曾惠芬 戴衛(wèi)波 歐煥嬌

【摘要】 目的：觀察中藥復(fù)方素馨護(hù)肝方對膽汁淤積型大鼠T-BIL、D-BIL、I-BIL、TBA含量的影響，探討該復(fù)方防治肝內(nèi)膽汁瘀積的作用機(jī)制。方法：SD雄性大鼠40只，體重（200±10）g，根據(jù)體重隨機(jī)分為4組，即正常對照組、模型組、陽性藥熊去氧膽酸組、素馨護(hù)肝方組，每組10只，分籠飼養(yǎng)于屏障級動(dòng)物環(huán)境，自由飲水。給藥組給予相應(yīng)的藥物，模型組和正常對照組給予生理鹽水，連續(xù)灌胃4 d。實(shí)驗(yàn)第5天，除正常對照組外，其他各組一次性灌胃ANIT橄欖油，灌胃前12 h禁食不禁水，正常對照組灌胃等體積的橄欖油。造模4 h后各組給予相應(yīng)的藥物或生理鹽水。造模后給予相應(yīng)藥或水連續(xù)3 d，最后一次藥后1 h麻醉取樣后處死動(dòng)物，各動(dòng)物處死前禁食不禁水12 h?？崭谷⊙占闻K標(biāo)本。全自動(dòng)生化分析儀檢測血清中T-BIL、D-BIL、I-BIL、TBA的含量。結(jié)果：與模型組比較，素馨護(hù)肝方組血清T-BIL、D-BIL、I-BIL、TBA均顯著降低（P<0.01）。HE染色顯示，素馨護(hù)肝方組減少炎性細(xì)胞浸潤范圍和纖維細(xì)胞增生程度。結(jié)論：素馨護(hù)肝方能明顯抑制肝內(nèi)膽汁瘀積大鼠血清T-BIL、D-BIL、I-BIL、TBA水平，從而減輕肝細(xì)胞的損傷，這可能是其防治肝內(nèi)膽汁瘀積的重要機(jī)制之一。

【關(guān)鍵詞】 膽汁瘀積; 素馨護(hù)肝方; 血清膽紅素; 膽汁酸

【Abstract】 Objective：To observe the effects of Chinese herbal compound Suxin Hugan recipe on the levels of T-BIL，D-BIL，I-BIL and TBA in cholestasis rats，and to explore the role mechanism of compound recipe in preventing and treating intrahepatic cholestasis.Method：40 SD male rats weighing（200±10）g were randomly divided into 4 groups according to body weight，including normal control group，model group，positive ursodeoxycholic acid group and Suxin Hugan recipe group，10 rats in each group.They were fed in separate cages in barrier-level animal environment and were free to drink.Drug administration groups were given the corresponding drugs，and model group and normal control group were given normal saline，and they were continuously given intragastrical administration for 4 d.On the 5th day of the experiment，the other groups were intragastrically administered with ANIT olive oil except for normal control group，and they were fasted for 12 h and free to water before the intragastrical administration，and normal control group was given an equal volume of olive oil.After 4 h of modeling，each group was given the corresponding drug or normal saline.After modeling，they were given corresponding drug or water continuously for 3 d，and the animals were sacrificed at 1 h after the last administration，and the animals were fasted for 12 h and free to water before being sacrificed.Blood was taken on an empty stomach and liver specimens were collected.The levels of T-BIL，D-BIL，I-BIL and TBA in serum were detected by automatic biochemical analyzer.Result：Compared with model group，Suxin Hugan recipe group significantly reduced the levels of serum T-BIL，D-BIL，I-BIL and TBA（P<0.01）.HE staining showed that Suxin Hugan recipe group reduced the extent of inflammatory cell infiltration and the degree of fibroblast proliferation.Conclusion：Suxin Hugan recipe can significantly inhibit the levels of serum T-BIL，D-BIL，I-BIL and TBA in rats with intrahepatic cholestasis，thus reducing the damage of hepatocytes，which may be the one of important role mechanisms of prevention and treatment of intrahepatic cholestasis.

