周麗麗，劉賽璇，趙 楊，劉莎莎，王瑞婷，申興斌△

（1.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科，河北承德 067000；2.承德醫(yī)學(xué)院）

結(jié)直腸癌是常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，發(fā)病率和病死率均位居全部惡性腫瘤的第5位，嚴(yán)重威脅人類的健康。目前，結(jié)直腸癌的治療仍以手術(shù)和放化療為主，但傳統(tǒng)放化療藥物缺乏特異性，在殺傷惡性腫瘤細(xì)胞的同時(shí)也可以殺傷正常組織細(xì)胞，后期可因毒副作用大嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。因此，對(duì)于結(jié)直腸癌的治療仍需要尋找新的行之有效的方法，尋求治療結(jié)直腸癌的相關(guān)靶向位點(diǎn)及藥物一直是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。胰島素樣生長(zhǎng)因子-Ⅰ受體（insulin-like growth factor-Ⅰ receptor，IGF-ⅠR）可通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和代謝，參與腫瘤的進(jìn)程，已成為目前腫瘤治療的新靶點(diǎn)[1]，進(jìn)而探尋安全、低毒、高效的IGF-ⅠR抑制劑引起了眾多研究者的關(guān)注。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，鬼臼苦素是一種特異性的IGF-ⅠR酪氨酸激酶抑制劑，能有效阻斷IGF-ⅠR介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)，從而抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，而正常細(xì)胞的生長(zhǎng)不受影響[2]。有研究已證實(shí)[3-5]，鬼臼苦素在多發(fā)性骨髓瘤、葡萄膜黑色素瘤和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中顯示出具有抗腫瘤活性，但國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)有關(guān)鬼臼苦素對(duì)結(jié)直腸癌作用的研究報(bào)道。為此，本研究觀察了鬼臼苦素對(duì)人結(jié)直腸癌HCT-15細(xì)胞增殖的影響，以期為結(jié)直腸癌的臨床治療提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑和細(xì)胞：人結(jié)直腸癌HCT-15細(xì)胞株，購(gòu)自南京科佰生物科技有限公司。RPMI 1640及胰酶，購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；無(wú)支原體胎牛血清，購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司；PBS，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；鬼臼苦素（picropodophyllin，PPP），購(gòu)自上海皓元生物醫(yī)藥科技有限公司；CCK-8，購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所。

1.1.2 主要儀器：二氧化碳培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司），超凈工作臺(tái)（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司），倒置相差顯微鏡（德國(guó)Leica公司），全自動(dòng)酶標(biāo)儀ELX808（美國(guó)伯騰儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：將HCT-15細(xì)胞接種于含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，放置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3天傳代一次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 CCK-8法檢測(cè)鬼臼苦素對(duì)HCT-15細(xì)胞的抑制率：收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HCT-15細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為4×104/ml，均勻接種于96孔板，每孔100μl。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，棄掉原培養(yǎng)基，更換為含有鬼臼苦素濃度分別為0.125μmol/L、0.25μmol/L、0.5μmol/L、1μmol/L、2μmol/L、4μmol/L的RPMI 1640培養(yǎng)基，每孔200μl，同時(shí)設(shè)對(duì)照組（不加藥物）和空白組（只加RPMI 1640培養(yǎng)基），每組各設(shè)6個(gè)復(fù)孔。各組細(xì)胞分別培養(yǎng)24h、48h、72h后每孔加入10μ l CCK-8，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h，在450nm波長(zhǎng)處用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔的吸光度值（OD值），實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算不同藥物濃度對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率。抑制率（%）=（對(duì)照組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值）/（對(duì)照組OD值-空白組OD值）×100%，并計(jì)算IC50。

1.2.3 HCT-15細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察：收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HCT-15細(xì)胞，按每孔2×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板，放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)匯合約60%時(shí)，按1.2.2分別更換含不同濃度鬼臼苦素的RPMI 1640培養(yǎng)基，對(duì)照組不含藥物。鬼臼苦素作用48h后，在倒置顯微鏡下觀察各組HCT-15細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，統(tǒng)計(jì)分析采用析因方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HCT-15細(xì)胞的抑制率 與對(duì)照組相比，不同濃度鬼臼苦素作用于HCT-15細(xì)胞24h、48h、72h，HCT-15細(xì)胞的抑制率均明顯升高（P＜0.01，表1）。鬼臼苦素濃度在0.125μmol/L～2μmol/L范圍內(nèi)，隨著鬼臼苦素濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，HCT-15細(xì)胞的抑制率逐漸增加，且呈劑量-時(shí)間依賴性；鬼臼苦素的濃度和作用時(shí)間之間有顯著的交互作用（見(jiàn)表2，圖1）。

