湯建軍 林晶晶 韓小樂 李恒平△

（1.湖北醫(yī)藥學院附屬襄陽市第一人民醫(yī)院，湖北 襄陽 441000；2.湖北中醫(yī)藥大學附屬襄陽市中醫(yī)醫(yī)院，湖北 襄陽 441000）

急性胰腺炎（AP）是胰酶在胰腺內被過早激活引起胰腺自身消化的急性炎癥反應，輕者病情呈自限性且預后良好，約20%～30%患者可發(fā)展為重癥AP（SAP）［1-3］。 SAP 病情危重，進展迅速，易造成患者多器官功能衰竭，經積極治療病死率仍高達36%～50%。有研究顯示［4］AP期間胰腺細胞會發(fā)生自噬現象，調控自噬可能控制AP嚴重程度。Akt/mTOR（protein kinase B/mammalian target of rapamycin）通路是機體重要的信號轉導通路，研究發(fā)現［5］Akt/mTOR通路在炎癥反應如膿毒血癥過程中發(fā)揮關鍵調節(jié)作用，抑制Akt/mTOR通路可減輕炎癥反應。黃芩苷是從黃芩根中提取的黃酮類復合物，具有抗炎、利尿、抗變態(tài)等作用［6］。研究表明［7］黃芩苷可保護SAP時胰腺及其他臟器，但其具體保護機制尚未闡明。故本研究通過建立SAP大鼠模型，探究黃芩苷對SAP大鼠胰腺細胞自噬及Akt/mTOR通路的影響，以期為黃芩苷臨床應用提供指導。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級SD健康雄性大鼠80只，體質量250～300 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK（京）2017-0008，于 20～25 ℃室溫、30%～70%相對濕度、自然光照下分籠飼養(yǎng)1周，自由飲水、進食。

1.2 試藥與儀器 自噬雙標腺病毒mRFP-GFP-LC3（漢恒生物科技上海有限公司），善寧注射液（醋酸奧曲肽注射液，北京百奧藥業(yè)有限責任公司），黃芩苷標準品（北京索萊寶科技有限公司），α-淀粉酶測定試劑盒（上海晶抗生物工程有限公司），胰蛋白酶原激活肽（TAP）ELISA試劑盒（美國R△D公司），一抗羊抗鼠Akt、p-Akt單克隆抗體（美國 Santa Cruz公司），一抗兔抗鼠LC3-Ⅱ、mTOR、p-mTOR單克隆抗體（美國Abgent公司），二抗山羊抗兔IgG溶液（美國Sigma公司）。Biofuge 22R型高速低溫離心機（德國11ERAEUS公司），Leica-CM1950型恒冷切片機、Leica EG1160組織包埋機（德國徠卡公司）。

1.3 分組與造模 將大鼠隨機分為假手術組、模型組、善寧組和黃芩苷組各20只；每組又隨機分為3、6、12 h 3個亞組。所有大鼠均給予尾靜脈注射約2×109個自噬雙標腺病毒（mRFP-GFP-LC3），于動物房（室溫22～28℃，相對濕度40%～70%）中飼養(yǎng)1周。大鼠術前禁食12 h。先用3%戊巴比妥鈉（0.2 mL/100 g）腹腔麻醉，仰臥固定于手術臺，備皮消毒，于右后肢腹股溝內下方切開皮膚，游離右股靜脈，創(chuàng)建靜脈輸液通道。于大鼠腹部正中切口，暴露十二指腸乳頭處，用24號靜脈留置針穿透十二指腸外側壁，斜行進入腸管，并經十二指腸乳頭開口進入膽胰管0.5～1.0 cm，退出針芯，同時用顯微血管鑷夾閉膽管出肝門處，以防藥物返流肝臟。將微量輸液泵與留置針末端相連，以0.2 mL/min逆行注入3.5%牛磺膽酸鈉（0.1 mL/100 g）。最后將顯微血管鑷與留置針移去，常規(guī)縫合傷口。假手術組大鼠僅開腹翻動十二指腸與胰腺。造模后12 h，模型組、黃芩苷組大鼠各死亡1只，假手術組、善寧組大鼠均無死亡。

