王江栓 李變鋒 李 磊 張義丹 曹 靖 程 琦△

(漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校, 1 解剖學(xué)教研室, 2 第二附屬醫(yī)院, 漯河 462000； 3 鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室, 鄭州 450001)

奧沙利鉑是第3代鉑類抗癌藥物,是繼順鉑、卡鉑之后抗癌譜更廣、療效更好、副作用更低,且與順鉑和卡鉑之間無明顯交叉耐藥的鉑類抗腫瘤藥[1]。但是,隨著奧沙利鉑在臨床日益廣泛的應(yīng)用,其毒副作用,特別是神經(jīng)毒性的出現(xiàn),限制了其臨床應(yīng)用[2]。奧沙利鉑神經(jīng)毒性臨床表現(xiàn)主要為冷刺激誘發(fā)或加劇的肢體末端感覺異常,其發(fā)生機(jī)制目前仍不明確。研究表明,奧沙利鉑誘導(dǎo)的周圍神經(jīng)毒性癥狀可能是由于奧沙利鉑對(duì)細(xì)胞膜上陽離子通道的影響所致,本研究探索鉀通道是否參與奧沙利鉑所致疼痛的發(fā)生發(fā)展,以及利用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物嘗試促進(jìn)鉀通道表達(dá)的藥物緩解奧沙利鉑化療痛。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和模型建立

SPF清潔級(jí)、成年雄性SD大鼠(購(gòu)于河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心),體質(zhì)量180～220g,大鼠被安放在清潔開放的房間,在12h光照/黑暗的環(huán)境中飼養(yǎng),室溫維持在22～25℃,自由進(jìn)食水,采用雙盲法進(jìn)行相關(guān)行為學(xué)檢測(cè)。采用隨機(jī)方法把36只SD大鼠分成對(duì)照組和奧沙利鉑組。奧沙利鉑注射液購(gòu)于齊魯制藥(海南)有限公司(產(chǎn)品批號(hào)： 2A1E1510017B)；5%葡萄糖注射液購(gòu)于浙江濟(jì)民制藥有限公司(產(chǎn)品批號(hào)： 12050611)；奧沙利鉑注射液溶解于5%葡萄糖注射液中,以4.8mg/kg進(jìn)行腹腔注射,模擬臨床給藥時(shí)間點(diǎn)給藥,注射時(shí)間分別為第1、2、8、9、15、16、22天共7次。奧沙利鉑誘導(dǎo)周圍神經(jīng)病理性疼痛大鼠模型建立成功第15天給予氟吡汀灌胃(5、50mg/kg)。

1.2 行為學(xué)檢測(cè)

機(jī)械疼痛測(cè)試采用經(jīng)典的von-Frey纖毛,將纖毛通過金屬網(wǎng)眼垂直刺大鼠后足底中心皮膚,用力至彎曲成S形,每次刺激持續(xù)3～4s,觀察反應(yīng),大鼠在刺扎時(shí)間內(nèi)或在移開von、Frey針時(shí)出現(xiàn)快速的縮足或舔足反應(yīng),記為陽性。

足對(duì)有害熱退縮潛伏期測(cè)定用模型336鎮(zhèn)痛儀(美國(guó)),大鼠置于有機(jī)玻璃室的玻璃板上,輻射熱穿過玻璃板照射足底表面的中間。當(dāng)動(dòng)物抬腳時(shí),光束斷開,每一側(cè)每次試驗(yàn)重復(fù)5次,間隔為5min,無論有無陽性為避免組織損傷光束截止時(shí)間15s。

足對(duì)有害低溫退縮潛伏期(0℃)的測(cè)定用1個(gè)冷板,其被設(shè)置在0℃,足放置在平板開始計(jì)時(shí),至舔足和退縮終止,定義為冷刺激縮回潛伏期。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,每次時(shí)間間隔為10min。60s為截止時(shí)間,避免足底組織損傷。

1.3 獲取標(biāo)本

大鼠建模后在第3天、8天、15天采用10%的水合氯醛3.5ml/kg腹腔注射麻醉,取第4～5腰椎(L4～L5)背根神經(jīng)節(jié)(DRG)用于RT-PCR、免疫印跡、免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)。

1.4 RT-PCR

總RNA通過TRIzol法,oligo dT為通用引物,使用Thermo Script逆轉(zhuǎn)錄酶,兩步法RT。每個(gè)樣品3個(gè)復(fù)孔,根據(jù)目的基因設(shè)計(jì)特異性正向和反向引物。反應(yīng)在BIO-RAD CFX96實(shí)時(shí)PCR儀器中進(jìn)行。65℃～95℃溶解曲線,反應(yīng)完成后,Bio-Rad Prime PCR軟件分析熒光信號(hào)數(shù)據(jù),計(jì)算各反應(yīng)管Ct值。所得數(shù)據(jù)以GAPDH為內(nèi)參照,采用2-ΔΔCt方法計(jì)算各目的基因的相對(duì)表達(dá)。

