劉登科，牛虹博，葛正茂，劉宇鵬

（中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第967醫(yī)院ICU，遼寧大連 116000）

曲霉菌在自然界中分布廣泛且種屬眾多，在濕潤的土壤、谷類中都可存在[1-2]。其本身為條件致病菌，正常情況下不致病，但是當(dāng)人體免疫功能下降時(shí)，即可侵入人體，造成侵襲性曲霉菌?。╥nvasiveAspergillosis,IA）[3]。因?yàn)镮A的死亡率高、早期診斷率低[4-5]，所以針對(duì)曲霉菌的殺菌藥物就顯得尤為重要。目前，治療曲霉菌感染常用三類抗真菌藥物：多烯類、唑類和棘白菌素[6]，其中伏立康唑（voriconazole，VRC）被美國的最新指南推薦為曲霉菌病的一線治療藥物[7]。但越來越多的研究顯示，曲霉菌在世界范圍內(nèi)對(duì)于唑類藥物的耐藥率逐漸升高，給臨床治療帶來極大困難，嚴(yán)重威脅了病患的生命安全[5-6]。由于多烯類藥物具有較強(qiáng)的毒性，棘白霉素類藥物的價(jià)格較為昂貴，因此唑類藥物是治療曲霉菌感染的一線藥物[8-9]，因此本文就曲霉菌對(duì)唑類藥物的耐藥機(jī)制的最新研究進(jìn)展進(jìn)行簡要闡述，以期為曲霉菌耐藥菌株的監(jiān)測以及新型治療藥物作用靶點(diǎn)的研制提供理論基礎(chǔ)。

1 曲霉菌對(duì)唑類抗真菌藥物的耐藥機(jī)制

1.1 外排系統(tǒng)過表達(dá)將抗菌物質(zhì)泵出菌體外 外排系統(tǒng)的過表達(dá)是曲霉菌對(duì)唑類藥物產(chǎn)生耐藥性的一種重要機(jī)制，相關(guān)作用基因主要是三磷酸腺苷結(jié)合盒蛋白(ATP - binding cassette transporter，ABC) 超家族和主要協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(the major facilitator superfamily，MFS)超家族[10]。有關(guān)文獻(xiàn)顯示，釀酒酵母的PDR5和PDR15蛋白參與了釀酒酵母對(duì)唑類藥物的耐藥，而CHAMILOS等[11]人在煙曲霉中發(fā)現(xiàn)的12個(gè)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與釀酒酵母的PDR5和PDR15蛋白同源，提示人們ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可能與煙曲霉對(duì)唑類的耐藥相關(guān)。到目前為止，已知的與耐唑相關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白有5個(gè)：AfuMDR1，AfuMDR2，AfuMDR3，AfuMDR4和AtrF。AfuMDR1和AfuMDR2 是最早被報(bào)道的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，直接參與了煙曲霉對(duì)藥物的外泵作用[12]，而AtrF則是分離自對(duì)伊曲康唑(itraconazole，ITC)耐藥的臨床煙曲霉株，對(duì)ITC耐藥株中AtrF mRNA的表達(dá)水平是對(duì)ITC敏感株的5倍[13]。還有報(bào)道表明，對(duì)ITC耐藥菌株中轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AfuMDR3和AfuMDR4的表達(dá)上調(diào)[14]；對(duì)泊沙康唑（posaconazole，POS）耐藥煙曲霉株中AfuMDR4 的表達(dá)上調(diào)[15]。MFS與AfuMDR3具有相似性，SUN等[16]人通過研究發(fā)現(xiàn)，MFS轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Mdr1p可以通過細(xì)胞膜的質(zhì)子梯度為轉(zhuǎn)運(yùn)體提供能量，其過表達(dá)可導(dǎo)致曲霉菌對(duì)唑類藥物耐藥性的產(chǎn)生。然而，關(guān)于曲霉菌外排系統(tǒng)過表達(dá)將唑類藥物泵出菌體外的機(jī)制尚未研究透徹，還需要進(jìn)一步詳細(xì)的研究。

