韋汝珍

（柳州市工人醫(yī)院，廣西 柳州）

0 引言

Kirston-ras癌基因(簡(jiǎn)稱K-ras基因)在直腸癌（cancer of the rectum，CRC）的發(fā)生發(fā)展中起重要的作用，越來(lái)越多的研究表明，西妥昔單抗（Cetuximab，C225）治療K-ras基因野生型結(jié)直腸癌患者敏感，而對(duì)突變型無(wú)效。因此，檢測(cè)K-ras基因狀態(tài)對(duì)指導(dǎo)結(jié)直腸癌患者靶向治療十分重要。我們通過(guò)實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)K-ras基因的總體突變率，為結(jié)腸癌患者的基因診斷，個(gè)體化治療的開(kāi)展提供一個(gè)數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料收集

收集2011年1月至2013年12月的 375例結(jié)直腸癌石蠟組織標(biāo)本。通過(guò)檢測(cè)結(jié)腸癌患者K-ras基因狀態(tài)統(tǒng)計(jì)其突變率。所有檢測(cè)均取得患者的知情同意。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

PCR及測(cè)序引物，采用PyroMark ID型Pyrosequencing焦磷酸測(cè)序儀（瑞典Biotage AB公司產(chǎn)）配套的引物分析軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)，由生工生物工程（上海）有限公司合成。PCR上游引物為ATGACTGAATATAAACTTGTGGTA，下游引物為Biotin-TTGGATCATATTCGTCCACAAA，PCR擴(kuò)增片段為103bp，測(cè)序引物為TTGTGGTAGTTGGAGCT。

1.3 PCR擴(kuò)增

按照GTpure FFPE組織DNA提取試劑盒操作步驟，從石蠟切片中抽提基因組DNA，試劑盒購(gòu)自基因科技（上海）有限公司。具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：切取10片石蠟切片樣本，放入 1.5 ml 離心管內(nèi)；向離心管內(nèi)加入1.2 ml 二甲苯，漩渦震蕩，12000 rpm 離心5 min；棄上清液，加入 1.2 ml 無(wú)水乙醇，震蕩混勻，12000 rpm 離心 2 min；棄上清液，打開(kāi)管蓋在室溫或 37℃晾干殘留的乙醇；加入 180 μl DR Buffer，20 μl Proteinase K，充分混勻，56℃消化完全至沒(méi)有可見(jiàn)組織塊；加入300 μl 的GDT Buffer，充分混勻后，70℃孵育10 min；加入300 μl 的無(wú)水乙醇，震蕩混勻。待冷卻到室溫后，加入到離心柱內(nèi)，8000 rpm，離心1 min，棄收集管內(nèi)濾液；向離心柱內(nèi)加入 500 μl PW Buffer，8000 rpm離心30 s，棄濾液；向離心柱內(nèi)加入 600 μl WA Buffer，8000 rpm離心30 s，棄濾液；棄濾液后，12000 rpm 離心2 min，將離心柱放入新的1.5 ml 離心管內(nèi)；向離心柱內(nèi)的膜中央加入 40-80μl 預(yù)熱的DE Buffer，室溫放置2min，8000 rpm 離心2 min。棄離心柱，即得提取好的DNA。

PCR擴(kuò)增K-ras基因的相關(guān)片段（PCR擴(kuò)增儀型號(hào)是ABI Veriti 96孔梯度PCR儀）: 按照PCR擴(kuò)增試劑盒實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增試劑盒購(gòu)自基因科技（上海）有限公司，主要步驟如下:采用50μl反應(yīng)體系，其中10×PCR buffer 5μl，2.5mM dNTP 4μl，10mM上 游 引 物F1 1μl，10mM下 游 引 物Biotin-R1 1μl，1UTaq酶0.5μl，ddH2O 36.5μl，最后加入樣本模板2μl，總反應(yīng)體系為50μl，PCR反應(yīng)條件為：95℃ 3min，然后95℃ 10s，56℃ 20s，72℃ 30s，共45個(gè)循環(huán)，最后72℃ 5min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，選擇性地對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行Agarose電泳分析，以驗(yàn)證PCR擴(kuò)增效率。

1.4 焦磷酸測(cè)序

1.4.1 采用PyroMark ID型Pyrosequencing焦磷酸測(cè)序儀（瑞典Biotage AB公司產(chǎn)）配套的單鏈純化裝置從PCR反應(yīng)液中分離單鏈DNA。

