劉 旭，閆賦琴

(1.中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院第三醫(yī)學(xué)中心藥品保障室，北京 100039； 2.中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院醫(yī)療保障中心藥劑科，北京 100853； 3.中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院醫(yī)療保障中心采購(gòu)辦，北京 100853)

抑郁癥屬于情感性精神障礙，其病理生理機(jī)制較為復(fù)雜，到目前為止還未得以完全闡明。抑郁癥在臨床上是以顯著而持久的心境低落為主要特征的臨床綜合征，具有高病殘率和自殺率，并且易復(fù)發(fā)，給家庭和社會(huì)帶來(lái)了極大的危害，并且隨著我國(guó)老齡化日趨嚴(yán)重，老年抑郁癥發(fā)病率明顯升高[1]。5-羥色胺(5-HT)/去甲腎上腺素(NE)再攝取抑制劑度洛西汀，是繼氟西汀之后美國(guó)禮來(lái)公司重點(diǎn)研究的治療抑郁癥藥物。該藥自2004年被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)可用于治療成人重癥抑郁癥以來(lái)，目前已經(jīng)成為臨床一線抗抑郁藥[2]。

根據(jù)藥物的作用機(jī)制，度洛西汀主要是通過(guò)提高中樞神經(jīng)系統(tǒng)中5-HT和NE的濃度，從而調(diào)控情感和對(duì)疼痛的敏感程度，達(dá)到改善抑郁癥患者病情的目的，最終提高機(jī)體對(duì)疼痛的耐受力。度洛西汀口服后吸收迅速、完全，組織分布廣且作用均衡。并且，度洛西汀抑制5-HT和NE的再攝取能力強(qiáng)，相比較選擇性5-HT再攝取抑制劑而言，其對(duì)抑郁癥治療的有效率明顯提高，不良反應(yīng)遠(yuǎn)低于三環(huán)類抗抑郁藥[3]。總體而言，度洛西汀的應(yīng)用廣泛且前景較好，但是目前對(duì)度洛西汀的生殖和相關(guān)的遺傳毒性研究卻很少。因此，本研究采用小鼠的骨髓微核試驗(yàn)、急性毒性試驗(yàn)和精子畸變?cè)囼?yàn)，探討度洛西汀的急性毒性及遺傳毒性，為抗抑郁藥的進(jìn)一步研究提供一定的數(shù)據(jù)支持[4-9]。

1 材料

1.1 儀器

CX21型正置顯微鏡(日本奧林巴斯株氏會(huì)社);MEK-6318K型自動(dòng)血球計(jì)數(shù)儀(日本光電工業(yè)株氏會(huì)社);BT1250型電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)。

1.2 藥品與試劑

度洛西汀購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；環(huán)磷酰胺購(gòu)自浙江海正藥業(yè)股份公司，生產(chǎn)批號(hào)為13040225。

1.3 動(dòng)物

ICR小鼠，雄性，體重18～20 g，購(gòu)自斯貝福實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)為SCXK(京)2016-0001。

2 方法

2.1 小鼠急性毒性試驗(yàn)

ICR小鼠60只(SPF級(jí))，隨機(jī)分為6組，每組10只。進(jìn)行試驗(yàn)前將小鼠禁食12 h(不禁水)處理。度洛西汀的起始劑量根據(jù)前期研究的預(yù)試驗(yàn)結(jié)果確定為150.5 mg/kg，所需濃度的溶液采用蒸餾水配制，給藥容積為30 ml/kg，各組小鼠單次灌胃給予不同劑量的受試藥物，在給藥結(jié)束后觀察藥物對(duì)小鼠的毒性反應(yīng)及持續(xù)的時(shí)間(1日1次，連續(xù)給藥14 d)。記錄ICR小鼠的毒性反應(yīng)及死亡情況，選用Bliss法計(jì)算度洛西汀對(duì)小鼠急性毒性的半數(shù)致死量(LD50)及95%置信區(qū)間(CI)。

2.2 小鼠骨髓微核試驗(yàn)

