李 穎，丁 淵，陳麗麗，許 浩

(浙江省杭州市第一人民醫(yī)院中醫(yī)科 310006)

世界范圍內(nèi)孕婦出現(xiàn)子癇前期的比例為5%～20%，高齡偏胖的孕婦、有家族遺傳史的孕婦及自身合并內(nèi)科疾病的孕婦為好發(fā)群體，發(fā)病與遺傳、環(huán)境等多種因素相關(guān)[1]。該病對(duì)母體及胎兒的危害較大，嚴(yán)重者危及生命，臨床上一般通過(guò)規(guī)范產(chǎn)檢來(lái)提前診斷，也可在孕早期補(bǔ)充鈣劑有效預(yù)防。免疫耐受是子癇前期發(fā)病機(jī)制之一，CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞在機(jī)體的免疫耐受中起重要作用，同時(shí)有學(xué)者在體外試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，雌激素可促進(jìn)Foxp3的表達(dá)[2]。本研究針對(duì)子癇前期患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞和雌三醇變化進(jìn)行研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年1月至2017年7月本院就診的50例子癇前期患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合子癇前期的診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]；(2)初產(chǎn)婦，且無(wú)相關(guān)產(chǎn)科并發(fā)癥；(3)心、肝、腎等器官無(wú)重大疾病；(4)無(wú)血液系統(tǒng)疾病及免疫治療史；(5)所有患者對(duì)本次研究知情并簽署同意書(shū)。根據(jù)病情不同將患者分為輕度子癇前期組(24例)和重度子癇前期組(26例)，輕度子癇前期組平均年齡(30.16±4.57)歲，平均孕周(36.15±4.09)周；重度子癇前期組平均年齡(31.25±5.21)歲，平均孕周(35.69±4.97)周；選取同期健康孕婦25例為對(duì)照組，平均年齡(30.67±4.39)歲，平均孕周(35.98±4.43)周。3組一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1試驗(yàn)方法 所有患者入組后第2天晨起抽取空腹肘靜脈血5 mL，Treg流式檢測(cè)步驟如下：(1)提取，使用淋巴細(xì)胞分離液制備外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)；(2)洗滌，使用PBS洗滌后制備PBMCs懸液；(3)染色，首先進(jìn)行細(xì)胞表面染色，將3 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)滴加至200 μL 外周血PBMCs懸液中，1 500 r/min離心5 min后去除上清液，再將15 μL的異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的CD4抗體和藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的CD25抗體滴加至500 μL PBS重懸稀釋到1×106個(gè)/mL的細(xì)胞中。室溫下避光30 min，加入2 mL冷PBS，重復(fù)1 500 r/min離心5 min。然后進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)染色，于室溫避光條件下孵育2 h，將2 mL透膜緩沖液滴加至破膜劑重懸細(xì)胞中，離心洗滌后加入15 μL的PE-Cy5標(biāo)記的Foxp3抗體，室溫下避光30 min，加入2 mL PBS，1 500 r/min離心5 min，最后加入500 μL PBS重懸；(4)上機(jī)檢測(cè)，設(shè)置相應(yīng)對(duì)照管，采用BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)檢測(cè)。

表1 3組外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞情況比較

圖1 流式細(xì)胞儀分選圖

表2 外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg比例及PBMCs Foxp3 mRNA水平比較

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time PCR，RT-PCR)檢測(cè)PBMCs Foxp3 mRNA表達(dá)情況，具體步驟如下：取上述實(shí)驗(yàn)制備的PBMCs，PBS洗滌1次后去除PBS，加入Trizol液1 mL，收集細(xì)胞并提取總RNA，利用分光光度計(jì)測(cè)量A260/A280，最終計(jì)算RNA樣品的濃度及純度。合成少量cDNA作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為20 μL，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。以磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參，通過(guò)比較CT值計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)水平。GAPDH和Foxp3的引物序列參考文獻(xiàn)[4]。