【Key words】 Cholestasis; Suxin Hugan recipe; Serum bilirubin; Bile acidFirst-authors address：Xiaolan Hospital Affiliated to Southern Medical University，Zhongshan 528415，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.15.006

肝內(nèi)膽汁淤積（intrahepatic cholestasis，IC）屬黃疸病范疇，是指膽汁的生成和/或膽汁內(nèi)容質(zhì)排出障礙，如體內(nèi)膽汁中的膽酸、膽紅素、膽固醇等物質(zhì)排出進(jìn)入血液，并不斷堆積，導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷[1]。肝內(nèi)膽汁淤積后高膽紅素血癥和高膽汁酸血癥可導(dǎo)致肝臟細(xì)胞損傷或凋亡，誘發(fā)肝纖維化或肝硬化[2]。素馨護(hù)肝方是本院應(yīng)用十余年的臨床協(xié)定驗(yàn)方，具有清熱祛濕、利膽退黃、舒肝止痛的功效，在急慢性肝炎、膽囊炎、脂肪肝等病癥的治療上千例，有較好的臨床療效。本研究擬通過肝內(nèi)膽汁淤積型大鼠模型觀察血清總膽紅素（T-BIL）、直接膽紅素（D-BIL）、間接膽紅素（I-BIL）、總膽汁酸（TBA）含量，以及肝組織病理變化，探討本方治療肝內(nèi)膽汁淤癥的作用機(jī)制、臨床療效與安全性，為進(jìn)一步開發(fā)和臨床應(yīng)用本方提供可靠的依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試藥 素馨護(hù)肝方（由素馨花、茵陳、白芍、夏枯草、車前草等組成）由南方醫(yī)科大學(xué)附屬小欖醫(yī)院中藥房提供。熊去氧膽酸膠囊（生產(chǎn)廠家：Losan Pharma GmbH，批號15A10039L，規(guī)格：250 mg），1%α-萘異硫氰酸酯（ANIT，生產(chǎn)廠家：河北北化恒業(yè)精細(xì)化學(xué)品），橄欖油（生產(chǎn)廠家：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號F20100512，），水合氯醛（生產(chǎn)廠家：天津市福晨化學(xué)試劑廠，批號20090207），甲醛溶液（生產(chǎn)廠家：廣東汕頭市西隴化工股份有限公司，批號1506182）。血清中T-BIL、D-BIL、I-BIL、TBA由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心生化分析儀檢測。

1.1.2 儀器 數(shù)碼顯微鏡（型號：BK-DM500型數(shù)碼生物顯微鏡，生產(chǎn)廠家：重慶奧體光學(xué)顯微鏡有限公司）、切片機(jī)（型號：LEICA2015-RM型切片機(jī)，生產(chǎn)廠家：德國徠卡有限公司）。

1.1.3 動(dòng)物 雄性SD大鼠，200 g左右，購于廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號：SCXK（粵）2013-0034。

1.2 方法

1.2.1 藥物的制備

1.2.1.1 素馨護(hù)肝方煎劑制備 按組方比例稱取各藥材292 g，水煎煮2次，大鼠臨床等效劑量為12.42 g/kg，配成生藥濃度0.621 g/mL，大鼠按體重給藥體積2 mL/100 g進(jìn)行給藥。

1.2.1.2 陽性藥制備 取熊去氧膽酸膠囊粉末用生理鹽水溶解，按給藥劑量100 mg/kg，給藥體積2 mL/100 g大鼠體重，配制成藥物濃度5 mg/mL進(jìn)行給藥。

1.2.1.3 造模劑制備 1% ANIT橄欖油溶液，稱取1.2 g ANIT溶于120 mL橄欖油中。

1.2.2 分組與給藥 SD雄性大鼠40只，體重（200±10）g，根據(jù)體重隨機(jī)分為4組，即正常對照組、模型組、陽性藥熊去氧膽酸組、素馨護(hù)肝方組，每組10只，分籠飼養(yǎng)于屏障級動(dòng)物環(huán)境，自由飲水。陽性藥熊去氧膽酸組和素馨護(hù)肝方組給予相應(yīng)的藥物，模型組和正常對照組給予生理鹽水，連續(xù)灌胃4 d。

1.2.3 造模方法 實(shí)驗(yàn)第5天，除正常對照組外，其他各組一次性灌胃ANIT橄欖油，灌胃前12 h禁食不禁水，正常對照組灌胃等體積的橄欖油[3]。造模4 h后各組給予相應(yīng)的藥物或生理鹽水。造模后給予相應(yīng)藥物或生理鹽水連續(xù)3 d，最后一次給藥后1 h麻醉取樣后處死動(dòng)物，各動(dòng)物處死前禁食不禁水12 h。

1.2.4 樣品采集與檢測

1.2.4.1 血清檢測 末次給藥1 h后，水合氯醛麻醉，腹主動(dòng)脈采血兩管，3 500 r/min離心5 min，分離血清，全自動(dòng)生化分析儀檢測血清中T-BIL、D-BIL、I-BIL、TBA的含量。