1.5 免疫印跡檢測(cè)

冰上研磨組織,加入胞質(zhì)裂解緩沖液,低溫離心,上清為胞質(zhì)蛋白,蛋白質(zhì)濃度檢測(cè)；SDS-PAGE電泳(10% SDS分離膠)；免疫反應(yīng)(兔抗Kv1.2單克隆抗體,購(gòu)于以色列Alomone Labs公司,按1∶1000稀釋；兔抗β-actin單克隆抗體,購(gòu)于北京中杉生物科技公司,辣根過氧化物酶結(jié)合的山羊抗兔二抗購(gòu)于美國(guó)Jackson公司),曝光(美國(guó)Protein Simple FC-M型化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng))。

1.6 雙標(biāo)熒光免疫組織化學(xué)顯色

大鼠麻醉后,4%多聚甲醛灌注。獲取DRG后固定并逐步脫水,冷凍切片。0.01mol/L的PBS含有10%血清和0.3%的Triton X-100室溫下封閉1h,一抗(兔抗Kv1.2單克隆抗體)4℃過夜,0.01mol/L的PBS洗3遍,二抗(鼠抗CY3單克隆抗體購(gòu)于美國(guó)Jackson公司)室溫下1h。使用Leica DMI4000熒光顯微鏡拍照。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)的變化

奧沙利鉑組與對(duì)照組在給藥前行為學(xué)無差異。注射奧沙利鉑以后大鼠的機(jī)械痛閾值和冷覺痛閾值均開始減低,第8天開始2組大鼠機(jī)械痛閾值和冷覺痛閾值均差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),一直持續(xù)到第22天。而大鼠的熱覺痛閾值和體重兩者之間無明顯差異,提示奧沙利鉑的消化道不良反應(yīng)比較輕微(圖1)。

圖1 腹腔注射奧沙利鉑后,奧沙利(OXA)鉑組大鼠的機(jī)械閾值(A)

給予氟吡汀灌胃后可以緩解奧沙利鉑誘導(dǎo)的周圍神經(jīng)性疼痛,給予5mg/kg氟吡汀后機(jī)械痛閾值較奧沙利鉑組明顯增高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而冷覺痛閾值無明顯的變化。給予50mg/kg氟吡汀后機(jī)械痛閾值和冷覺痛閾值較奧沙利鉑組明顯增高,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2)。

圖2 奧沙利鉑(OXA)組大鼠灌胃給予5、50mg/kg氟吡汀后,兩種劑量

2.2 DRG中Kv1.2的變化

大鼠DRG中Kv1.2的mRNA和蛋白表達(dá)在給予奧沙利鉑后的第3天無明顯的變化,但在第8天和第15天均減低,與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3,P<0.01)。

2.3 大鼠DRG中Kv1.2的分布

在DRG神經(jīng)元中,Kv1.2與CGRP(傷害性肽能神經(jīng)元標(biāo)記物)、NF-200(有髓鞘的非傷害性感覺神經(jīng)元標(biāo)記物)、IB4(無髓鞘的傷害性感覺神經(jīng)元標(biāo)記物)共標(biāo),而與GS(膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物)不共標(biāo)(圖4，見封二)。

3 討論

奧沙利鉑是繼順鉑、卡鉑之后抗癌譜更廣、療效更好、副作用更低的鉑類抗癌藥[1-2]。眾多的臨床研究資料顯示,奧沙利鉑在在卵巢癌、胃癌、肺癌、胰腺癌等實(shí)體瘤的治療中都取得較好的治療效果[3-4],但是其神經(jīng)毒副作用嚴(yán)重限制了其臨床應(yīng)用,因此探明奧沙利鉑的神經(jīng)毒副作用的機(jī)制,找到可行的解決方案,將有可能幫助解決其臨床應(yīng)用的障礙。

奧沙利鉑誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性有兩種類型,一種是快速的急性感覺神經(jīng)病變,另一種通常發(fā)生幾個(gè)周期之后,為延遲的累積性的感覺神經(jīng)病變[5]。其中急性周圍神經(jīng)病變的發(fā)生率為86%～95%,以周圍神經(jīng)過度興奮為特征,臨床表現(xiàn)為冷刺激誘發(fā)或加劇的肢體末端感覺異常和感覺遲鈍,包括下巴痛、眼痛、注射藥物一側(cè)肢體痛、上瞼下垂、下肢痙攣以及視力和聲音改變等癥狀。這些癥狀在用藥后數(shù)小時(shí)即可出現(xiàn),24～48h為高峰期,一般持續(xù)7d左右[6]。奧沙利鉑所致慢性周圍神經(jīng)病變臨床表現(xiàn)為末梢感覺減退或感覺缺失、上下肢麻木等,嚴(yán)重時(shí)造成肢體功能障礙[7]。其發(fā)生率與劑量相關(guān),具有蓄積性和可逆性。蓄積性一方面表現(xiàn)為慢性神經(jīng)病變發(fā)生率隨劑量累積而增加,另一方面表現(xiàn)為相關(guān)癥狀的持續(xù)時(shí)間和嚴(yán)重程度隨劑量累積延長(zhǎng)和加重。