1.4 給藥方法 造模成功后10 min，善寧組大鼠向右股靜脈一次性推入善寧注射液2.5 μg/100 g，接著用微量輸液泵以速度 2.5 μg/（100 g·h） 連續(xù)靜脈輸入善寧注射液。黃芩苷組大鼠向右股靜脈一次性推入5%黃芩苷0.2 mL/100 g，接著用微量輸液泵以速度0.2 mL/（100 g·h）連續(xù)靜脈輸入5%黃芩苷。其余兩組大鼠給予等量生理鹽水。

1.5 標本采集與檢測 1）血清淀粉酶和TAP含量測定。大鼠靜脈給藥3、6、12 h后開胸，在心臟中快速抽血2 mL，靜止1 h后，于4℃、3000 r/min條件下離心10 min，取上清液，保存于-80℃冰箱。用α-淀粉酶測定試劑盒測定血清淀粉酶含量，用TAP ELISA試劑盒測定血清TAP含量。操作步驟參照試劑盒說明書。2）胰腺組織病理變化HE檢測。造模后于相應時間點處死各組大鼠，收集胰腺組織，固定于4%多聚甲醛溶液中24～48 h；脫水后石蠟包埋；用組織切片機以5 μm厚度切片，60℃恒溫箱中烤片3～5 h；切片用二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化；蘇木精液染色5 min；水沖洗后75%鹽酸乙醇分化30 s；水沖洗、乙醇處理后酸化伊紅溶液染色2 min；乙醇脫水、二甲苯透明；用中性樹膠封片、烘烤過夜。用倒置相差顯微鏡觀察并拍照。由2位資深病理醫(yī)師用雙盲法閱片，根據Schmidt評分標準［7］，對胰腺水腫、壞死、出血、炎癥程度進行綜合評分。3）胰腺腺泡細胞自噬免疫熒光觀察。將大鼠胰腺組織石蠟標本用30%蔗糖脫水48 h，浸沒于適量OCT包埋劑中，液氮迅凍成塊，注意切勿浸入液氮內。組織冰塊取出后用恒冷切片機以4～8 mm厚度冰凍切片。用0.5 mol/L Na2CO3-50%甘油封片，置于熒光顯微鏡下觀察并拍照。4）Western blot檢測 LC3-Ⅱ、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白表達。將大鼠胰腺組織剪成碎片，加入適量蛋白緩沖液，按常規(guī)方法提取蛋白，BCA法進行蛋白定量，調好蛋白濃度。每組取50 μg蛋白樣品，與上樣緩沖液等體積混合；80V恒壓10%SDS-PAGE電泳30 min，100 V恒壓電泳至溴酚藍剛出玻璃板底部時停止；轉至NC膜，于含5%脫脂奶粉TBST溶液中避光封閉1 h；將膜TBST漂洗后置于一抗稀釋液（Akt、p-Akt為 1∶200，LC3-Ⅱ、mTOR、p-mTOR 為 1∶300）中，4℃孵育過夜；次晨將膜TBST漂洗后置于二抗稀釋液（1∶3000）中，在搖床上室溫孵育 1 h；TBST 漂洗后滴加ECL發(fā)光液，曝光3次，選取重疊值。蛋白條帶灰度值用Image J軟件進行分析。用β-actin作為內參蛋白。

1.6 統(tǒng)計學處理 應用SPSS20.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；計數資料用“率”描述，用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠各時間點血清淀粉酶和TAP水平比較見表1。造模后3、6、12 h時間點，模型組、善寧組、黃芩苷組大鼠血清淀粉酶和TAP水平均顯著高于假手術組（P＜0.05），善寧組、黃芩苷組大鼠血清淀粉酶和TAP水平均顯著低于模型組（P＜0.05），黃芩苷組大鼠血清淀粉酶和TAP水平均顯著低于善寧組（P＜0.05）。

表1 各組大鼠各時間點血清淀粉酶和TAP水平比較（±s）

表1 各組大鼠各時間點血清淀粉酶和TAP水平比較（±s）

與假手術組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與善寧組比較，△P＜0.05。 下同。

血清淀粉酶（U/L） 血清 TAP（nmol/L）組 別 n 3 h 6 h 12 h 3 h 6 h 12 h假手術組 6 1438.52±318.20 1503.63±328.36 1524.69±268.57 0.66±0.08 0.72±0.07 0.65±0.10模型組 6 4839.64±1164.51*5264.28±763.22* 6157.35±683.34* 4.28±0.38*5.51±0.41*5.90±0.46*善寧組 6 3638.57±598.22*#4256.32±615.29*#4986.38±582.15*# 3.54±0.29*#4.33±0.42*#5.06±0.37*#黃芩苷組 6 2831.26±629.83*#△ 3134.98±546.46*#△ 3564.55±635.74*#△ 2.86±0.43*#△ 3.58±0.34*#△ 4.34±0.46*#△