1.2.4.2 肝組織病理學(xué)檢測 切取肝右葉組織10%甲醛固定，包埋切片，HE染色，觀察肝細(xì)胞情況、纖維化程度、炎性細(xì)胞浸潤情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，配對設(shè)計(jì)資料采用配對t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對血清膽紅素和膽汁酸含量的影響 模型組大鼠血清T-BIL、D-BIL、I-BIL、TBA值均顯著高于正常對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=10.331、11.125、10.265、17.175，P=0.001、0.001、0.001、0.001）;與模型組比較，素馨護(hù)肝方組和熊去氧膽酸組藥后對血清T-BIL、D-BIL、I-BIL、TBA均有顯著降低作用，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（素馨護(hù)肝方組：t=8.465、7.126、9.351、9.784，P=0.001、0.001、0.001、0.001;熊去氧膽酸組t=9.745、8.987、8.362、8.792，P=0.001、0.001、0.001、0.001）。見表1。

2.2 肝組織病理學(xué)檢測 HE染色顯示，正常對照組肝細(xì)胞排列整齊，未見細(xì)胞腫脹、壞死及炎性細(xì)胞浸潤，細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰;ANIT誘發(fā)的膽汁淤積性模型大鼠肝組織細(xì)胞可見明顯壞死，膽小管上皮細(xì)胞腫脹明顯，可見成纖維細(xì)胞和炎性細(xì)胞浸潤，壞死區(qū)域發(fā)生纖維化改變;素馨護(hù)肝方組和熊去氧膽酸組均可明顯減輕肝細(xì)胞損傷程度，減少炎性細(xì)胞浸潤范圍和纖維細(xì)胞增生程度。見圖1。

3 討論

肝內(nèi)膽汁淤積（intrahepatic cholestasis，IC）又稱之為膽汁淤積綜合征，指肝細(xì)胞分泌排泄膽汁障礙，引起肝內(nèi)膽汁淤積和血液中膽汁成分增加，但患者膽道并無明顯堵塞，在脂肪性和酒精性肝病，病毒性肝炎，藥物性肝損害等肝病均可誘發(fā)，是加速發(fā)展為肝硬化的重要因素之一。類似于中醫(yī)“黃疸”，肝膽疏泄失常，膽汁外溢[4]，表現(xiàn)為血清ALT、AST、ALP、γ-GGT等轉(zhuǎn)氨酶及T-BIL、D-BIL、I-BIL、TBA等血清中膽紅素、膽汁酸水平升高。肝內(nèi)膽汁淤積癥在中醫(yī)系統(tǒng)應(yīng)屬“黃疸”病之范疇，中醫(yī)觀點(diǎn)認(rèn)為膽汁淤積的主要病變特點(diǎn)就是膽汁排泄不暢，通過調(diào)整肝膽脾胃氣機(jī)，疏降膽氣，祛除郁積之邪氣，使膽汁排泄有道，膽氣條達(dá)疏泄，氣機(jī)升降恢復(fù)至正常。

本研究所用素馨護(hù)肝方由素馨花、茵陳、白芍、夏枯草、車前草等10味藥物組成，全方作為本院臨床驗(yàn)方，具有清熱祛濕、利膽退黃、舒肝止痛的功效，正符合肝內(nèi)膽汁淤積癥“利濕退黃”的治療機(jī)制[5-10]。

淤膽型肝炎實(shí)驗(yàn)室檢查的主要指標(biāo)是肝功能，其中包括血清膽紅素、膽汁酸。膽紅素主要來源于體內(nèi)衰老的紅細(xì)胞，紅細(xì)胞分解釋放出血紅蛋白，在肝、脾及骨髓的單核一吞唾細(xì)胞系統(tǒng)中被分解和破壞而生成膽紅素。非結(jié)合膽紅素增高是由生產(chǎn)過多、攝取障礙或結(jié)合膽紅素生成異常所致。淤膽型肝炎主要以直接膽紅素升高為主[11-15]。ANIT既損傷肝細(xì)胞，又損傷膽管細(xì)胞，引起血液中膽紅素和轉(zhuǎn)氨酶急劇升高，膽汁流量減少，炎性細(xì)胞增加以及肝細(xì)胞壞死，相似于人類肝內(nèi)膽汁淤積的病理改變，可作為退黃藥物研究模型[16-20]。

本研究擬通過對肝內(nèi)膽汁淤積型大鼠急性肝內(nèi)膽汁淤積進(jìn)行干預(yù)，研究結(jié)果顯示素馨護(hù)肝方能明顯緩解肝內(nèi)膽汁淤積大鼠的肝細(xì)胞損傷，降低其血清中T-BIL、D-BIL、I-BIL、TBA水平含量。提示素馨護(hù)肝方對ANIT誘發(fā)的大鼠急性肝內(nèi)膽汁淤積所造成的急性肝損傷有明確的保護(hù)作用。

參考文獻(xiàn)

[1] Kosters A，Karpen S J.The role of inflammation in cholestasis clinical and basic aspects[J].Semin Liver Dis，2010，30（2）：186-194.