另取各組孕婦晨起8：00空腹肘靜脈血5 mL，經(jīng)抗凝離心后獲得血漿，按照游離雌三醇定量檢測(cè)試劑盒(河南美凱生物科技有限公司，規(guī)格:48份/盒)采用順磁性顆粒化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定法操作測(cè)定患者外周血中游離雌三醇的水平。

1.2.2觀察指標(biāo) CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞絕對(duì)數(shù)、CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4+T比例、PBMCs Foxp3 mRNA表達(dá)水平及患者外周血中游離雌三醇的水平。

2 結(jié)果

2.13組外周血CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞情況比較 輕度子癇前期組和重度子癇前期組的CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞絕對(duì)數(shù)和CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4+T均低于對(duì)照組(P<0.05)。同時(shí)，重度子癇前期組的CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞絕對(duì)數(shù)和CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4+T比例均低于輕度子癇前期組(P<0.05)，見(jiàn)表1、圖1。

2.23組PBMCs Foxp3 mRNA情況 輕度子癇前期組與重度子癇前期組PBMCs Foxp3 mRNA水平較對(duì)照組明顯降低，而重度子癇前期組低于輕度子癇前期組(P<0.05)。子癇前期患者的CD4+CD25+Foxp3+Treg比例及PBMCs Foxp3 mRNA水平呈正相關(guān)(r=0.779,P<0.05)，見(jiàn)表2、圖2。

圖2 CD4+CD25+Foxp3+Treg比例與PBMCs Foxp3 mRNA水平的線性相關(guān)圖

2.33組血清雌三醇情況比較 輕度子癇前期組[(6.17±2.15)mg/L]和重度子癇前期組[(3.28±1.12)mg/L]血清雌三醇均低于對(duì)照組[(11.32±2.45)mg/L，F(xiàn)=15.279,P<0.05]；同時(shí)，輕度子癇前期組血清雌三醇高于重度子癇前期組(P<0.05)。子癇前期患者的CD4+CD25+Foxp3+Treg比例與血清雌三醇水平呈正相關(guān)(r=0.584,P<0.05)，見(jiàn)圖3。

圖3 CD4+CD25+Foxp3+Treg比例與血清雌三醇水平的線性相關(guān)圖

3 討論

子癇前期是妊娠期婦女特有且較為常見(jiàn)的一種疾病，又稱先兆子癇，即在高血壓的情況下出現(xiàn)抽搐癥狀[5]，我國(guó)發(fā)病率約在9%，孕產(chǎn)婦病死率占到妊娠相關(guān)死亡人數(shù)的10%～16%，是造成孕產(chǎn)婦死亡的第2大原因[6]。在疾病早期，患者可能無(wú)癥狀或出現(xiàn)輕度血壓升高、輕度蛋白尿伴水腫，重度患者會(huì)出現(xiàn)頭暈眼花、惡心嘔吐、明顯血壓升高、蛋白尿增多等現(xiàn)象，甚至抽搐昏迷，危及生命[7-8]。目前臨床上一般根據(jù)患者的臨床癥狀、超聲心動(dòng)圖、胎心監(jiān)護(hù)、腦CT或磁共振(MRI)等檢查及遺傳病史來(lái)進(jìn)行診斷治療，通過(guò)合理使用硝苯地平等降壓藥進(jìn)行降壓治療，用硫酸鎂解痙，臥床休息甚至終止妊娠等方式來(lái)盡可能降低患者死亡率，保護(hù)母嬰健康。在孕早期及時(shí)補(bǔ)充鈣劑也是有效預(yù)防措施之一[9]。

