供指導(dǎo)。

2011年，美國國立衛(wèi)生研究院臨床中心暴發(fā)了耐碳青霉烯藥物病原疫情，造成18例感染和11例死亡。初始使用PCR和PFGE分析檢測到肺炎克雷伯菌，但未能進一步區(qū)分患者菌株之間的差異以及對疫情深入研究。Snitkin等［59］使用宏基因組方法對此次疫情做了調(diào)查，測序得到菌株全基因組，序列分析顯示其屬于肺炎克雷伯菌NTUH-K2044型，并且檢測到碳青霉烯藥物的耐藥基因，之后通過分析全基因組序列確定菌株之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，結(jié)合流行病學(xué)調(diào)查，推測病原在18位患者之間的傳播路徑。值得關(guān)注的是，宏基因組分析傳播路徑結(jié)果顯示病原不僅可以在相同病房內(nèi)，還能在不同病房之間傳播，表明本次疫情可能具有更復(fù)雜的傳播方式，亟需加強對無癥狀人員和設(shè)備儀器等進行監(jiān)測。在應(yīng)對新突發(fā)疫情過程中，宏基因組方法能夠獲得樣本毒力耐藥信息，為治療提供幫助。此外，把基因組數(shù)據(jù)與流行病學(xué)數(shù)據(jù)進行整體考慮，將遺傳信息與樣本提取的時間和位置結(jié)合，能夠有效對疫情調(diào)查追溯，推測病原傳播的過程和方式，對傳染病的傳播進行阻斷。

流感病毒突變率和譜系可能對不同亞種的表型和抗原性起重要作用，對不同型別流感病毒進化關(guān)系追溯有利于更深刻地認識其變異傳播規(guī)律，從而為防控提供依據(jù)。Yu等［60］通過收集患者呼吸道樣本和當(dāng)?shù)丶仪菁S便、咽拭子等樣本，利用宏基因組測序方法，在人類樣本中檢測到H7N9病毒，在家禽樣本中則檢測到H7N9和H9N2的共存，并對人和家禽樣本均用PCR進行驗證，發(fā)現(xiàn)H7N9的演化受到H9N2影響。

宏基因組得到病原基因組后，能準(zhǔn)確比對其序列，判斷病原源頭。2010年烏干達醫(yī)院報告疑似出血熱病例，McMullan等［61］從4名病人的血液樣本直接提取RNA進行測序，檢測到黃熱病毒序列，系統(tǒng)發(fā)育分析將其與非洲各地報道過的毒株進行比對。結(jié)果顯示，以往烏干達出現(xiàn)的黃熱病毒與非洲東部和中部地區(qū)的序列具有同源性，并且大多數(shù)黃熱病毒具有地理聚集性。但是此次病例基因型不同于之前烏干達地區(qū)報道的基因組，而是與中非共和國特有的毒株具有相似性，揭示了可能的傳播來源。

利用宏基因組方法還可以對一些歷史疫情或病例進行研究，從而對傳染病病原進行時空溯源。Keller等［62］從冰木乃伊的骨骸中提取了0.1 g骨活性組織并進行直接測序，檢測到伯氏疏螺旋體菌，識別到目前已知最早的萊姆病患者。研究者收集了來自英國、丹麥、瑞典的距今1010-1383年共計22例骨骼和牙齒樣本，使用宏基因組測序方法檢測到麻風(fēng)桿菌，并通過分析不同地區(qū)麻風(fēng)桿菌的序列差異，探究麻風(fēng)桿菌的起源與演變，推測美洲麻風(fēng)病可能來源于歐洲，并且中東地區(qū)麻風(fēng)桿菌基因型與中世紀(jì)歐洲地區(qū)基因型相關(guān)［63］。Chan等［64］對一名1797年的木乃伊肺部殘留組織樣本提取核酸后進行測序，發(fā)現(xiàn)其受到分布在歐洲和北美地區(qū)的兩種不同基因型結(jié)核分枝桿菌的混合感染，這對研究結(jié)核分枝桿菌在世界范圍內(nèi)傳播的過程具有重要意義。

