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香菇多糖對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖和遷移行為的影響

2021-05-07 01:34游文杰張人杰周芬芳郭紫成王子健王行環(huán)
現(xiàn)代泌尿外科雜志 2021年4期
關(guān)鍵詞:細(xì)胞周期劃痕膀胱癌

游文杰,張人杰,周芬芳,郭紫成,王子健,王行環(huán)

(1.武漢大學(xué)中南醫(yī)院泌尿外科,湖北武漢 430071;2.湖北省人類遺傳資源保藏中心,湖北武漢 430071;3.恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院泌尿外科,湖北恩施 445000)

膀胱癌(bladder cancer,BCa)是具有高發(fā)病率和死亡率的泌尿系腫瘤,增殖和遷移在膀胱癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移等進(jìn)程中占據(jù)著重要的地位。近20年來,BCa的致病因素仍未充分闡明,治療難度很大,臨床上以術(shù)中切除和術(shù)后放療等為代表的一線治療方案均難以進(jìn)一步延長(zhǎng)患者生存期[1]。在此背景下,膀胱癌化療,特別是術(shù)前新輔助化療逐步得到重視[2],并在基礎(chǔ)研究和臨床轉(zhuǎn)化中取得了系列進(jìn)展[3]。香菇多糖提取自香菇子實(shí)體,其主要成分為β-(1,3)-D葡聚糖[4]。由于可增強(qiáng)患者對(duì)順鉑和吉西他濱等化療藥物的敏感性,香菇多糖已在肝癌、卵巢癌等腫瘤聯(lián)合化療中得到臨床應(yīng)用[5]。目前,香菇多糖對(duì)人膀胱癌的治療效果仍有待進(jìn)一步研究。本研究采用不同濃度香菇多糖處理膀胱癌UM-UC3細(xì)胞,初步探討了香菇多糖抑制膀胱癌細(xì)胞增殖和遷移的作用及機(jī)制,旨在為臨床轉(zhuǎn)化提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料膀胱癌UM-UC3細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海典型培養(yǎng)物保藏中心。香菇多糖購(gòu)自上海Sigma-Aldrich貿(mào)易有限公司。DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清( fetal bovine serum,F(xiàn)BS)購(gòu)自美國(guó)Gibco生物有限公司。GAPDH、Ki67、CDK2、CDK6、P53、N-cadherin、Vimentin一抗及相應(yīng)二抗購(gòu)自上海Abcam貿(mào)易有限公司。細(xì)胞周期染色試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光液等購(gòu)自武漢沃萊邦德貿(mào)易有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及傳代將UM-UC3細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM高糖完全培養(yǎng)基(含體積分?jǐn)?shù)10%的FBS)中,在37 ℃,體積分?jǐn)?shù)5%的CO2條件下培養(yǎng)至體積分?jǐn)?shù)為80%的匯合度。用體積分?jǐn)?shù)0.25%胰酶消化細(xì)胞,1 000 r/min離心5 min后按照1∶3的密度傳代。

1.3 噻唑藍(lán)(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide,MTT)實(shí)驗(yàn)以3×103個(gè)/孔的密度接種UM-UC3細(xì)胞于96孔組織培養(yǎng)板內(nèi)。24 h后棄去原有培養(yǎng)基,向每孔中加入200 μL含不同濃度香菇多糖的完全培養(yǎng)基。24 h和48 h 后分別向每孔中加入20 μL MTT試劑 (5 mg/mL)并繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄去培養(yǎng)基,向每孔中加入150 μL二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO),避光混勻后使用多功能酶標(biāo)儀(SpectraMax,USA)檢測(cè)490 nm處的吸光度。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)用低質(zhì)量濃度(20 μg/mL)和高質(zhì)量濃度(60 μg/mL)香菇多糖處理UM-UC3細(xì)胞48 h。消化并收集細(xì)胞沉淀,加入1 mL磷酸鹽緩沖液重懸細(xì)胞,3 000 r/min離心5 min。棄去上清,依次加入1 mL DNA染色緩沖液和10 μL碘化丙啶(PI)溶液。室溫下避光孵育30 min后使用流式細(xì)胞儀(Beckman,USA)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)DNA含量。

1.5 Transwell實(shí)驗(yàn)用無血清DMEM高糖培養(yǎng)基重懸處理后的UM-UC3細(xì)胞,并將細(xì)胞密度調(diào)整至2×105個(gè)/mL。采用直徑8 μm的Transwell小室(Corning,USA)進(jìn)行細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)[6]。上室加入200 μL細(xì)胞懸液,下室加入700 μL完全培養(yǎng)基。靜置培養(yǎng)24 h后依次采用40 g/L多聚甲醛固定和1 g/L結(jié)晶紫染色。沖洗多余的結(jié)晶紫,用棉簽輕拭去上室非遷移細(xì)胞,利用倒置熒光顯微鏡(Leica,German)觀察細(xì)胞并拍照。

1.6 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)將處理后的UM-UC3細(xì)胞消化后接種于6孔組織培養(yǎng)板內(nèi),待匯合度>90%時(shí)利用200 μL移液槍頭在培養(yǎng)板底垂直劃痕。洗凈未貼壁細(xì)胞,加入含體積分?jǐn)?shù)為2% FBS的低血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后觀察劃痕寬度并拍照。

