李 婭， 周 海 龍， 李 琳， 陳 秋 駿， 吳 瓊， 劉 志 文

( 1.大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連 116034；2.中國生物發(fā)酵產(chǎn)業(yè)協(xié)會(huì)，北京 100833 )

0 引 言

長春花(Cathranthusroseus)是研究較為廣泛的藥用植物之一，它能夠合成150多種萜類吲哚生物堿，其中包括有效的抗腫瘤成分文多靈和長春質(zhì)堿[1]。由于文多靈和長春質(zhì)堿天然產(chǎn)物的含量極低，化學(xué)合成或半合成的方法制備程序復(fù)雜難控制和成本太高[2]。因此如何提高它們在長春花中的含量一直備受廣大科研工作者們關(guān)注[3-4]。

長春花的生長受環(huán)境影響大，其中光不僅影響葉綠素積累和葉片光合作用，還通過調(diào)節(jié)生物堿合成路徑上相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)而影響其生物堿合成與積累[5]。光合作用中，光反應(yīng)通過葉綠體中ATP合酶(F1F0-ATPase)合成的ATP，為長春花的次生代謝等生理活動(dòng)過程供給能量。其中CF1的α亞基是ADP結(jié)合位點(diǎn)并由葉綠體基因atpA編碼，主要功能是參與CF1合成和水解ATP功能的調(diào)節(jié)[6-8]。

病毒誘導(dǎo)的基因沉默(VIGS)相比于傳統(tǒng)的基因操作技術(shù)，具有快速、高效、操作簡單以及應(yīng)用范圍廣泛等優(yōu)點(diǎn)，已成功在擬南芥、煙草、長春花和喜樹等植物中實(shí)現(xiàn)了目的基因的沉默表達(dá)[9-11]。目前的應(yīng)用多基于煙草脆裂病毒(TRV)載體[12]。

本研究利用pTRV-VIGS技術(shù)對長春花中葉綠體ATP合酶CF1的α亞基基因(CratpA)進(jìn)行沉默，分析對文多靈和長春質(zhì)堿生物合成和幾個(gè)關(guān)鍵酶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平的影響，以期為在生產(chǎn)上提高長春花中文多靈和長春質(zhì)堿的含量提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

長春花種子為本實(shí)驗(yàn)室收藏和保存，在育苗盤里進(jìn)行種子萌發(fā)和生長4周后，挑選生長一致小苗移栽至6×10孔的生長盤中。在6周后選擇生長一致和良好的小苗進(jìn)行VIGS侵染。所有長春花材料均在(25±2) ℃、14 h/10 h光/暗以及光照強(qiáng)度2 500 lx條件下進(jìn)行溫室培養(yǎng)。

pGM-T Vector、TRNzol Reagent、RNase-free DNase、TIANScript M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、Taq DNA Polymerase及DNA回收試劑盒，天根生化科技有限公司；限制性內(nèi)切酶、高保真酶Prime-STAR HS DNA Polymerase和T4 DNA連接酶等生物試劑，寶生物工程(大連)有限公司；LightCycler480 SYBR GreenⅠMaster試劑，羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司；文多靈和長春質(zhì)堿標(biāo)準(zhǔn)品，阿拉丁生物試劑公司；農(nóng)桿菌GV3101，VIGS病毒載體pTRV1、pTRV2，pTRV2-CrPDS(八氫番茄紅素脫氫酶基因)和大腸桿菌XL-10 Gold(E.coli)均為本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 目的片段的引物設(shè)計(jì)和克隆

在NCBI獲得長春花葉綠體全序列(KC561139.1)中ATPase CF1的α亞基基因(CratpA)和蛋白序列(AGI51129.1)，該編碼序列(CDS)全長1 518 bp，編碼505個(gè)氨基酸。使用Primer premier 5設(shè)計(jì)VIGS片段擴(kuò)增引物(sCratpA-F和sCratpA-R)以及q-RT-PCR引物(CratpA-F和CratpA-R)(表1)，由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

表1 所用引物序列

選取野生型的長春花葉片與2粒經(jīng)過DEPC水處理的氧化鋯珠子，放入2 mL離心管后經(jīng)高通量組織研磨儀進(jìn)行組織破碎，并經(jīng)TRNzol法提取總RNA，再經(jīng)DNaseⅠ處理后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 備用。用高保真酶Prime-STAR HS DNA Polymerase和特異性VIGS引物擴(kuò)增目的片段，經(jīng)膠回收、純化和加A后連接至pGM-T載體上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑篩選及菌落PCR鑒定，選擇陽性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，酶切鑒定并送樣測序，獲得正確的pGM-T-sCratpA載體。

1.3 VIGS載體的構(gòu)建

將pGM-T-sCratpA和pTRV2質(zhì)粒分別用EcoRⅠ/XbaⅠ和EcoRⅠ/SpeⅠ(XbaⅠ和SpeⅠ酶切的黏性末端相同)在37 ℃下進(jìn)行雙酶切3 h。將目的酶切片段分別進(jìn)行回收，4 ℃冰箱連接過夜，熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL-10 Gold，并在37 ℃培養(yǎng)過夜，進(jìn)行菌落PCR和酶切驗(yàn)證，獲得正確的pTRV2-sCratpA，提取質(zhì)粒。