1.2 曲霉菌生物膜的產(chǎn)生 曲霉菌的耐藥性可以通過生物膜的產(chǎn)生來調(diào)節(jié)，生物膜不僅可以在惡劣環(huán)境中保護(hù)病原體，還能引起暫時(shí)性的對(duì)抗真菌藥物的耐藥性[17-18]。此前MOWAT等[19]人在培養(yǎng)曲霉菌時(shí)發(fā)現(xiàn)其形成的生物膜結(jié)構(gòu)對(duì)抗真菌藥物具有耐藥性，隨后BEAUVAIS等[20]人則報(bào)道了煙曲霉菌落表面的細(xì)胞外基質(zhì)的作用。他們認(rèn)為煙曲霉細(xì)胞外基質(zhì)有助于菌絲結(jié)合在一起形成生物膜結(jié)構(gòu)，阻止藥物擴(kuò)散到真菌感染部位，從而降低了藥物敏感度。PAUL等[17]人也認(rèn)為生物膜的形成是曲霉菌對(duì)抗真菌藥物的高最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）的原因。此外，在生物膜結(jié)構(gòu)中，多種耐藥蛋白被激活，也可通過主動(dòng)外排系統(tǒng)泵出抗真菌藥物[15]。生物膜有關(guān)感染的死亡率極高，現(xiàn)有藥物治療難以治愈，因此對(duì)生物膜在耐藥性中的研究十分重要。

1.3 曲霉菌自身基因的改變

1.3.1 cyp51的突變與過表達(dá)：目前常用的抗真菌藥物的作用機(jī)理主要是通過干擾麥角固醇的生物合成來影響真菌細(xì)胞膜的形成[21]。自1997年首次報(bào)道煙曲霉唑類耐藥菌株以來，越來越多的人對(duì)其耐藥分子機(jī)制進(jìn)行了探討[22]。在煙曲霉屬中，唑類藥物的目標(biāo)是蛋白cyp51，它有兩個(gè)同源的基因編碼，即cyp51A和cyp51B，其序列一致性為63%，相關(guān)研究表明，大多數(shù)煙曲霉唑耐藥株的出現(xiàn)都與cyp51A的點(diǎn)突變有關(guān)[23]。在煙曲霉菌中羊毛甾醇 14-α-脫甲基酶由cyp51A編碼，是真菌細(xì)胞膜重要成分麥角固醇生物合成途徑的關(guān)鍵酶。唑類抗真菌藥中的氮原子可以結(jié)合位于cyp51A活性位點(diǎn)的血紅素的鐵原子上。通過這種方法，可以阻斷羊毛甾醇第14位碳原子的脫甲基作用，從而干擾麥角固醇的合成。缺乏麥角固醇會(huì)改變細(xì)胞膜的流動(dòng)性，導(dǎo)致真菌細(xì)胞的死亡[5,24]。

如前所述，大多數(shù)耐唑類菌株cyp51A發(fā)生了改變，而cyp51B在煙曲霉耐唑類藥物菌株中的作用尚不清楚。近年來，也有相關(guān)研究報(bào)道了cyp51B在唑類耐藥臨床分離菌株中的作用[25]，BUIED等[26]人在所分離得到的12株煙曲霉臨床耐藥菌株中均發(fā)現(xiàn)了cyp51B的過表達(dá)。隨后他們對(duì)cyp51B過表達(dá)的菌株進(jìn)行了基因敲除，又對(duì)唑類藥物敏感的菌株進(jìn)行了cyp51B的過表達(dá)，驗(yàn)證了cyp51B的過表達(dá)與曲霉菌對(duì)唑類藥物的耐藥有關(guān)這一發(fā)現(xiàn)。

1.3.2 hapE的突變：hapE是CCAAT結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物亞基，hapE的突變所引起的煙曲霉對(duì)唑類藥物耐藥是近年來發(fā)現(xiàn)的一種基因突變所致的耐藥機(jī)制[27]。這一發(fā)現(xiàn)由CAMPS等[28]人于2012年發(fā)現(xiàn)并提出，他們通過全基因組測序、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)等多種方法證明了hapE中P88L的替換是導(dǎo)致煙曲霉對(duì)唑類藥物耐藥性產(chǎn)生的原因。hapE的突變會(huì)引起其與CCAAT復(fù)合物之間的親和力變低，而減少了功能性CCAAT結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物后又會(huì)造成曲霉菌致病力的減弱。GSALLER等[29]人進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，CCAAT結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物作為調(diào)控麥角固醇合成的負(fù)作用因子，若其減少，將會(huì)解除包括cyp51在內(nèi)的多種關(guān)于麥角固醇合成的基因轉(zhuǎn)錄水平的抑制，造成麥角固醇的增多和耐藥菌株的產(chǎn)生。