2.2 各組胰腺組織病理學檢測 見圖1，表2。HE染色結果發(fā)現，假手術組大鼠胰腺腺泡細胞結構完整；模型組可觀察到腺泡水腫，腺泡結構遭受破壞，小葉間隔變寬，胰腺組織不同程度壞死、出血，病情隨時間的延長而加重；黃芩苷干預后大鼠胰腺組織損傷程度顯著降低。參照Schmidt評分標準，與假手術組相比，模型組、善寧組和黃芩苷組大鼠在各時間點胰腺組織損傷病理學評分均顯著升高（P＜0.05）。與模型組相比，善寧、黃芩苷干預后大鼠在各時間點胰腺組織損傷病理學評分顯著降低（P＜0.05）。與善寧組相比，黃芩苷干預后大鼠在各時間點胰腺組織損傷病理學評分顯著較低（P＜0.05）。

圖1 造模后12 h各組胰腺組織（HE染色，100倍）

表2 各組不同時間點胰腺組織損傷病理學評分比較（分，±s）

表2 各組不同時間點胰腺組織損傷病理學評分比較（分，±s）

組 別 n 12 h 3 h 6 h假手術組 4 0.51±0.17模型組 4 10.23±0.81*善寧組 4 8.41±0.69*#0.53±0.16 0.48±0.13 6.03±0.96* 8.78±0.57*4.78±0.84*# 7.03±0.72*#黃芩苷組 4 6.24±0.52*#△3.06±0.73*#△ 4.96±0.64*#△

2.3 各組大鼠胰腺腺泡細胞自噬免疫熒光觀察 圖2熒光顯微鏡結果顯示，與假手術組相比，模型組大鼠造模后3、6、12 h自噬流明顯增加，且隨著時間的延長自噬流越來越強。圖3顯示造模后12 h，模型組、善寧組和黃芩苷組大鼠胰腺自噬流綠色熒光顯著強于假手術組；善寧、黃芩苷干預后大鼠胰腺自噬流綠色熒光顯著低于模型組；黃芩苷干預后大鼠胰腺自噬流綠色熒光顯著低于善寧組。

圖2 模型組造模后胰腺組織自噬流變化（100倍）

圖3 造模后12 h各組大鼠胰腺組織自噬流變化（100倍）

2.4 各組大鼠胰腺組織自噬相關蛋白LC3-Ⅱ表達比較 見圖4，表3。Western blot結果顯示，造模后12 h，與假手術組相比，模型組大鼠胰腺組織LC3-Ⅱ蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）；善寧、黃芩苷干預后大鼠LC3-Ⅱ蛋白表達水平顯著低于模型組和假手術組（P＜0.05）；黃芩苷干預后大鼠LC3-Ⅱ蛋白表達水平顯著低于善寧組（P＜0.05）。

圖4 Westernblot檢測造模后12h大鼠胰腺組織LC3-Ⅱ蛋白表達

表3 造模后12 h各組大鼠胰腺組織LC3-Ⅱ蛋白相對表達灰度值（±s）

表3 造模后12 h各組大鼠胰腺組織LC3-Ⅱ蛋白相對表達灰度值（±s）

組 別 n LC3-Ⅱ假手術組 4模型組 4善寧組 4 0.241±0.009 0.382±0.023*0.236±0.014*#黃芩苷組 40.150±0.017*#△

2.5 各組大鼠胰腺組織 Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白表達比較 見圖5、表4。造模后12 h各組Akt、mTOR蛋白表達水平的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），與假手術組相比，模型組大鼠胰腺組織p-Akt、pmTOR蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）；善寧組、黃芩苷組大鼠p-Akt、p-mTOR蛋白表達水平顯著低于模型組（P＜0.05）；黃芩苷組大鼠 p-Akt、p-mTOR 蛋白表達水平顯著低于善寧組（P＜0.05）。

圖 5 Western blot檢測大鼠胰腺組織 Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白表達