1.4 pTRV2-sCratpA質(zhì)粒的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化與鑒定

將活化好的農(nóng)桿菌GV3101在冰上預(yù)冷后收集菌體，在菌體中加入1 mL預(yù)冷的20 mmol/L CaCl2及50 μL DMSO輕輕混勻，重懸菌體。冰上分裝后，分別加入2 μL質(zhì)粒pTRV1、pTRV2(EV)、pTRV2-CrPDS(表型對照)和pTRV2-sCratpA并混勻，在液氮中冷凍5 min后，置于37 ℃ 培養(yǎng)箱內(nèi)5 min。加入LB培養(yǎng)基1 mL，180 r/min、30 ℃培養(yǎng)2 h。離心、收集菌體混勻后涂到含抗生素(Kan、Gen和Rif)的LB平板上，28 ℃倒置培養(yǎng)過夜，經(jīng)菌落PCR鑒定陽性克隆，挑取轉(zhuǎn)化成功的單菌落加入500 mL含有抗生素的LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，分裝并保藏于-80 ℃冰箱備用。

1.5 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化

將成功轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的根瘤農(nóng)桿菌GV3101在4種菌液分別進(jìn)行活化。當(dāng)OD600=0.8左右時(shí)，取200 μL菌體放大到50 mL LB液體培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，并加入10 mmol/L MES和20 mmol/L 乙酰丁香酮，在28 ℃和180 r/min條件下培養(yǎng)過夜。當(dāng)OD600=0.8時(shí)，4 000 r/min離心5 min 收集菌體，與滲透液(MES 20 mmol/L，MgCl210 mmol/L，乙酰丁香酮 200 μmol/L，pH 5.6)混合共培養(yǎng)3 h。

將含有pTRV1的菌液分別與含有pTRV2、pTRV2-CrPDS、pTRV2-sCratpA的菌液等體積混合均勻，用注射器刺破長春花幼苗頂端分生組織，注入菌液。經(jīng)過混合侵染4周后，pTRV2-CrPDS表型對照組會(huì)在侵染處長出3～4對白色葉片，以此為依據(jù)收取pTRV2(EV)和pTRV2-sCratpA植株同樣位置的葉片，僅收集侵染部位上方新長出葉片中由上至下的第2對和3對葉片進(jìn)行下一步分析，為了避免長春花不同生長階段而導(dǎo)致的基因表達(dá)量以及代謝產(chǎn)物的差異，選擇每對葉片中的左葉片進(jìn)行基因相對表達(dá)量的分析，而右葉片進(jìn)行次級代謝物長春質(zhì)堿和文多靈的分析。

1.6 長春花合成途徑關(guān)鍵酶基因q-RT-PCR分析

為了分析CratpA的VIGS是否影響長春花中文多靈和長春質(zhì)堿合成途徑上關(guān)鍵酶基因的表達(dá)，將收集的左葉片利用TRNzol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，并以此為模板進(jìn)行q-RT-PCR 分析。選取關(guān)鍵酶基因有TDC、STR、D4H、Cr7DLS、LMAT、DL7H、G10H以及內(nèi)參基因?yàn)镃rACT3，根據(jù)已知長春花的基因序列設(shè)計(jì)特異引物，引物信息見表1。

實(shí)時(shí)定量PCR儀為羅氏Roche480Ⅱ，使用TransStart Top Green qPCR SuperMix熒光染料，目的基因和內(nèi)參基因得到Ct值，利用公式2-△△Ct計(jì)算，并通過Image J軟件進(jìn)行定量分析。

1.7 文多靈和長春質(zhì)堿含量的檢測

選取CratpA基因沉默成功的右側(cè)葉片，置于2 mL離心管內(nèi)，并計(jì)算質(zhì)量，加入2粒氧化鋯珠子并經(jīng)高通量組織研磨儀進(jìn)行組織破碎，通過甲醇浸泡與超聲處理，離心收集上清，重復(fù)萃取3次，合并上清液并離心干燥至干粉，加入300 μL甲醇溶解，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾并收集，經(jīng)HPLC檢測文多靈及長春質(zhì)堿的含量。

HPLC使用C18反向色譜柱，流動(dòng)相為甲醇和50 μmol/L磷酸鹽，磷酸鹽經(jīng)0.22 μm濾膜過濾并超聲，按甲醇體積分?jǐn)?shù)梯度洗脫：20%～80%，0～20 min；80%，20～30 min；80%～20%，30～40 min；20%，40～45 min。檢測波長 310 nm(文多靈)與280 nm(長春質(zhì)堿)，體積流量1 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，柱溫30 ℃。

分別配制2、4、10和20 μg/mL的文多靈和長春質(zhì)堿標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線以及樣品的峰面積計(jì)算文多靈和長春質(zhì)堿含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 sCratpA特異片段的克隆