1.4 環(huán)境對(duì)耐藥株的產(chǎn)生和傳播 此外，環(huán)境對(duì)耐藥株的產(chǎn)生和傳播作用也不可忽視。多種唑類殺菌劑廣泛用于農(nóng)作物的保護(hù)，這些唑類殺菌劑的分子結(jié)構(gòu)與三唑類藥物相似，但曲霉菌并不是在農(nóng)業(yè)中使用殺菌劑的目標(biāo)病原體，曲霉菌在自然界分布廣泛，土壤、作物中都有其孢子的存在，因此用殺菌劑處理過的作物上的真菌暴露于高濃度的唑類物質(zhì)中[5]，導(dǎo)致了耐藥株的產(chǎn)生和傳播[5,22,30]。截至目前，歐洲是煙曲霉對(duì)唑類藥物耐藥性最高的地區(qū)，其中基因型為TR34/L98H，TR46/Y121F/T289A的耐藥菌株已在歐洲各地發(fā)現(xiàn)，且被報(bào)道與農(nóng)業(yè)殺菌劑的廣泛使用有關(guān)[22,31]。雖然對(duì)亞太地區(qū)報(bào)告表明，其三唑耐藥率低于歐洲，但也出現(xiàn)了部分新型耐藥菌株[30,32]，亞太地區(qū)和歐洲曲霉菌唑類藥物耐藥率的差異可能是由于亞洲國家對(duì)唑類殺菌劑的使用較少所致[5]。

1.5 其他作用導(dǎo)致的耐藥性的產(chǎn)生 熱休克蛋白90 (heat shock proteins90，Hsp90)是一種真核分子伴侶蛋白，可以在環(huán)境作用下調(diào)控蛋白的折疊、運(yùn)輸和成熟[33]。鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶不僅是Hsp90的沉默蛋白之一，還是鈣信號(hào)通路的重要組成部分，在對(duì)唑類藥物的耐藥性中也發(fā)揮著一定作用。有關(guān)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，抑制了鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶后，煙曲霉對(duì)唑類藥物的耐藥性也隨之下降[5,9]。

外源性膽固醇在有氧條件可以作為麥角固醇的替代物，也是一種導(dǎo)致曲霉菌對(duì)唑類藥物產(chǎn)生耐藥的機(jī)制。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)培養(yǎng)基中存在膽固醇血清時(shí)，伊曲康唑?qū)熐沟淖饔没钚越档蚚34]。另有研究發(fā)現(xiàn)，在煙曲霉中，一種固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-SrbA可以通過erg11，cyp51A調(diào)節(jié)菌株對(duì)唑類藥物的耐藥性，而srbA的突變菌株(ΔsrbA)對(duì)氟康唑（Fluconazole，F(xiàn)LC）和VRC表現(xiàn)出高度敏感[35]。

2 討論

近年流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，曲霉菌感染率正呈逐年上升趨勢，再加上曲霉菌感染診斷率低，死亡率高的特點(diǎn)，對(duì)人類社會(huì)的健康造成了極大威脅[4-5]。目前，治療曲霉菌感染常用三類抗真菌藥物：多烯類、唑類和棘白菌素[6,9]。其中，唑類藥物廣泛用于曲霉菌感染的預(yù)防、經(jīng)驗(yàn)性治療以及慢性真菌感染的長期保守治療，其中VRC被推薦用作曲霉菌感染的一線治療方案[6-7,21]。但在過去的幾年間，世界各地均有煙曲霉對(duì)唑類藥物產(chǎn)生耐藥性的報(bào)道，且報(bào)道數(shù)量仍在不斷增加，所以對(duì)曲霉菌進(jìn)行耐藥率和耐藥機(jī)制的研究就顯得尤為重要[9,21]。因此，對(duì)于以上情況，本文給與以下建議：由于抗菌劑在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的大規(guī)模使用，使得每個(gè)國家都應(yīng)密切關(guān)注并調(diào)查最新耐藥株的流行情況，并依據(jù)調(diào)查結(jié)果在耐藥株發(fā)生率高的地區(qū)積極調(diào)整治療方案。實(shí)驗(yàn)室則應(yīng)對(duì)臨床曲霉菌分離株進(jìn)行常規(guī)藥敏試驗(yàn)，以便臨床醫(yī)生選擇最佳的抗真菌治療方案。而對(duì)于正在進(jìn)行單唑類抗真菌藥物治療的患者，需進(jìn)行密切監(jiān)測，當(dāng)發(fā)現(xiàn)唑類耐藥、臨床治療失敗時(shí)，應(yīng)迅速調(diào)整新的治療方案，使之包括兩性霉素B，或在VRC中加入一種棘皮菌素?？偟膩碚f，有效的抗真菌管理對(duì)于控制耐藥性的產(chǎn)生至關(guān)重要，本文針對(duì)曲霉菌對(duì)唑類藥物的耐藥機(jī)制的最新研究進(jìn)展作了簡要闡述，以期為曲霉菌耐藥菌株的監(jiān)測以及新型治療藥物作用靶點(diǎn)的研制提供理論基礎(chǔ)，但耐藥性的研究是項(xiàng)大工程，仍有許多機(jī)制不夠明確，需要人類進(jìn)一步探究。