王夢(mèng)曼 韋彥安 孫京新,2* 周靜萱 苗春偉

1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 山東青島 266109 2.青島特種食品研究院 山東青島 266109

發(fā)酵肉制品是指在自然條件下或人工控制條件下，利用微生物或酶的發(fā)酵作用，使原料肉發(fā)生一系列生物化學(xué)變化以及物理變化，而形成具有特殊色澤、質(zhì)地和風(fēng)味及可以比較長(zhǎng)時(shí)期保存的肉制品[1，2]。目前用于發(fā)酵肉制品生產(chǎn)的微生物有乳桿菌屬、鏈球菌屬、片球菌屬、酵母菌屬和青霉菌屬。Fernández M[3](2016)等在一種經(jīng)過自然發(fā)酵而成的豬肉腸中添加抗菌蛋白酶(EPg222)，討論致病菌和抗腐敗菌的一些功能。Arcila J A[4](2015)等利用木糖葡萄球菌發(fā)酵肉品，研究發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生的硝酸鹽還原酶、蛋白酶和脂肪分解酶可以保持肉類產(chǎn)品的顏色。Broncano J M[5](2011)等添加蛋白酶在香腸中，增加抗氧化穩(wěn)定性。用肉糖葡萄球菌和植物乳桿菌這種蛋白酶混合發(fā)酵劑進(jìn)行干香腸發(fā)酵，加速了制品中的蛋白質(zhì)水解速度，讓制品的成熟期提前，制品中游離氨基酸的量也發(fā)生了明顯增加。Chen Q[6](2016)等利用戊糖片球菌、彎曲乳桿菌和木糖葡萄球菌的發(fā)酵劑混合物發(fā)酵哈爾濱干腸，使風(fēng)味得以改善。

在發(fā)酵肉過程中，植物乳桿菌能夠產(chǎn)生蛋白質(zhì)酶和脂肪酶分解蛋白質(zhì)和脂肪，從而形成易于人體消化吸收的游離氨基酸和脂肪酸。同時(shí)在發(fā)酵過程中形成烴、醛、酮等呈味物質(zhì)來改善產(chǎn)品風(fēng)味。阮一凡[7](2020)等利用植物乳桿菌和釀酒酵母菌發(fā)酵鴨腿，賦予產(chǎn)品良好風(fēng)味并延長(zhǎng)了產(chǎn)品貨架期。石江濤[8](2015)等利用戊糖片球菌和嗜酸乳桿菌發(fā)酵的鴨肉具有良好的味道和口感。當(dāng)前，國內(nèi)外生產(chǎn)的發(fā)酵肉制品大都采用生鮮肉為原料進(jìn)行發(fā)酵，利用乳酸菌和葡萄球菌為主發(fā)酵劑進(jìn)行純菌或者混菌發(fā)酵[9，10]。生鮮肉在發(fā)酵成熟的過程中，起主要作用的是肉中固有蛋白酶、脂肪酶，起次要作用的是微生物發(fā)酵。

發(fā)酵食品歷史悠久。西方國家早期生產(chǎn)傳統(tǒng)西式發(fā)酵香腸。在我國有些地區(qū)生產(chǎn)基于乳酸菌的肉類產(chǎn)品。本文以植物乳桿菌為發(fā)酵劑，首先將生鴨肉高溫滅菌，使其自身的酶失活，利用植物乳桿菌生長(zhǎng)代謝中產(chǎn)生的豐富的酶對(duì)其進(jìn)行酶解，此過程中微生物的發(fā)酵作用將占主導(dǎo)地位。

1 材料與方法

1.1 材料

植物乳桿菌，山東中科嘉億生物工程有限公司；

鴨胸肉，青島市城陽區(qū)大潤(rùn)發(fā)超市；

試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

質(zhì)構(gòu)儀TA-XT2i，英國Stable Micro System公司；

顯微激光拉曼光譜儀HR800，法國Jobin-Yvon公司；

氣相色譜(gas chromatography，GC)-質(zhì)譜(mass spectrometry，MS)聯(lián)用儀7890A-5975C，美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 植物乳桿菌懸液的制備

