陶秀花,羅永松,江 軍

(1.江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蔬菜花卉研究所,江西 南昌 330200;2.江西省贛州市林業(yè)有害生物防治檢疫局,江西 贛州 341000；3.江西省全南縣林業(yè)技術(shù)推廣站,江西 全南 341800)

桂花(OsmanthusfragransLour.)原產(chǎn)于我國西南部,為木犀科(Oleaceae)木犀屬(OsmanthusLour)常綠灌木或小喬木,為中國十大傳統(tǒng)名花之一[1]。桂花的栽培歷史悠久,觀賞價值高,應(yīng)用廣泛。桂花在長期的進(jìn)化過程中受不同環(huán)境及栽培方式等的影響,發(fā)生了豐富的遺傳變異,擁有眾多遺傳資源。對桂花品種的分類大多是根據(jù)形態(tài)特征將其分為4個品種群:四季桂品種群、銀桂品種群、金桂品種群和丹桂品種群[2-5]。隨著長期的自然雜交及人工選育,各品種群形成了豐富多樣的栽培種,迄今共記載了170多個桂花品種[6]。利用分子標(biāo)記技術(shù)對桂花品種資源進(jìn)行分類已經(jīng)有一些研究報道[7-9]。

‘紫嫣公主’[10]是全南厚樸生態(tài)林業(yè)有限公司近年來選育的彩葉桂花新品種,通過了木犀屬栽培植物品種國際登錄中心組織的鑒定,并獲得了木犀屬新品種國際登錄。 國家林業(yè)和草原局授予‘紫嫣公主’植物新品種權(quán)(2018第17號)；2018年10月江西省林木品種審定委員會頒發(fā)了品種‘紫嫣公主’良種證書。‘紫嫣公主’的嫩枝、幼葉至成年葉期依次呈現(xiàn)紫紅、淺黃、墨綠等多種顏色的變化,彩色觀賞期達(dá)半年之久,具有很高的觀賞價值，可在江西、廣西、廣東、福建等地作園林觀賞栽培。

本研究利用AFLP和SSR標(biāo)記對彩色桂花新品種“紫嫣公主”的遺傳關(guān)系進(jìn)行了鑒定,旨在為種質(zhì)資源保護(hù)和新品種選育提供新的分子依據(jù)，并為今后彩葉桂的品種鑒定、保護(hù)及新品種開發(fā)和資源合理利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本研究供試材料共有12份(見表1)，包括：由全南厚樸生態(tài)林業(yè)公司選育的兩個新的彩葉桂花品種虔南桂妃[11]和紫嫣公主；對照種長葉木犀；由江西農(nóng)業(yè)大學(xué)選育的7個栽培品種(丹桂2個、四季桂2個、金桂2個、銀桂1個)；由江西林業(yè)科學(xué)院彩葉桂組選育的2份材料(銀碧雙輝[12]、云田彩桂)。采集各個供試材料的新鮮幼葉,于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 供試材料的信息

1.2 DNA提取及AFLP分析

根據(jù)制造商的建議,使用DNeasy Plant Mini Kit (Takara)從冷凍的葉片組織中提取基因組DNA。AFLP實驗過程如Vos P, et al.[13]所述,并做了一些修改;同時用Ecori和msei(Takara)分別對DNA樣品進(jìn)行限制。用雙鏈Ecori-和msei-適配器連接限制性片段。為了減少由實驗因素造成的差異,同時進(jìn)行了消化和結(jié)扎。在含300 ng基因組DNA樣品、20 μL Ecori、20 μL msei、350 μL T4 DNA連接酶(Takara)、5 pmol Ecori接合器、50 pmol msei接合器和5 μL 10×T4連接酶緩沖液的50 μL體積中,在37 ℃下進(jìn)行消化連接酶反應(yīng),在65 ℃下滅活10 min,并保存于-20 ℃。用上述4 μL digestion-ligation產(chǎn)品與10 μL 2×Taq PCR混合液(Sangon Biotech, Shanghai, China)、20 μL 10 μmol E+0/M+0引物(圖1)進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)進(jìn)行了35個循環(huán)(94 ℃反應(yīng)60 s, 56 ℃反應(yīng)60 s, 72 ℃反應(yīng)1 min),最后在72 ℃下延長5 min。

在用瓊脂糖凝膠電泳檢測片段涂片存在的前提下,將PCR產(chǎn)物用DDH2O稀釋至1∶20,用2 μL進(jìn)行2個引物的最終擴(kuò)增,每個引物具有3個選擇性核苷酸(E00+3選擇基和M00+3選擇基)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)采用原始AFLP協(xié)議[13]中描述的觸控循環(huán)進(jìn)行。變性PCR產(chǎn)物在6%聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)上分離,用標(biāo)準(zhǔn)尺寸標(biāo)記物在凝膠的第一泳道以120 V加載約3.0 h,用Sanguinetti C J, et al.描述的銀染色法[14]進(jìn)行檢測。