子癇前期被認(rèn)為是母體免疫系統(tǒng)對(duì)滋養(yǎng)層父系來(lái)源的抗原異常反應(yīng)的結(jié)果，胚胎成功生長(zhǎng)的關(guān)鍵是免疫耐受，而母體對(duì)胚胎無(wú)法產(chǎn)生足夠的免疫耐受是子癇前期的發(fā)病機(jī)制之一[10-11]。由于CD4+CD25+Treg細(xì)胞有著抑制機(jī)體免疫活性的強(qiáng)大功能，所以它在免疫耐受中扮演著重要角色，也是內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的守護(hù)者，能夠有效抑制機(jī)體對(duì)異體物質(zhì)的排斥[12-13]。目前臨床上已無(wú)輕度子癇前期的診斷，為了便于本次研究，仍將患者根據(jù)病情輕重分為輕度和重度，從結(jié)果來(lái)看，重度子癇前期組CD4+CD25+Treg細(xì)胞比例明顯低于輕度子癇前期組和對(duì)照組(P<0.05)，輕度子癇前期組CD4+CD25+Treg細(xì)胞比例也顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，也就是說(shuō)CD4+CD25+Treg細(xì)胞與子癇前期的發(fā)病機(jī)制具有相關(guān)性。

Foxp3是一種存在于細(xì)胞質(zhì)的轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)CD4+CD25+Treg細(xì)胞起到控制作用[14]，同時(shí)CD4+CD25+Treg細(xì)胞受Foxp3 mRNA和其轉(zhuǎn)錄蛋白質(zhì)的特異性作用。正常情況下妊娠早期CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞顯著增加，中期稍弱，分娩后顯著減少，但孕婦處于子癇前期會(huì)導(dǎo)致該細(xì)胞水平降低，降低程度受病情嚴(yán)重影響[15]。如本研究結(jié)果中，輕度子癇前期組與重度子癇前期組的CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞絕對(duì)數(shù)、CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4+T細(xì)胞、CD4+CD25+Foxp3+Treg比例均低于對(duì)照組(P<0.05)，同時(shí)，重度子癇前期組患者指標(biāo)均低于輕度子癇前期組(P<0.05)。子癇前期患者的CD4+CD25+Foxp3+Treg比例及PBMCs Foxp3 mRNA水平呈正相關(guān)。此外，雌激素水平在妊娠過(guò)程中發(fā)揮重要作用，可通過(guò)調(diào)節(jié)免疫耐受影響孕婦的妊娠結(jié)局[16]。在體外實(shí)驗(yàn)中，研究發(fā)現(xiàn)雌激素還可通過(guò)對(duì)性腺軸的調(diào)節(jié)增加Foxp3水平，同時(shí)使CD4+CD25+Treg細(xì)胞數(shù)量增多，但具體機(jī)制尚未闡明，有學(xué)者推測(cè)雌激素對(duì)免疫功能的調(diào)節(jié)作用可能通過(guò)調(diào)節(jié)Foxp3 等諸多轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)而完成[17]。雌三醇可抑制妊娠期T細(xì)胞的明顯偏移，增強(qiáng)其活性，促進(jìn)功能，作用也是舉足輕重。而本研究也證明輕度子癇前期組和重度子癇前期組血清雌三醇顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，同時(shí)，輕度子癇前期組血清雌三醇也明顯高于重度子癇前期組(P<0.05)，證實(shí)了子癇前期狀態(tài)下CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞數(shù)和雌三醇水平出現(xiàn)顯著下降，在相關(guān)性分析中發(fā)現(xiàn)子癇前期患者的CD4+CD25+Foxp3+Treg比例與血清雌三醇水平呈正相關(guān)，但二者間的作用機(jī)制有待進(jìn)一步探究。

綜上所述，子癇前期患者CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞明顯減少，同時(shí)血清雌三醇也有所下降，這可能與子癇前期的發(fā)病機(jī)制及免疫耐受有關(guān)。CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞在子癇前期的發(fā)病機(jī)制中占據(jù)重要地位，后續(xù)研究應(yīng)進(jìn)一步探究子癇前期的發(fā)病機(jī)制，為臨床防治提供理論依據(jù)。