[2]肖莉，葉放.論清化濕熱瘀毒法是基于張仲景黃疸理論的重要治法[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2011，30（4）：733-734.

[3]陸云飛，劉成，陳曉蓉，等.消黃方對α-萘異硫氰酸酯大鼠黃疸模型肝組織氧化應(yīng)激的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志，2012，27（2）：460-462.

[4]陽麗梅，黃旭慧，曹娃，等.苦參堿對α-萘異硫氰酸酯誘導(dǎo)的大鼠膽汁淤積性肝損傷的作用[J].中國藥學(xué)雜志，2018，53（10）：783-787.

[5]《全國中草藥匯編》編寫組.全國中草藥匯編（下冊）[M].2版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2000.

[6]江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典（上冊）[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1977.

[7]譚梅傲，康錦花，佘世鋒，等.茵梔黃注射液對膽汁淤積性肝炎大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)及FXR基因表達(dá)的影響[J].廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2018，35（3）：466-470.

[8]張廣玉，張玉峰，汪偉，等.利膽退黃湯對ANIT誘導(dǎo)的膽汁淤積型黃疸模型大鼠的治療作用[J].新中醫(yī)，2018，50（6）：1-5.

[9]龍安予，鄭俊霞，劉蕊.垂盆草苷對實(shí)驗(yàn)性幼年大鼠肝內(nèi)膽汁淤積的干預(yù)作用[J].遼寧醫(yī)學(xué)雜志，2018，53（2）：23-25.

[10]王菊平，李小芹，李永春.五味子甲素對急性肝內(nèi)膽汁淤積大鼠肝功能的保護(hù)作用研究[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2018，14（6）：32-33.

[11]李曉玲，孫鳳霞，王曉靜，等.復(fù)方茵丹湯對大鼠急性肝內(nèi)膽汁淤積的干預(yù)作用[J].中國中西醫(yī)結(jié)合消化雜志，2014，22（9）：497-500.

[12]楊擎，曲曉波，李輝，等.五味子化學(xué)成分與藥理作用研究進(jìn)展[J].吉林中醫(yī)藥，2015，35（6）：626-628.

[13]溫延麗，張振武，張興威.中西醫(yī)結(jié)合治療妊娠肝內(nèi)膽汁淤積癥臨床分析[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2014，10（13）：87-88.

[14]歐巧群，錢新華，黃笑群，等.ANIT誘導(dǎo)大鼠亞急性肝內(nèi)膽汁淤積的生化和病理變化[J].胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志，2015，24（4）：463-465.

[15]謝敬東，趙鋼德，謝青，等.丁二磺酸腺苷蛋氨酸治療膽汁淤積性肝炎的臨床療效[J].肝臟，2013，18（8）：550-552.

[16]高宇，柴進(jìn)，李紹雪，等.川西獐牙菜醇提物對內(nèi)毒素所致大鼠膽汁淤積性肝損傷的保護(hù)作用[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，36（8）：769-773.

[17]韓平，田德安.肝內(nèi)膽汁淤積發(fā)病機(jī)制及藥物治療新進(jìn)展[J].胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志，2016，25（5）：584-588.

[18] Cullen J M，F(xiàn)aiola B，Melich D H，et al.Acute alpha-naphth-ylisothiocyanate-induced liver toxicity in germfree and conventional male rats[J].Toxicologic Pathology，2016，44（7）：987-997.

[19] Golbar H M，Izawa T，Bondoc A，et al.Attenuation of alphanaphthylisothiocyanate（ANIT）-induced biliary fibrosis bydepletion of hepatic macrophages in rats[J]Exp Toxicol Pathol，2017，69（4）：221-230.

[20] Watashi K，Urban S，Li W，et al.NTCP and beyond：opening the door to unveil hepatitis B virus entry[J].International Journal of Molecular Sciences，2014，15（2）：2892-2905.

（收稿日期：2019-01-23） （本文編輯：程旭然）