將冷凍的植物乳桿菌解凍后接入配好的肉湯培養(yǎng)基中，在MRS平板上劃線，在37℃無氧條件下培養(yǎng)24h。培養(yǎng)后挑取單個(gè)菌落到10mL MRS平板中培養(yǎng)，并在37℃條件下靜置24h。最后在37℃條件下以2%接種進(jìn)一步培養(yǎng)12h，培養(yǎng)物以8 000r/min，4℃離心10min后，倒去上層培養(yǎng)基，用無菌生理鹽水配成109cfu/mL的菌懸液備用。

1.3.2 發(fā)酵肉樣品制備

將新鮮鴨胸肉用手術(shù)刀切下并絞成肉糜后用模具壓成肉片，每份取4片置于10cm培養(yǎng)皿中。在121℃、0.1MPa條件下滅菌15min。冷卻至室溫。將制備好的植物乳桿菌懸液無菌操作下以5%接種量接種于鴨肉中。密封在20℃恒溫條件下發(fā)酵，分別于鴨肉發(fā)酵過程中第0、3、5、7、9、12、14、17天觀察對(duì)照組和發(fā)酵鴨肉制品。

1.3.3 發(fā)酵過程中質(zhì)構(gòu)測(cè)定

在常溫條件下取3.0cm×3.0cm×1.0cm的樣品用TA-XT2i質(zhì)構(gòu)儀(英國Stable Micro Systems公司)測(cè)試發(fā)酵過程樣品，3次重復(fù)。依據(jù)Park W[11](2016)等的方法，探頭型號(hào)P/0.5 R柱，用TPA二次下壓；探頭型號(hào)P/0.5 R柱，試驗(yàn)前速度為2.0mm/s，試驗(yàn)速度為1.0mm/s，測(cè)試后速度5.0mm/s，下壓距離8.0mm，觸發(fā)5.0g。測(cè)定參數(shù)：彈性，硬度，黏度。

從TPA實(shí)驗(yàn)特征曲線得到計(jì)算參數(shù)：硬度=第一個(gè)最高點(diǎn)；彈性=4～5間時(shí)間/1～2間時(shí)間；粘性=4～6和1～3之間的曲線所包圍的區(qū)域；粘著性=硬度×內(nèi)聚性。

1.3.4 拉曼光譜

依據(jù)Chen H[12](2011)等的方法,將對(duì)照組和植物乳桿菌發(fā)酵鴨肉樣品通過顯微激光拉曼光譜儀(JY Labram HR 800，法國Jobin-Yvon公司)測(cè)定，激光器為785nm，功率為100mw，光譜的獲得條件為開孔200μm，600g/mm光柵，進(jìn)行3次掃描，積分時(shí)間為60s，分辨率為2cm-1，數(shù)據(jù)獲取速度為120cm-1/min，獲取的拉曼光譜在300～3 500cm-1。通過比較多肽和蛋白質(zhì)拉曼光譜獲得氨基酸側(cè)鏈光譜條帶和肽鍵骨架振動(dòng)分配[13～15]。每個(gè)樣品測(cè)試3次,測(cè)試完成后用顯微激光拉曼光譜儀中軟件Labspec對(duì)光譜進(jìn)行平滑處理。蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)(隨機(jī)卷曲，β-折疊，α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角)的含量可以通過曲線擬合結(jié)合傅里葉反卷積計(jì)算得到[16]。

1.3.5 氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)

將對(duì)照組和植物乳桿菌發(fā)酵鴨肉樣品，分別用刀具將制品弄碎成肉糜，并在4～8℃條件下發(fā)酵一段時(shí)間后，各取5g于固相微萃取瓶中。萃取頭于氣相色譜進(jìn)樣口中，在280℃條件下老化60min后，提取頭插入瓶頂。在60℃條件下萃取60min，吸附結(jié)束后，取出萃取頭，再于氣相注射儀中在250℃條件下解吸2min。

GC-MS色譜條件：運(yùn)用TR-5-MS毛細(xì)管色譜柱(31m×0.25mm，0.26μm)。

升溫程序：起始柱溫40℃，保持2min，以5℃/min至195℃，再以10℃/min至225℃，保留11min，運(yùn)行總時(shí)間51min。

檢測(cè)溫度240℃；載氣為He；流速1.6mL/min；恒壓13.02kPa；離子源溫度240℃；電子能量70ev。

電腦跟數(shù)據(jù)庫匹配。定性結(jié)果使用一定程度的匹配和反匹配大于800。對(duì)揮發(fā)性風(fēng)味成分的定量分析采用相對(duì)含量(%)按峰面積歸一化法處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)構(gòu)