SPF級(jí)雄性ICR小鼠60只，隨機(jī)分為6組，即度洛西汀組(度洛西汀1、2、3和4組分別給予度洛西汀5、10、20和40 mg/kg，灌胃給藥，1日1次，連續(xù)5 d)、陰性對(duì)照組(蒸餾水0.5 ml/20 g，灌胃給藥，1日1次，連續(xù)5 d)和陽(yáng)性對(duì)照組(環(huán)磷酰胺40 mg/kg，每日腹腔注射1次，連續(xù)給藥5 d)。試驗(yàn)第5日給藥1 h后，所有小鼠脫頸椎法處死，按文獻(xiàn)[4]方法解剖小鼠，取出小鼠的股骨，制備小鼠骨髓細(xì)胞懸液的涂片，經(jīng)甲醛固定和吉姆薩染色后放置于顯微鏡下進(jìn)行觀察，計(jì)算每只小鼠的骨髓涂片在10 000個(gè)嗜多染紅細(xì)胞出現(xiàn)的微核細(xì)胞數(shù)，并計(jì)算微核細(xì)胞率(%)。

2.3 小鼠精子畸變?cè)囼?yàn)

SPF級(jí)雄性ICR小鼠48只，隨機(jī)分為6組，每組10只。分組與給藥劑量及方法同“2.2”項(xiàng)，各組均連續(xù)給藥5 d。在給藥的第35日，取出所有小鼠的雙側(cè)附睪，按張宏等[5]的研究方法進(jìn)行制片和伊紅染色，并進(jìn)行鏡檢。每只小鼠選用計(jì)數(shù)10 000個(gè)結(jié)構(gòu)完整的精子為標(biāo)準(zhǔn)，記錄精子的畸變數(shù)目(折尾、鐮刀形、雙尾、胖頭和無(wú)鉤等)，并依據(jù)精子的畸變數(shù)目計(jì)算畸變率(%)。

2.4 小鼠生殖與淋巴器官重量指數(shù)檢測(cè)

經(jīng)過(guò)微核試驗(yàn)與精子畸變?cè)囼?yàn)后，分別摘取上述受試小鼠生殖系統(tǒng)的睪丸與附睪、胸腺與脾四部分器官，用濾紙?zhí)幚砗鬁?zhǔn)確稱重，計(jì)算器官重量指數(shù)。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 度洛西汀對(duì)小鼠的致死率和LD50的影響

本研究采用不同劑量的度洛西汀灌胃給藥，采用Bliss法求得小鼠經(jīng)口急性毒性給藥的LD50和95%CI，結(jié)果見(jiàn)表1。度洛西汀灌胃給藥的LD50為188.3 mg/kg，95%CI為148.0～202.9 mg/kg。

表1 度洛西汀對(duì)小鼠的致死率和LD50的影響(n=10)Tab 1 Effects of duloxetine on fatality rate and LD50 in mice (n=10)

3.2 度洛西汀對(duì)小鼠骨髓微核細(xì)胞率的影響

不同劑量(5～40 mg/kg)度洛西汀灌胃給藥5 d后對(duì)小鼠骨髓微核細(xì)胞率的影響結(jié)果見(jiàn)表2。度洛西汀給藥劑量達(dá)到40 mg/kg時(shí)，小鼠骨髓微核細(xì)胞率明顯升高(20.45±3.22)%，與陰性對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；度洛西汀灌胃劑量在5～20 mg/kg范圍內(nèi)時(shí)，并沒(méi)有引起小鼠骨髓微核細(xì)胞率升高，與陰性對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而陽(yáng)性對(duì)照組小鼠的骨髓微核細(xì)胞率明顯高于陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，見(jiàn)表2。

表2 度洛西汀對(duì)小鼠骨髓微核細(xì)胞率的影響Tab 2 Effects of duloxetine on sperm micronucleus rate of mice

3.3 度洛西汀對(duì)小鼠精子畸變率的影響

度洛西汀1、2和3組小鼠精子畸變率與陰性對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；度洛西汀4組(度洛西汀40 mg/kg)小鼠的精子畸變率與陰性對(duì)照組相比明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)表3。

表3 度洛西汀對(duì)小鼠精子畸變率的影響Tab 3 Effects of duloxetine on sperm malformation rate in mice

