洪 宏，袁建芬，喻海忠

（南通市中醫(yī)院檢驗(yàn)科,江蘇南通 226001）

近年來，乳腺癌的發(fā)病率及死亡率逐年增高，嚴(yán)重威脅女性的身心健康[1]。目前，臨床上常用的腫瘤標(biāo)志物CA153特異度和靈敏度均不高，容易出現(xiàn)誤診及漏診,且單項(xiàng)腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)在輔助診斷中有一定的局限性[2]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA-ATB (long non-coding RNA-ATB，lncRNA-ATB) 在多種惡性腫瘤組織或血清中異常表達(dá)，但在乳腺癌外周血表達(dá)水平的研究較少，且表達(dá)情況較傳統(tǒng)標(biāo)記物CA153對(duì)乳腺癌的診斷價(jià)值也未見報(bào)道。本研究旨在對(duì)研究對(duì)象血清中l(wèi)ncRNA-ATB表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，并探討聯(lián)合檢測(cè)CA153模式在乳腺癌診斷中的價(jià)值，現(xiàn)詳細(xì)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2017年6月～2019年9月期間收治的乳腺癌患者37例，同期乳腺良性疾病患者30例及健康體檢者26例作為研究對(duì)象。乳腺癌組納入標(biāo)準(zhǔn)：病理檢查確診為乳腺癌，排除曾進(jìn)行化療或放療、肝腎功能異常、過敏者等，年齡38～79歲，平均年齡51.2歲。乳腺良性疾病組為同期收治患者，年齡46～72歲，平均年齡53.2歲。另健康組為女性體檢者，均無肝腎、心血管及乳腺等疾病，年齡43～76歲，平均年齡52.4歲。各組在年齡、性別上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，具有可比性。

1.2 試劑和儀器 Trizol（Invitrogen 美國(guó)），TakaRa PrimeScript RT reagent kit，SYBR Premi ExTaq kit（大連寶生物工程有限公司），lncRNAATB及內(nèi)參引物（上海生工生物工程有限公司）。Cobas z 480實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Roche 瑞士)，Cobas e 411電化學(xué)發(fā)光儀(Roche 瑞士)，CA153試劑及質(zhì)控品均為原裝配套試劑。

1.3 方法 術(shù)前空腹抽取靜脈血3 ml，1 h內(nèi)于4 ℃條件下，以12 000 g離心力離心10 min分離血清，用Trizol法提取血清中的總RNA。分光光度儀A260nm/280nm檢測(cè)吸光度，1.8～2.2 合格，進(jìn)行下一步逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，按照TakaRa PrimeScript RT reagent kit試劑盒說明書操作，生成的cDNA置于-70 ℃保存。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）法檢測(cè)血清lncRNA-ATB及內(nèi)參基因GAPDH表達(dá)水平。lncRNA-ATB上游引物：5’-TACAACCACTGCACTACCTG-3’，下游引物：5’-TGGAATGCTTGAAGGCTGCT-3’；GAPDH上游引物：5’-GGGAGCCAAAAGGGTCAT-3’，下游引物：5’-GAGTCCTTCCACGATACCAA-3’ 反應(yīng)體系為：cDNA 2 μl，上下游引物各1 μl，SYBR 10 μl，H2O 6 μl，共20 μl；反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃ 5 s，60 ℃ 25 s，40個(gè)循環(huán)，溶解曲線1個(gè)循環(huán)。用2-△△Ct表示lncRNA-ATB的相對(duì)表達(dá)含量。用羅氏Cobas e 411型電化學(xué)發(fā)光儀檢測(cè)CA153。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，首先用Kolmogorov-SmirnovZ檢驗(yàn)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，呈非正態(tài)分布，用M(P25，P75)表示。多組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)，兩組間比較采用非參數(shù)Mann-WhineyU檢驗(yàn)。聯(lián)合診斷采用二元Logistic回歸分析，受試者工作特征曲線(ROC曲線)下面積(AUC)，靈敏度和特異度評(píng)價(jià)指標(biāo)的診斷價(jià)值。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組lncRNA-ATB相對(duì)表達(dá)水平比較 1ncRNAATB在乳腺癌組[1.82(1.19，3.74)]、乳腺良性疾病組[1.13(0.92，1.31)]和健康對(duì)照組[0.98(0.83，1.14)]血清中的表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=29.45，P＜0.01)。乳腺癌組血清lncRNA-ATB表達(dá)水平明顯高于乳腺良性病組(U=233，P＜0.01)和健康對(duì)照組(U=131，P＜0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 血清CA153含量和lncRNA-ATB相對(duì)表達(dá)量單獨(dú)與聯(lián)合檢測(cè)對(duì)乳腺癌的診斷價(jià)值 見圖1。結(jié)果顯示，lncRNA-ATB靈敏度為89.2%，特異度為67.9%，AUC為0.824（95%CI：0.735～0.914，P＜0.01），其臨床診斷臨界值（cutoff value≤1.104），而CA153靈敏度僅為67.6%，特異度為91.1%，AUC為0.809（95%CI：0.712～0.906，P＜0.01）。再以lncRNA-ATB，CA153為自變量，建立Logistic回歸模型，通過模型中的概率值來擬合聯(lián)合檢測(cè)的ROC曲線，CA153和lncRNA-ATB聯(lián)合檢測(cè)的靈敏度提高至83.8%，特異度為80.4%，AUC為0.876（95%CI：0.800～0.953，P＜0.01）。