硬度是成熟程度的量度，與鴨肉蛋白質(zhì)的變性、水解以及水分耗損有關(guān)[17]。從發(fā)酵開始，植物乳桿菌發(fā)酵鴨肉硬度比對(duì)照組(未發(fā)酵鴨肉)顯著降低(p<0.05)(圖1)。是由于植物乳桿菌繁殖生長(zhǎng)，蛋白酶產(chǎn)生代謝產(chǎn)物蛋白酶，將樣品中的蛋白分解成為小分子的蛋白、胨以及小肽等。制品的含水量、脂肪含量和蛋白質(zhì)含量會(huì)對(duì)硬度有影響[18]。李小妮[19](2020)等用不同的菌種對(duì)臘腸進(jìn)行發(fā)酵，得出結(jié)論，添加植物乳桿菌可以緩解肉品的硬度。

圖1 發(fā)酵過程中鴨肉制品硬度變化Fig. 1 Hardness changes of duck meat products during fermentation

本研究中發(fā)酵鴨肉在成熟過程中，溶膠會(huì)不斷轉(zhuǎn)變?yōu)槟z，從而提高鴨肉的硬度，但同時(shí)，由于蛋白質(zhì)具有降解作用，硬度會(huì)降低。發(fā)酵前7d，植物乳桿菌發(fā)酵鴨肉與對(duì)照組(未發(fā)酵鴨肉)彈性無顯著差別(p>0.05)；發(fā)酵7d后，植物乳桿菌發(fā)酵鴨肉彈性比對(duì)照組(未發(fā)酵鴨肉)顯著降低(p<0.05)(圖2)。本研究中發(fā)酵鴨肉在發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)水解程度的不斷增加，產(chǎn)生大量水溶性物質(zhì)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)被破壞，樣品彈性出現(xiàn)下降趨勢(shì)。

圖2 發(fā)酵過程中鴨肉制品彈性變化Fig. 2 Elasticity changes of duck meat products during fermentation

Kargozari M[20](2014)等利用4種配方發(fā)酵香腸，得出結(jié)論中其發(fā)酵香腸彈性變化范圍與本研究中植物乳桿菌發(fā)酵鴨肉相似。發(fā)酵前7d，植物乳桿菌發(fā)酵鴨肉與對(duì)照組(未發(fā)酵鴨肉)黏性無顯著差別(p>0.05)；發(fā)酵7d后，植物乳桿菌發(fā)酵鴨肉黏性比對(duì)照組(未發(fā)酵鴨肉)顯著增大(p<0.05)(圖3)。這與植物乳桿菌生長(zhǎng)旺盛有關(guān)，發(fā)酵7d后菌絲體分泌物變多，水分含量升高，因此產(chǎn)品黏性增大。Laranjo M[21](2015)等通過研究干發(fā)酵香腸，得出結(jié)論黏度隨著發(fā)酵時(shí)間的進(jìn)行呈上升趨勢(shì)。

圖3 發(fā)酵過程中鴨肉制品黏性變化Fig. 3 Viscosity changes of duck meat products during fermentatio

2.2 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)

蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要包括α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲等不同類型。拉曼光譜圖中，酰胺Ⅰ帶和酰胺Ⅲ帶具有較強(qiáng)的拉曼效應(yīng)并且極少受到其他分子群的干擾，所以在分析和鑒定蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)時(shí)，把酰胺Ⅰ帶和酰胺Ⅲ帶作為可靠依據(jù)[22]。如圖4所示，在拉曼光譜中，酰胺Ⅰ帶的范圍為1 600～1 700cm-1，其中，1 645～1 657cm-1是高α-螺旋含量的蛋白質(zhì)在拉曼光譜上的條帶中心所在的區(qū)域；β-折疊結(jié)構(gòu)為主的條帶位于1 665～1 680cm-1；1 680cm-1為β-轉(zhuǎn)角含量高的蛋白質(zhì)的條帶所在區(qū)域；無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)在1 660～1 665cm-1范圍內(nèi)。在酰胺Ⅲ帶的范圍中，表征不同結(jié)構(gòu)的譜帶有部分重合的區(qū)域，高α-螺旋含量的蛋白質(zhì)主要在1 260～1 300cm-1處，在含量范圍內(nèi)，與β-轉(zhuǎn)角存在重合區(qū)域；β-折疊在1 238～1 245cm-1處；無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)出現(xiàn)在1 250cm-1處[23]。