3.4 度洛西汀對(duì)小鼠生殖器官睪丸、附睪、胸腺及脾臟重量指數(shù)的影響

ICR小鼠灌胃給藥第6日，度洛西汀組小鼠睪丸、附睪、胸腺及脾臟重量指數(shù)均未受影響，與陰性對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；陽(yáng)性對(duì)照組小鼠各器官重量指數(shù)與陰性對(duì)照組相比，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表4。灌胃第35日，度洛西汀組小鼠各器官重量指數(shù)均未受影響，與陰性對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；陽(yáng)性對(duì)照組小鼠各器官重量指數(shù)均低于陰性對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表5。

表4 不同劑量度洛西汀對(duì)ICR小鼠灌胃給藥后第6日小鼠器官重量指數(shù)的影響Tab 4 Effects of different dosages of duloxetine on organ index of ICR mice on the 6th day after intragastric

表5 度洛西汀對(duì)小鼠用藥后第35日小鼠器官重量指數(shù)的影響Tab 5 Effects of duloxetine on organ index of mice on the 35th day after administration

4 討論

度洛西汀作為經(jīng)典的5-HT/NE再攝取抑制劑，其具有療效好、不良反應(yīng)少等優(yōu)點(diǎn)，市場(chǎng)占有率較高?？挂钟羲幍挠盟帟r(shí)間較長(zhǎng)，因此，其生殖及遺傳毒性的研究顯得更為重要。在女性患者使用抗抑郁藥時(shí)，患者與醫(yī)師特別注重其妊娠期用藥的安全。而男性患者使用抗抑郁藥時(shí)，藥物對(duì)男性生殖功能的影響特別是對(duì)精子活性和質(zhì)量的影響值得關(guān)注[10]。本研究采用嚙齒類動(dòng)物細(xì)胞遺傳物質(zhì)損傷的經(jīng)典方法微核試驗(yàn)與精子畸變?cè)囼?yàn)[8,11]，評(píng)估度洛西汀的急性毒性及遺傳毒性。結(jié)果顯示，度洛西汀在劑量≤40 mg/kg時(shí)，未對(duì)小鼠表現(xiàn)出潛在的遺傳毒性作用[12]，不會(huì)引起小鼠骨髓微核細(xì)胞率與精子畸變率升高；當(dāng)用藥劑量≥40 mg/kg時(shí)，小鼠微核細(xì)胞率和精子畸變率均顯著升高，提示高劑量度洛西汀對(duì)小鼠有較輕微的潛在遺傳毒性[13]。此外，本研究檢測(cè)了小鼠脾臟、胸腺和生殖系統(tǒng)的睪丸、附睪等器官重量指數(shù)，結(jié)果顯示，各劑量度洛西汀對(duì)上述重量指數(shù)均無(wú)顯著影響，提示在此劑量(≤40 mg/kg)范圍內(nèi)度洛西汀未對(duì)小鼠生殖器官產(chǎn)生影響。急性毒性試驗(yàn)是藥物安全評(píng)價(jià)的重要部分。本研究中，度洛西汀對(duì)小鼠的急性毒性試驗(yàn)結(jié)果顯示，LD50為188.3 mg/kg，95%CI為148.0～202.9 mg/kg。以上結(jié)果表明，度洛西汀在有效劑量范圍內(nèi)未出現(xiàn)不良反應(yīng)，安全窗較寬。但當(dāng)度洛西汀劑量≥40 mg/kg時(shí)，雖然短期給藥和長(zhǎng)期給藥對(duì)小鼠無(wú)明顯的器官毒性，但是高劑量度洛西汀對(duì)微核細(xì)胞率和精子畸變率的影響有輕微改變。因此，當(dāng)臨床上需要長(zhǎng)期大量應(yīng)用度洛西汀時(shí)，該藥的遺傳毒性應(yīng)引起足夠重視[14]。本研究結(jié)果可為抗抑郁藥的應(yīng)用提供思路和數(shù)據(jù)參考，也可作為開(kāi)展其他藥物遺傳性生殖安全性評(píng)價(jià)研究的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。