3 討 論

牛黃膽酸鈉是膽汁的主要組分，向胰膽管注入該藥物后，可造成胰管膽汁返流，胰管上皮細胞遭受破壞，胰酶被誘導激活，導致SAP的發(fā)生［8-9］。本研究通過胰膽管逆行注射3.5%牛黃膽酸鈉的方法制備SAP模型，發(fā)現大鼠血清淀粉酶和TAP水平均顯著升高，且觀察到胰腺腺泡水腫、壞死、出血，說明SAP大鼠模型制備成功。

表4 各組大鼠胰腺組織Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白相對表達灰度值（±s）

表4 各組大鼠胰腺組織Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白相對表達灰度值（±s）

組別 n Akt p-Akt mTOR p-mTOR假手術組 6模型組 6善寧組 6 0.210±0.016 0.231±0.013 0.198±0.021 0.453±0.025*0.208±0.019 0.203±0.022#0.324±0.009 0.356±0.021 0.331±0.007 0.514±0.017*0.326±0.012 0.338±0.025#黃芩苷組 60.216±0.008 0.174±0.015*#△0.328±0.010 0.251±0.032**△

自噬是真核細胞特有的一種保護機制，可消化構型異常的蛋白質、多余或受損的細胞器，在細胞饑餓、損傷或其他不良環(huán)境下，生物體消化自身成分為細胞提供養(yǎng)分與能量［10-12］。自噬相關蛋白LC3在進化中高度保守，為自噬體產生的標志。LC3包括Ⅰ型與Ⅱ型，LC3-Ⅱ定位在自噬體膜的表面，參與自噬體的形成，常被用于衡量細胞自噬的程度［13-14］。本研究在造模前各組大鼠均給予尾靜脈注射自噬雙標腺病毒，結果發(fā)現造模后12 h模型組大鼠胰腺自噬流綠色熒光較假手術組顯著增強，胰腺組織LC3-Ⅱ表達水平較假手術組顯著升高。這反映出SAP時胰腺腺泡細胞的自噬情況加重，表明自噬在AP發(fā)病過程中發(fā)揮一定作用。

全身炎癥反應失控是引起SAP患者出現并發(fā)癥和死亡的重要原因［15］。中醫(yī)治療SAP主要湯藥有清胰湯、柴芩承氣湯，黃芩是其主要有效成分之一［16］。黃芩具有抗自由基、抗氧化以及抑制過氧化脂質產生的功能。黃芪苷是黃芪根中的重要活性成分，黃芪苷可用于治療 SAP，以減輕胰腺炎癥反應［17］。 研究發(fā)現［18-19］Akt/mTOR信號通路參與機體的炎癥反應過程，Akt作為一種絲蘇氨酸蛋白激酶，可協同磷脂酰肌醇依賴性蛋白激酶1/2促進三磷酸磷脂酰肌醇與其自身結合，Akt由胞漿轉移至質膜并發(fā)生磷酸化，被激活的Akt可活化下游蛋白mTOR。Akt/mTOR信號通路在細胞生長、增殖、分化、凋亡、自噬等生理過程中發(fā)揮重要作用［20］。本研究結果發(fā)現，黃芩苷組大鼠血清淀粉酶和TAP水平較模型組、善寧組均顯著降低，胰腺組織損傷程度明顯減輕，說明黃芩苷比善寧更能減輕SAP大鼠的病情；黃芩苷治療后大鼠胰腺自噬流綠色熒光較弱、胰腺組織LC3-Ⅱ表達水平顯著降低，表明黃芩苷治療比善寧更能緩解SAP大鼠胰腺細胞自噬程度；黃芩苷組大鼠胰腺組織p-Akt、p-mTOR表達水平較善寧組顯著降低，表明黃芩苷比善寧更能抑制Akt/mTOR信號通路。這些結果暗示黃芩苷可能通過抑制Akt/mTOR信號通路來減輕胰腺細胞自噬程度，且療效比善寧更好。

本研究結果發(fā)現SAP大鼠胰腺損傷組織中LC3-Ⅱ、p-Akt與p-mTOR表達水平顯著增加，黃芩苷治療后SAP大鼠胰腺水腫、壞死、出血程度明顯減輕，且大鼠胰腺損傷組織中LC3-Ⅱ、p-Akt與p-mTOR表達水平顯著降低，表明黃芩苷可能通過抑制Akt/mTOR信號通路來減輕胰腺細胞自噬程度，從而緩解SAP大鼠病情。

［1］中華醫(yī)學會外科學分會胰腺外科學組.急性胰腺炎診治指南（2014）［J］.中華消化外科雜志，2015，53（1）：50-53.