圖4 對(duì)照組(A)與植物乳桿菌發(fā)酵鴨肉制品(B)蛋白質(zhì)拉曼光譜(500～2 500cm-1)Fig. 4 Control (A) and Lactobacillus plantarum fermentation of duck meat products (B) Protein Raman spectroscopy (500～2 500cm-1)

植物乳桿菌發(fā)酵鴨肉產(chǎn)品中含有的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的每一種的含量，可以在圖5中看出來。在加入植物乳桿菌后，α-螺旋含量由62%顯著減少到43%(p<0.05)；β-折疊含量由18%顯著增加到32%(p<0.05)；β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲含量增加不顯著(p>0.05)。常榮[24](2019)等發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中的β-折疊含量會(huì)隨著氫鍵的增多而增多，而且，通過提高NaCl添加量，也會(huì)提升α-螺旋結(jié)構(gòu)解折疊，形成β-折疊結(jié)構(gòu)。Barrtee T W[25](1978)等通過研究，無機(jī)鹽作用于肌動(dòng)蛋白，這是由于多肽鏈間氫鍵增加引起蛋白質(zhì)α-螺旋含量降低。Wu Z[26](2006)等也通過研究，得出結(jié)論NaCl含量超過3%同樣會(huì)導(dǎo)致α-螺旋含量降低。多肽鏈間氫鍵的數(shù)量會(huì)影響β-折疊的形成，同時(shí)在肌原纖維蛋白熱作用下會(huì)形成凝膠，在此過程中會(huì)導(dǎo)致β-折疊含量增加[27]。

圖5 鴨肉制品蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)含量Fig. 5 Content of secondary structure of protein duck meat products

2.3 氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)

從表1看出，植物乳桿菌發(fā)酵鴨胸肉產(chǎn)品的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的數(shù)量以及種類有所上升。植物乳桿菌發(fā)酵鴨肉中檢出10種可以揮發(fā)的味道物質(zhì)，其中有酮類1種，烴類3種，醛類1種，醇類2種，過氧化物1種，胺類1種；未發(fā)酵鴨胸肉產(chǎn)品中可以散發(fā)的味道成分有7種，有酮類1種，烴類2種，醛類1種，醇類3種。未發(fā)酵鴨胸肉主要可以散發(fā)的味道性物質(zhì)有醇、酮、烷、醛。

表1 植物乳桿菌發(fā)酵鴨肉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)Table 1 Lactobacillus plantarum fermentsvolatile flavor substances in duck meat

在植物乳桿菌發(fā)酵鴨胸肉產(chǎn)品中，胺類和過氧化物數(shù)量顯著增加(p<0.05)；烴類物質(zhì)增加不顯著(p>0.05)，醇類物質(zhì)下降不顯著(p>0.05)。植物乳桿菌在發(fā)酵鴨肉時(shí)，通過鴨肉自身的酶系分解蛋白質(zhì)、脂肪，生產(chǎn)小分子肽和脂肪酸，其為揮發(fā)性物質(zhì)的前體。醛類作為中間體，能夠參與氨基酸和羰基化合物的相互作用[28]。

3 結(jié)論

植物乳桿菌發(fā)酵鴨肉制品與對(duì)照組(未發(fā)酵鴨肉)相比在質(zhì)地、蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)、揮發(fā)性物質(zhì)種類等方面發(fā)生了品質(zhì)變化。植物乳桿菌發(fā)酵鴨肉制品的硬度和彈性明顯降低，黏性明顯增加；在蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中，α-螺旋含量降低，β-折疊含量增加；而且，植物乳桿菌發(fā)酵鴨肉制品的風(fēng)味物質(zhì)增多，尤其是醇，在數(shù)量和比例上明顯增加。因此，植物乳桿菌為發(fā)酵劑生產(chǎn)出的發(fā)酵鴨肉制品，有良好的風(fēng)味和質(zhì)地，推動(dòng)了發(fā)酵鴨肉制品的發(fā)展。