利用特異性引物擴(kuò)增得到430 bp左右特異性條帶，與預(yù)期片段長度相符，將其克隆到pGM-T克隆載體上并測序，測序結(jié)果表明該片段大小為431 bp，與NCBI數(shù)據(jù)庫中序列(KC561139.1)中ATPase CF1的α亞基基因序列進(jìn)行BLAST比對，結(jié)果如圖1所示。兩者序列完全一致，表明成功克隆得到目的片段sCratpA。再將sCratpA載體亞克隆到pTRV2載體中，成功獲得沉默表達(dá)載體pTRV2-sCratpA。

圖1 序列比對結(jié)果

2.2 植株的形態(tài)變化

如圖2所示，經(jīng)pTRV2-sCratpA侵染處理后的長春花植株與同期生長的野生型和空白對照處理植株相比，在株高、單株重和葉片數(shù)目等重要的表型性狀上無明顯變化(圖2(a)～(d))，未受影響。但處理后的葉片在生長過程葉色變淺失綠(圖2(e)～(f))。

2.3 基因沉默對CratpA表達(dá)的影響

利用q-RT-PCR分析基因沉默處理葉片中CratpA基因的轉(zhuǎn)錄水平，較pTRV2空載體(EV)降低，僅為對照組的27.4%(P<0.01)，表明成功實(shí)現(xiàn)了在長春花葉片中CratpA基因的VIGS表達(dá)，可進(jìn)行下一步分析。

2.4 基因沉默對關(guān)鍵酶基因表達(dá)量的影響

各個(gè)基因的相對表達(dá)量如圖3所示，CrD4H、Cr7DLS、CrLAMT和CrDL7H相對表達(dá)量分別升高13.85倍、4.42倍、18.91和4.31倍。

圖2 不同植株被侵染后的表型

誤差線表示3個(gè)生物學(xué)重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)誤差，“**”表示差異極顯著(P<0.01)

說明沉默CratpA反而增加了合成途徑中部分相關(guān)酶基因的表達(dá)量。

2.5 文多靈與長春質(zhì)堿的HPLC分析

文多靈與長春質(zhì)堿的標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC分析確定如圖4(a)所示，文多靈的出峰時(shí)間為25.3 min左右，而長春質(zhì)堿的出峰時(shí)間為27.5 min 左右。野生型植株(圖4(b))、EV(pTRV2、圖4(c))及pTRV2-sCratpA(圖4(d))處理的文多靈和長春質(zhì)堿的出峰時(shí)間均與標(biāo)品相近。

同空載體對照相比，基因沉默處理后的長春花植株的長春質(zhì)堿與文多靈含量都有顯著提高，其中文多靈增高了1.05倍(圖4(e))，而長春質(zhì)堿則提高了5.83倍(圖4(f))。結(jié)果表明CratpA的基因沉默對長春質(zhì)堿與文多靈的合成和積累有較大的影響，且呈負(fù)相關(guān)，即CratpA表達(dá)受阻時(shí)，長春質(zhì)堿與文多靈積累量升高，且對長春質(zhì)堿的積累更有效。

(a) 標(biāo)準(zhǔn)品

(b) 野生型

(c) pTRV2

(d) pTRV2-sCraptA

(e) 文多靈相對積累量

(f) 長春質(zhì)堿相對積累量

3 結(jié) 論

本研究表明，長春花葉片中ATP合酶CF1的α亞基基因的沉默，引起葉片葉色變淺，葉綠素合成受阻，但長春質(zhì)堿和文多靈合成途徑中的一些關(guān)鍵酶基因(CrD4H、Cr7DLS、CrLAMT和CrDL7H)的相對表達(dá)反而上升，并促進(jìn)了文多靈和長春質(zhì)堿的合成和積累，分別升高了1.05和5.83倍。

有大量的研究表明，長春花在弱光、遮光和低光強(qiáng)等環(huán)境下，葉片中葉綠素含量降低且葉綠素a與b比率低，促進(jìn)了長春堿VBL等合成路徑相關(guān)基因(TDC、STR、DAT和D4H)的表達(dá)，最終有利于長春花體內(nèi)的次生代謝產(chǎn)物文多靈和長春質(zhì)堿的合成和積累量提升[13-15]。

ATP合酶是光合作用中一個(gè)十分重要的含有多個(gè)亞基的復(fù)合體，任何一個(gè)亞基基因的改變都會(huì)影響光合作用順利進(jìn)行。本研究中CratpA的沉默后長春質(zhì)堿和文多靈合成反而上升，其原因可能是CratpA基因的表達(dá)量下降，導(dǎo)致CF1的α亞基合成減少，ATP合酶的功能減弱，影響到光合作用過程中光合電子傳遞和光合磷酸化[16]。從另一個(gè)角度上也驗(yàn)證了長春花生物堿的合成與光合磷酸化呈負(fù)相關(guān)的關(guān)系[17-19]。