1.3 Microsatellite分析

20個Microsatellite先前在O.fragransLour中顯示出明顯的多態(tài)性，故在本研究中使用。PCR擴(kuò)增10 μL反應(yīng)體積,包含50 ng基因組DNA、2×taq-PCR主混合物(中國上海桑貢生物科技有限公司)、每種引物0.2 μL。用熱循環(huán)儀進(jìn)行放大,樣品先在94 ℃變性5 min；然后在94 ℃變性50 s,在55 ℃變性30 s,在72 ℃變性45 s,共35個循環(huán)；最后在72 ℃延長8 min,在4 ℃延長。用2.0%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物。

1.4 數(shù)據(jù)分析

為了描述遺傳變異的特征,在物種水平上計算了等位基因的觀察數(shù)(NA)、等位基因的有效數(shù)(NE)、雜合度(HO)、基因多樣性(He)和Shannon信息指數(shù)(I)；還進(jìn)行了分子方差分析(AMOVA)和主配位分析。使用Genalex 6.1軟件,利用遺傳距離值進(jìn)行E分析(PCA)。以相似矩陣為基礎(chǔ),利用NTSYS PC軟件中的算術(shù)平均(UPGMA)聚類的非加權(quán)對群方法構(gòu)造了樹狀圖。用Dnaman軟件進(jìn)行了核苷酸序列分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 AFLP和SSR標(biāo)記的鑒別能力

AFLP通常是1個顯性標(biāo)記。將沒有條帶擴(kuò)增出來的記為“0”,擴(kuò)增出目的條帶的記為“1”。在本研究材料中共篩選出55個AFLP引物組合,用這些引物組合進(jìn)行遺傳分析。共發(fā)現(xiàn)了1103個片段,分布在100～500 bp范圍內(nèi)(圖1),其中多態(tài)性片段1018個(占比92.29%，表2)；AFLP片段總數(shù)從10個(EAT/M-CAG)到34個(EAT/M-CTC)不等,平均18.69個；多態(tài)片段從9個(EAT/M-CAG)到32個(EAT/M-CTC)不等,平均為17.79個,其中EAT/M-CTA組合的多態(tài)比例最高，達(dá)95.8%(表2)。

M:2000marker；1:朱砂丹；2:鄂橙；3:四季桂；4:大葉佛頂珠；5:麩金；6:波葉金桂；7:紫梗籽銀桂；8:長葉木犀；9:虔南桂妃；10:紫嫣公主；11:銀碧雙輝；12:云田彩桂。

表2 桂花中55個擴(kuò)增AFLP的特性

所調(diào)查的17個多態(tài)性較高的SSR共鑒定了12份材料中的36個等位基因。生成擴(kuò)增產(chǎn)物45個，其中多態(tài)性占17個SSR的62.2%。PCR產(chǎn)物的大小主要分布在100～300 bp(圖2)；每個位點(diǎn)的等位基因數(shù)平均為2.12個,范圍為2～3個(表3)。圖2顯示了作為代表的清晰的DNA指紋。

表3 桂花17個擴(kuò)增SSRs的特點(diǎn)

M:2000marker;1:朱砂丹;2:鄂橙;3:四季桂;4:大葉佛頂珠;5:麩金;6:波葉金桂;7:紫梗籽銀桂;8:長葉木犀;9:虔南桂妃;10:紫嫣公主;11:銀碧雙輝;12:云田彩桂。

2.2 遺傳群體的特征

基于AFLP標(biāo)記,將Jaccard系數(shù)的兩兩遺傳距離轉(zhuǎn)化為相似系數(shù),結(jié)果相似系數(shù)的變化范圍為0.55～0.82,平均為0.68(表4)。其中銀碧雙輝與云田彩桂的遺傳相似性最大(相似系數(shù)為0.82);其次是朱砂丹和鄂橙(0.81)、波葉金桂和鄂橙(0.81)。長葉木犀(木犀科)與其它木犀的配對遺傳相似系數(shù)為0.55～0.59,平均0.57?！湘坦鳌推渌鸹ǖ倪z傳相似性變化在0.58～0.80之間,其中‘紫嫣公主’和銀碧雙輝(彩桂)的遺傳相似系數(shù)最大(0.80)。

表4 12種供試材料間的遺傳相似系數(shù)

在群體水平上,有效等位基因的數(shù)量從0.76到1.11不等,每個位點(diǎn)的平均值為0.91；Shannon指數(shù)(I)從0到0.11不等,平均值為0.05(表5)。6個群體間的遺傳分化系數(shù)(Hst)和基因流(Nm)分別為0.56和0.31(表6),表明在群體間存在遺傳分化和基因交換。

表5 不同群體的遺傳多樣性

表6 5組遺傳多樣性分析結(jié)果

2.3 分子方差分析(AMOVA)