3 展望

雖然宏基因組學(xué)是一項強有力的工具，但是其仍有一些局限性待解決和進一步發(fā)展。理論上宏基因組可以應(yīng)用于任何樣本，對不同類型病原體（如病毒、細菌、真菌和寄生蟲等）都可以進行檢測，但臨床、環(huán)境等樣本收集處理存在較多變量和不確定性，不同樣本所含微生物復(fù)雜程度不同，因此建立并優(yōu)化不同樣本收集及處理標(biāo)準(zhǔn)化操作流程，有助于降低污染風(fēng)險，并減少因分析流程不統(tǒng)一導(dǎo)致的分析結(jié)果偏差。

傳染病感染樣本復(fù)雜且含有大量非目的微生物核酸，當(dāng)樣本核酸濃度較低時，宏基因組測定序列難以實現(xiàn)致病病原高覆蓋，導(dǎo)致數(shù)據(jù)分析的準(zhǔn)確率和可靠性下降，尤其是全基因組測序分析比16S rDNA擴增分析需要更高的覆蓋，如何提高感染病原核酸濃度及宏基因組測序序列精度是一個值得考慮的問題。且臨床樣本中人類基因組含量較高，在采取預(yù)防性措施的前提下，在50%-90%的序列中仍發(fā)現(xiàn)了人類基因，說明去除樣本中人類核酸的技術(shù)仍存在較大發(fā)展空間［65］。此外，用于宏基因組分析的參考數(shù)據(jù)庫還不夠完善，大量測序數(shù)據(jù)無法進行有效匹配，這對于病毒分析尤其嚴(yán)重，研究顯示80%或更多病毒的序列缺少與之相應(yīng)的匹配［66］。相比傳統(tǒng)檢測，宏基因組方法可將病原檢出率由12.82%（10/78）提高到30.77%（24/78），宏基因組測序雖然可以獲得樣本序列信息，但仍難以直接確認致病病原，無法滿足診治需求，需要對其進一步發(fā)展以適應(yīng)臨床需要［67］。

在病原識別后的生物信息學(xué)分析過程中，如何將臨床表型和基因型結(jié)合起來以及挖掘?qū)魅静》揽赜杏玫男畔⑹且粋€挑戰(zhàn)。解決這一問題仍需要宏基因組學(xué)與傳統(tǒng)實驗室檢測手段相結(jié)合，如在宏基因組檢測到病原后使用PCR或分離培養(yǎng)方法進行確認，在檢測到耐藥基因后調(diào)整藥物治療方案以提高治療效果等。其次，有研究表明，在序列分析過程中，人類閱讀和分析隱私問題也值得關(guān)注［68-69］，如何在病原檢測過程中盡可能地保護患者隱私，避免出現(xiàn)因基因組測序?qū)е碌膫惱韱栴}，需要重點考慮。

在傳染病病原檢測中，時效性是一個重要問題，病原診斷的周轉(zhuǎn)時間（Turn around time，TAT）是判斷病原檢測有效性的可靠指標(biāo)。Goswami等［70］進行了為期一年的調(diào)查研究，對臨床樣本的TAT進行評估，結(jié)論是住院樣本的TAT為5.5 h，門診樣本的TAT是24 h。針對臨床樣本的TAT，宏基因組測序和分析的速度亟需加快。如何提高測序速度是目前宏基因組發(fā)展的一個重要問題。

宏基因組是一個有活力的領(lǐng)域，運用宏基因組學(xué)技術(shù)進行病原監(jiān)測、檢測和溯源，應(yīng)對新突發(fā)傳染病疫情，成功打開了宏基因組學(xué)在公共衛(wèi)生和疾病防控領(lǐng)域的應(yīng)用大門，隨著高通量測序技術(shù)的不斷發(fā)展，宏基因組學(xué)分析流程和算法也不斷更新和完善。宏基因組學(xué)相關(guān)領(lǐng)域的應(yīng)用也正在受到越來越廣泛的關(guān)注。

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