3 討論

lncRNA是一類長(zhǎng)度超過200個(gè)核苷酸的RNA分子，能通過表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控等方面影響相關(guān)基因的表達(dá)，參與染色體修飾、基因沉默、轉(zhuǎn)錄激活等，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，其表達(dá)異常影響著腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為[3-4]。由于不具有編碼蛋白質(zhì)的潛能，曾被認(rèn)為是無用RNA或轉(zhuǎn)錄噪聲[5]。lncRNA-ATB全稱lncRNA actived by TGF-β,長(zhǎng)度約為2.4kb,位于人類第14號(hào)染色體上，是首個(gè)被發(fā)現(xiàn)的能被轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子激活的長(zhǎng)鏈非編碼RNA[6]。lncRNA-ATB在多種腫瘤中異常表達(dá)，是腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的關(guān)鍵調(diào)控分子[7-9]。lncRNAATB在曲妥珠單抗耐藥的乳腺癌患者組織中及SKBR-3細(xì)胞系中呈高表達(dá)，其機(jī)制為lncRNA-ATB通過ceRNA結(jié)合miR-200c上調(diào)ZEB1和ZNF127的表達(dá)，高表達(dá)的ZEB1/ZNF127促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT和對(duì)曲妥珠單抗的耐藥，下調(diào)lncRNA-ATB可以顯著抑制SKBR-3細(xì)胞的生長(zhǎng),同時(shí)可促進(jìn)曲妥珠單抗耐藥的SKBR-3細(xì)胞凋亡[10]。

本研究顯示，乳腺癌患者血清中l(wèi)ncRNA-ATB表達(dá)水平顯著高于乳腺良性疾病者和體檢健康者，提示lncRNA-ATB可能扮演著癌基因的角色，檢測(cè)乳腺癌患者血液中的循環(huán)核酸，lncRNA-ATB可能為乳腺癌輔助診斷的一個(gè)潛在的分子標(biāo)志物。ROC曲線顯示，以lncRNA-ATB相對(duì)表達(dá)的臨床診斷臨界值（cutoff value≤1.104）用于診斷乳腺癌的靈敏度為89.2%，特異度為67.9%，AUC為0.824，與傳統(tǒng)標(biāo)志物CA153的靈敏度僅為67.6%，特異度為91.1%，AUC為0.809相比，靈敏度有提高，特異度略低，但診斷價(jià)值較高。進(jìn)一步通過建立Logistic回歸模型，模型中的概率值來擬合聯(lián)合檢測(cè)的ROC曲線顯示，聯(lián)合檢測(cè)的靈敏度提高至83.8%，特異度為80.4%，AUC為0.876。聯(lián)合檢測(cè)診斷乳腺癌的效能優(yōu)于單獨(dú)檢測(cè)，聯(lián)合診斷可提高診斷的準(zhǔn)確性，但要注意假陽性問題。

綜上所述，lncRNA-ATB在乳腺癌患者血清中呈現(xiàn)高表達(dá)，在乳腺癌診斷中敏感度高，與傳統(tǒng)標(biāo)志物CA153聯(lián)合檢測(cè)彌補(bǔ)了單一指標(biāo)檢測(cè)的不足，可考慮為乳腺癌輔助診斷的一種潛在生物學(xué)標(biāo)志物用于臨床，以減少漏診。不足之處在于本研究納入的病例數(shù)有限，診斷價(jià)值仍需大樣本進(jìn)一步驗(yàn)證，缺少對(duì)乳腺癌術(shù)前、術(shù)后的比較、與臨床病理特征的相關(guān)性及治療療效的觀察等方面的研究，在后續(xù)工作中將通過隨訪、功能研究等進(jìn)一步驗(yàn)證lncRNA-ATB的臨床應(yīng)用價(jià)值。