鬼臼苦素作用HCT-15細(xì)胞24h、48h、72h的IC50值分別為13.087μmol/L、0.377μmol/L、0.183μmol/L。

表1 不同濃度鬼臼苦素作用不同時(shí)間HCT-15細(xì)胞的抑制率（±s，%）

表1 不同濃度鬼臼苦素作用不同時(shí)間HCT-15細(xì)胞的抑制率（±s，%）

與對(duì)照組比較：aP＜0.01

培養(yǎng)時(shí)間24h 48h 72h對(duì)照組 0 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00組別 鬼臼苦素濃度（μmol/L）實(shí)驗(yàn)組0.125 3.65±0.39a 31.85±1.46a 41.53±0.44a 0.25 4.91±0.46a 43.07±2.42a 56.49±0.65a 0.5 6.35±1.07a 50.79±1.93a 74.34±0.42a 1 9.51±1.48a 64.38±0.83a 88.73±0.83a 2 17.92±0.85a 82.63±1.19a 93.92±1.92a 4 22.52±1.72a 86.04±1.24a 96.22±0.48a

表2 鬼臼苦素對(duì)HCT-15細(xì)胞濃度和時(shí)間主體間效應(yīng)的檢驗(yàn)

圖1 不同濃度鬼臼苦素作用不同時(shí)間對(duì)HCT-15細(xì)胞的抑制率

2.2 HCT-15細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化 倒置顯微鏡下觀察，對(duì)照組HCT-15細(xì)胞貼壁良好呈島嶼狀生長(zhǎng)，細(xì)胞之間連接緊密，透明度大、折光性好。鬼臼苦素作用于H C T-15細(xì)胞后，細(xì)胞失去原有狀態(tài)，大小不一、皺縮甚或碎裂，細(xì)胞脫離培養(yǎng)皿底部呈懸浮狀，折光性差，細(xì)胞間距變大，島嶼狀貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞數(shù)目減少；并且鬼臼苦素濃度越大、作用時(shí)間越長(zhǎng)，上述表現(xiàn)越明顯（圖2）。

圖2 不同濃度鬼臼苦素作用48h后對(duì)HCT-15細(xì)胞形態(tài)的影響（×100）

3 討論

IGF-ⅠR是由兩個(gè)α亞基和兩個(gè)β亞基組成的酪氨酸激酶受體，兩個(gè)亞基由二硫鍵連接，α亞基位于細(xì)胞外，β亞基在受體被激活后將信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)到胞內(nèi)。當(dāng)配體，主要是IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ與IGF-ⅠR的α亞基結(jié)合時(shí)，膜結(jié)合的β亞基胞內(nèi)部分酪氨酸殘基自動(dòng)磷酸化[6]；隨后，激活磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K/AKT）和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路，從而介導(dǎo)細(xì)胞的增殖、存活和分化[7]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)[8]，結(jié)直腸癌組織IGF-ⅠR蛋白的表達(dá)明顯高于腺瘤及正常結(jié)直腸黏膜，提示IGF-ⅠR可能與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程有關(guān)。因此，干擾IGF-ⅠR介導(dǎo)的信號(hào)通路可能是治療結(jié)直腸癌的另外一種選擇。

鬼臼毒素是鬼臼類植物中木脂素類化合物的代表，最早發(fā)現(xiàn)于美洲鬼臼（足葉草）。20世紀(jì)40年代證實(shí)鬼臼毒素具有抗癌活性，但由于毒副作用大，限制了鬼臼毒素在臨床的直接應(yīng)用[9]。多年以來(lái)，為得到更加高效、低毒的鬼臼毒素類抗癌藥物，研究者們一直致力于對(duì)鬼臼毒素的結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造和修飾。鬼臼苦素是鬼臼毒素的同分異構(gòu)體，具有順式內(nèi)酯環(huán)，對(duì)微管蛋白沒(méi)有抑制作用，故不具有細(xì)胞毒性。在一項(xiàng)國(guó)外進(jìn)行的臨床一期研究試驗(yàn)中，非小細(xì)胞肺癌患者采用鬼臼苦素治療7個(gè)月，能延緩癌癥患者的疾病進(jìn)展，并且非小細(xì)胞肺癌患者也對(duì)鬼臼苦素顯示出較好的耐受性[10]。此外，Vasilcanu等[11]也發(fā)現(xiàn)，惡性腫瘤細(xì)胞對(duì)鬼臼苦素幾乎不產(chǎn)生耐藥性，而且鬼臼苦素還能增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)傳統(tǒng)化療藥物的敏感性。但鬼臼苦素對(duì)結(jié)直腸癌是否同樣有效有待證實(shí)。

本研究發(fā)現(xiàn)，鬼臼苦素可明顯抑制人結(jié)直腸癌HCT-15細(xì)胞的增殖生長(zhǎng)，在0.125μmol/L～2μmol/L濃度范圍呈劑量-時(shí)間依賴性。鬼臼苦素濃度為2μmol/L作用48h、72h時(shí)，HCT-15細(xì)胞的抑制率可高達(dá)82.63%、93.92%，具有顯著的抑制效果。倒置顯微鏡下也觀察到鬼臼苦素作用48h后細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，濃度越大細(xì)胞形態(tài)變化越明顯。但鬼臼苦素對(duì)人結(jié)直腸癌HCT-15細(xì)胞發(fā)揮這一抑制作用的具體機(jī)制尚不清楚，仍需進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)以深入研究。