圖3 在奧沙利鉑組大鼠的DRG中8d、15d的Kv1.2

奧沙利鉑所致慢性周圍神經(jīng)病變的發(fā)生機(jī)制目前仍不明確,目前國(guó)內(nèi)外的研究表明,奧沙利鉑誘導(dǎo)的周圍神經(jīng)毒性癥狀是由于奧沙利鉑對(duì)細(xì)胞膜上陽離子通道的影響所致。神經(jīng)元細(xì)胞膜上陽離子通道包括鉀通道、鈣通道、鈉通道等[8-9]。其中鉀通道的活性與細(xì)胞膜的靜息電位密切相關(guān),是神經(jīng)元興奮性的重要決定因素[10]。抑制鉀通道可導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞的異位放電頻率增加,從而參與慢性疼痛的發(fā)生發(fā)展[11]。Li等[12]研究證明損傷DRG后伴隨Kv電流減少,說明鉀離子通道在DRG損傷引起的疼痛中起到至關(guān)重要的作用。有研究[13]表明坐骨神經(jīng)慢性壓榨性損傷(chronic constrictive injury， CCI)模型側(cè)的背根神經(jīng)節(jié)上的Kv通道的α亞基表達(dá)較對(duì)側(cè)顯著降低,提示DRG的Kv電流降低與神經(jīng)興奮性升高顯著相關(guān)。有報(bào)道[14]稱神經(jīng)元損傷后鉀離子電流的減少,會(huì)出現(xiàn)神經(jīng)興奮性增高進(jìn)而導(dǎo)致痛覺過敏。提示神經(jīng)病理性疼痛的產(chǎn)生可能與神經(jīng)元細(xì)胞上表達(dá)的鉀離子通道電流降低有密切關(guān)系。那么,鉀離子通道的變化是否與奧沙利鉑化療痛相關(guān)？

研究需要合適的動(dòng)物模型,本研究通過采用模擬臨床藥物應(yīng)用時(shí)間點(diǎn)給予大鼠注射藥物建立奧沙利鉑動(dòng)物模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示給予奧沙利鉑后,大鼠的機(jī)械閾值和冷覺閾值均出現(xiàn)明顯的降低,說明模型建立成功,而大鼠的體質(zhì)量無明顯的變化,說明奧沙利鉑的消化道毒性比較輕微,因此為研究其發(fā)生機(jī)制提供了較好的動(dòng)物模型。本實(shí)驗(yàn)在奧沙利鉑誘導(dǎo)的周圍神經(jīng)性疼痛大鼠模型中檢測(cè)到Kv1.2的mRNA和蛋白的表達(dá)量均降低,且存在時(shí)間依賴性。提示Kv1.2可能參與奧沙利鉑誘導(dǎo)的周圍神經(jīng)性疼痛,為臨床上預(yù)防和治療奧沙利鉑誘導(dǎo)的周圍神經(jīng)性疼痛提供新的靶點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)繼續(xù)嘗試鉀離子興奮藥物觀察是否緩解奧沙利鉑誘導(dǎo)的化療痛。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用鉀離子興奮劑氟吡汀灌胃治療,通過灌胃給予大鼠不同劑量的氟吡汀后,模型大鼠機(jī)械閾值和冷覺閾值明顯增高,并且50mg/kg的效果較5mg/kg的明顯,說明氟吡汀緩解奧沙利鉑誘導(dǎo)的周圍神經(jīng)性疼痛呈劑量依賴性,但是最佳劑量需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)探索。氟吡汀是一種鉀離子通道的興奮劑,可以降低神經(jīng)元的興奮性,穩(wěn)定膜電位,緩解奧沙利鉑導(dǎo)致鉀離子通道1.2的表達(dá)下降導(dǎo)致的鉀通道功能的降低,說明鉀離子通道在奧沙利鉑誘導(dǎo)周圍神經(jīng)性疼痛中起到重要的作用。

總之,Kv1.2在奧沙利鉑誘導(dǎo)的周圍神經(jīng)疼痛的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的作用,可能為臨床上預(yù)防和治療奧沙利鉑誘導(dǎo)的周圍神經(jīng)性疼痛提供新的靶點(diǎn)和新的方向。