對收集桂花的地點(diǎn)、海拔高度和品種類型的變異模式進(jìn)行分子方差分析(AMOVA)，分析結(jié)果表明，總變異量的73%來自種群內(nèi)部的變異,27%來自種群之間的變異(表7)。外交種通常具有更高水平的遺傳多樣性和較低水平的種群之間的變異,這與桂花兼容。上述的Hst指數(shù)表明,在桂花種群內(nèi)部存在高度分化,種群內(nèi)的遺傳多樣性遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于地理遺傳多樣性。

表7 AMOVA分析11個桂花樣品的結(jié)果

2.4 桂花品種間的遺傳關(guān)系

為了進(jìn)一步分析桂花種群間的遺傳關(guān)系,基于AFLP和SSR的內(nèi)力系數(shù)矩陣構(gòu)建了UPGMA樹狀圖(圖3)。圖3顯示了基于NEI和LI相似性估計(NEI和LI，1979)的12個樣本間的關(guān)系，其中AFLP的系數(shù)范圍為0.57～0.82, SSR的系數(shù)范圍為0.34～0.93。在該樹狀圖中,所有的材料首先被分為2組,其中長葉木犀(Oleaceae)的材料明顯分離,可以認(rèn)為是離群的。

A:基于AFLP數(shù)據(jù); B:基于SSR數(shù)據(jù)。

在AFLP的樹狀圖中,金桂1(麩金)和‘虔南桂妃’分別形成一個類群,另一組在0.67位。另外,當(dāng)系數(shù)為0.72時,將其他材料分為2組:一組由銀桂和彩桂組成,包括‘紫嫣公主’；另一組由丹桂和四季桂組成。在SSR的樹狀圖中，銀桂、彩桂、金桂、‘紫嫣公主’為一組。

主成分分析結(jié)果(圖4)顯示了11個桂花樣本與木犀屬之間的遺傳關(guān)系，與上述聚類分析結(jié)果基本一致,表明長葉木犀植物是從木犀屬植物中分離出來的。

pop1:丹桂種群; pop2:四季桂種群; pop3:金桂種群; pop4:銀桂種群; pop5:木犀屬; pop6:彩桂種群。

3 小結(jié)與討論

AFLP被認(rèn)為是高通量的制造者,結(jié)合DNA擴(kuò)增方法來研究物種水平和群體水平上的遺傳多樣性(基于地理群體或遺傳背景),并在個體的DNA水平上以高分辨率識別變異。我們通過AFLP觀察到了92.29%的多態(tài)性,這高于Li M， et al.[15]的研究結(jié)果；使用SRAP檢測了桂花的遺傳多態(tài)性(83.78%),這略高于Zhang W R， et al.[16]的研究結(jié)果；發(fā)現(xiàn)了4個桂花物種的遺傳多樣性(多態(tài)性86.8%),表明所有的采樣桂花有高水平的遺傳多樣性。各品種間的片段分布規(guī)律表明, ETG/M-CAA引物組合在Albus和黃體之間至少產(chǎn)生了1個獨(dú)特的片段,該引物組合被認(rèn)為是非常獨(dú)特的,因為它可以區(qū)分品種。該引物組合在特定品種中產(chǎn)生獨(dú)特的片段,可用于開發(fā)序列標(biāo)記位點(diǎn)(STS)標(biāo)記,以識別特定品種。

遺傳多樣性可以通過檢測到的標(biāo)記數(shù)來表達(dá),可以促進(jìn)種質(zhì)資源的保護(hù)和育種。在本研究中，桂花有效等位基因的數(shù)量從0.76到1.11不等,平均每個位點(diǎn)0.91個,低于棉花的[17](范圍2～5,平均2.26個);預(yù)期的雜合性(He)從0到0.07不等,平均值0.031,明顯低于水稻的[18](0.061～0.287,平均0.166)和玉米的[19](0.00～0.35,平均值為0.08)。與這些傳統(tǒng)作物相比,桂花在物種水平上的遺傳多樣性較低,表明通過營養(yǎng)繁殖培育桂花品種,具有較窄的遺傳基礎(chǔ),是一個值得關(guān)注的問題。因此,迫切需要擴(kuò)大桂花品種的遺傳基礎(chǔ),尋找優(yōu)質(zhì)桂花種質(zhì)資源,培育優(yōu)良品種。

遺傳距離和樹形圖分析為確定彩葉桂花新品種的起源提供了明確的基礎(chǔ)[20]。根據(jù)AFLP數(shù)據(jù),‘紫嫣公主’和銀碧雙輝(彩桂組)的遺傳相似性系數(shù)最大(0.80),說明這兩個物種存在遺傳相似性。在樹形圖中,‘紫嫣公主’與‘銀碧雙輝’(彩桂)、紫梗籽銀桂(銀桂)相近,表明‘紫嫣公主’屬于銀桂群。