1.4.2 將測(cè)序反應(yīng)板放置于測(cè)序儀中進(jìn)行測(cè)序。

1.4.3 數(shù)據(jù)分析：采用焦磷酸測(cè)序儀配套的分析軟件進(jìn)行，首先進(jìn)行SNP分析，對(duì)于存在雜合子的位點(diǎn)，需進(jìn)一步進(jìn)行基因頻率分析。

備注：Pyrosequencing焦磷酸測(cè)序?qū)嶒?yàn)委托基因科技（上海）有限公司完成。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件，χ2檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 K-ras基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

見(jiàn)圖1。

1: 野生型；2: 12密碼子突變；3: 13密碼子突變 ；M：marker

圖1 K-ras基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 測(cè)序結(jié)果

K-ras基因12、13密碼子突變情況測(cè)序如圖2所示。

圖2 野生型、突變型圖譜

375例患者組織標(biāo)本總共突變121例，其中12號(hào)密碼子GGT突變?yōu)镚TT 42例，占突變?nèi)藬?shù)的 34.71%，突變?yōu)镚AT 54例，占突變?nèi)藬?shù)的44.63%，突變?yōu)锳GT、CGT、TGT、GCT 7例，占突變?nèi)藬?shù)的 5.79%；13號(hào)密碼子GGC突變?yōu)镚AC 17例，占突變?nèi)藬?shù)的14.05%，突變?yōu)門GC 1例，占突變?nèi)藬?shù)的0.83%。K-ras總體突變率為32.27%。

3 討論

K-ras是一種原癌基因，編碼K-ras蛋白，參與細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳遞，當(dāng)正常時(shí)（即野生型）能調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)的路徑；K-ras基因突變后，編碼不正常的K-ras蛋白，使細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)紊亂，導(dǎo)致細(xì)胞持續(xù)生長(zhǎng)，并阻止細(xì)胞凋亡，細(xì)胞增殖失控而癌變。劉影等[1]的研究發(fā)現(xiàn)k-ras基因參與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展。馬其釗等[2]、吳文輝等[3]的研究報(bào)告得出，結(jié)直腸癌中K-ras基因突變與腫瘤分化程度有相關(guān)性，而與患者年齡、性別、腫瘤浸潤(rùn)深度及是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)。說(shuō)明K-ras基因突變是CRC的早期事件。CRC患者的K-ras突變很常見(jiàn)，歐美國(guó)家的突變率為30%-60%[4,5]。2006年，Lièvre等[6]首先報(bào)道CRC的K-ras野生型患者對(duì)C225敏感， Normanno N[7]做了進(jìn)一步驗(yàn)證，得出K-ras突變型CRC患者無(wú)法從C225治療中獲益，反而增加了藥物的毒性。隨后大量的臨床研究證實(shí)，病理標(biāo)本檢測(cè)表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）為野生型的CRC患者使用C225有很好的療效。在美國(guó)，治療使用C225前，必須首先檢測(cè)K-ras基因狀態(tài)[8,9]，若K-ras為突變型則不建議靶向藥物，從而避免對(duì)人體的毒性。因此，檢測(cè)CRC患者是否存在K-ras基因突變，可實(shí)現(xiàn)CRC患者的個(gè)性化用藥治療。

我們通過(guò)實(shí)驗(yàn)篩查，統(tǒng)計(jì)K-ras基因的總體突變率，得出結(jié)直腸癌的K-ras基因的總體突變率為32.27%，無(wú)明顯的南北差異。為結(jié)腸癌患者的基因診斷，分子靶向的個(gè)體化治療提供一個(gè)數(shù)據(jù)參考。根據(jù)前人[10,11]報(bào)道的研究結(jié)論：K-ras基因突變，尤其是12號(hào)密碼子，易引起癌癥的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，我們的統(tǒng)計(jì)也顯示出12號(hào)密碼子的突變占很大比例，檢測(cè)K-ras基因的狀態(tài)可評(píng)估結(jié)腸癌患者的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，為將來(lái)選擇最佳治療做好準(zhǔn)備[12]。篩查 CRC患者K-ras基因，實(shí)現(xiàn)對(duì)CRC患者更合理的用藥。