［2］Afghani E，Pandol SJ，Shimosegawa T，et al.Acute pancreatitis-progress and challenges：a report on an international symposium［J］.Pancreas，2015，44（8）：1195-1210.

［3］蘇曉琳，陳蘇寧.大承氣湯合大柴胡湯加減輔助治療急性中重癥胰腺炎的臨床觀察［J］.實用藥物與臨床，2017，20（5）：560-562.

［4］Ji L，Li L，Qu F，et al.Hydrogen sulphide exacerbates acute pancreatitis by over-activating autophagy viaAMPK/mTOR pathway［J］.Journal of Cellular Molecular Medicine，2016， 20（12）：2349-2361.

［5］Kim H，Banerjee N，Barnes RC，et al.Mango polyphenolics reduce inflammation in intestinal colitis-involvement of the miR-126/PI3K/AKT/mTOR axis in vitro and in vivo ［J］.Molecular Carcinogenesis，2017，56（1）：197-207.

［6］金琦，蔡天蕊，黃朔，等.黃芩對急性重癥胰腺炎大鼠肝損傷的預防及治療作用研究［J］.中國現代醫(yī)學雜志，2016，26（1）：18-23.

［7］李丹，鄭高明.黃芩苷對大鼠重癥急性胰腺炎腎損傷保護作用的研究［J］.中華中醫(yī)藥學刊，2015，33（10）：2476-2478.

［8］呂賓.中醫(yī)藥在重度急性胰腺炎治療中的應用［J］.中國醫(yī)師雜志，2015，33（2）：743-745.

［9］鄭曉博，陳光宇，黎鵬武，等.微量輸液泵應用于逆行胰膽管注射牛黃膽酸鈉大鼠重癥急性胰腺炎造模的效果研究［J］.西南軍醫(yī)，2013，15（3）：241-243.

［10］Pankiv S，Clausen TH，Lamark T，et al.p62/SQSTM1 binds directly to Atg8/LC3 to facilitate degradation of ubiquitinated protein aggregates by autophagy［J］.Journal of Biological Chemistry，2015，282（33）：24131-24145.

［11］徐建，宿冬遠，劉紹田，等.施他寧聯合烏司他丁治療重癥急性胰腺炎的療效及其對免疫功能、sTREM-1和sB7-H2水平的影響［J］.實用藥物與臨床，2016，19（4）：442-446.

［12］Mari?o G，Niso-Santano M，Baehrecke EH，et al.Self-consumption： the interplay of autophagy and apoptosis［J］.Nature Reviews Molecular Cell Biology，2014，15（2）：81-94.

［13］Noda NN，Inagaki F.Mechanisms of autophagy［J］.Annual Review of Biophysics，2015，44（1）：101-122.

［14］Jiang P，Mizushima N.LC3-and p62-based biochemical methods for the analysis of autophagy progression in mammalian cells［J］.Methods，2015，15（75）：13-18.

［15］秦敏.經鼻空腸管早期腸內營養(yǎng)在急性重癥胰腺炎中的研究進展［J］.中外醫(yī)療，2015，34（14）：197-198.

［16］岳小紅，廖莉.中西醫(yī)結合治療急性胰腺炎28例觀察［J］.實用中醫(yī)藥雜志，2015，31（4）：299-300.

［17］朱淵紅，王真，蔡宛如.黃芪注射液對大鼠重癥急性胰腺炎肺損傷的影響［J］.中華中醫(yī)藥學刊，2012，30（4）：758-759.

［18］Neri LM，Cani A，Martelli AM，et al.Targeting the PI3K/Akt/mTOR signaling pathway in B-precursor acute lymphoblastic leukemia and its therapeutic potential［J］.Leukemia，2014，28（4）：739-748.

［19］Wang F，Li H，Yan XG，et al.Alisertib induces cell cycle arrest and autophagy and suppresses epithelial-to-mesenchymal transition involving PI3K/Akt/mTOR and sirtuin 1-mediated signaling pathways in human pancreatic cancer cells［J］.Drug Design Development Therapy，2015，17（9）：575-601.

［20］歐陽軍，周躍鮮，李璽，等.PI3K/Akt/mTI3K/Akt/mOR信號通路在重癥急性胰腺炎致肝臟損傷中的作用［J］.中國普外基礎與臨床雜志，2015，22（5）：555-559.