1.7 Western blot實(shí)驗(yàn)采用裂解液RIPA、蛋白酶抑制劑以及磷酸酶抑制劑提取細(xì)胞蛋白,并用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。取等量蛋白質(zhì)進(jìn)行10 g/L SDS-PAGE電泳,濃縮時(shí)電壓設(shè)為80 V,分離時(shí)電壓設(shè)為120 V。電泳后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜,其參數(shù)設(shè)為固定電流270 mA,時(shí)間100 min。PVDF膜用50 g/L脫脂奶粉封閉后一抗孵育過夜,加入二抗繼續(xù)孵育2 h。采用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(Bio-Rad,USA)檢測(cè)蛋白質(zhì)條帶。

1.8 免疫熒光分析制作細(xì)胞爬片,用40 g/L多聚甲醛溶液固定15 min后再用體積分?jǐn)?shù)為0.3%的Triton X-100室溫下孵育20 min增加細(xì)胞膜通透性。隨后進(jìn)行抗體結(jié)合反應(yīng),先用體積分?jǐn)?shù)為10%的山羊血清封閉爬片1 h,然后一抗孵育過夜,加入熒光二抗繼續(xù)孵育1 h,DAPI溶液染細(xì)胞核10 min后封片。利用倒置熒光顯微鏡觀察熒光并拍照。

2 結(jié) 果

2.1 香菇多糖抑制膀胱癌UM-UC3細(xì)胞增殖采用MTT實(shí)驗(yàn)初步篩選香菇多糖的最適給藥濃度,并進(jìn)一步通過流式細(xì)胞術(shù)驗(yàn)證香菇多糖對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖的抑制效果。如圖1A所示,將空白組(0 μg/mL)相對(duì)細(xì)胞活力設(shè)定為100%,則10、20、40、60、80、100 μg/mL組的24 h相對(duì)細(xì)胞活力分別為(93.7±5.1)%、(76.1±4.9)%、(59.2±3.9)%、(50.4±3.0)%、(31.8±2.4)%,48 h相對(duì)細(xì)胞活力分別為(89.9±4.9)%、(79.4±4.1)%、(66.4±4.1)%、(49.9±4.9)%、(43.4±2.6)%、(25.8±1.3)%。在此基礎(chǔ)上,我們選取0 μg/mL作為空白組、20 μg/mL作為低質(zhì)量濃度組、60 μg/mL作為高質(zhì)量濃度組進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。如圖1B、C所示,與空白組(53.2±2.1)%相比,低質(zhì)量濃度組和高質(zhì)量濃度組中G0/G1期細(xì)胞比例分別上升至(57.2±0.9)%和(67.9±0.5)%,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。此外,Ki67免疫熒光強(qiáng)度隨香菇多糖濃度上升而呈現(xiàn)降低趨勢(shì)。綜上所述,香菇多糖可顯著抑制膀胱癌UM-UC3細(xì)胞增殖,其機(jī)制可能與G0/G1期細(xì)胞周期阻滯有關(guān)。

2.2 香菇多糖抑制膀胱癌UM-UC3細(xì)胞遷移Transwell實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如圖2A、C所示,空白組、低質(zhì)量濃度組和高質(zhì)量濃度組遷移細(xì)胞數(shù)分別為(308±30)、(222±27)、(86±12)個(gè)。劃痕遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2B、D所示,空白組、低質(zhì)量濃度組、高質(zhì)量濃度組24 h劃痕愈合率分別為(56.2±2.4)%、(44.2±4.2)%、(19.4±2.9)%。與空白組比較,低濃度組和高濃度組細(xì)胞遷移能力受到顯著的抑制(P<0.05),并呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。

A:不同質(zhì)量濃度(0、10、20、40、60、80、100 μg/mL)香菇多糖處理24 h和48 h后膀胱癌UM-UC3細(xì)胞的增殖活力;B:不同質(zhì)量濃度香菇多糖(0、20、60 μg/mL)處理UM-UC3細(xì)胞48 h后,細(xì)胞周期G0/G1期細(xì)胞比例顯著上升;C:細(xì)胞周期的流式結(jié)果圖,同時(shí)免疫熒光提示UM-UC3細(xì)胞內(nèi)Ki67蛋白表達(dá)隨香菇多糖質(zhì)量濃度上升呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。*P<0.05,***P<0.001。

A、C:不同質(zhì)量濃度(0、20、60 μg/mL)香菇多糖對(duì)UM-UC3細(xì)胞Transwell遷移能力的抑制效果;B、D:香菇多糖抑制UM-UC3細(xì)胞的劃痕遷移能力。隨香菇多糖質(zhì)量濃度上升,UM-UC3細(xì)胞的遷移細(xì)胞數(shù)和劃痕愈合率均顯著降低。與對(duì)照組相比,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。**P<0.01,***P<0.001。

2.3 香菇多糖參與調(diào)控細(xì)胞周期和上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化通路Western實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。經(jīng)不同質(zhì)量濃度香菇多糖處理后,膀胱癌UM-UC3細(xì)胞中周期上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化基因(N-cadherin、Vimentin)和周期相關(guān)基因(CDK2、CDK6)蛋白表達(dá)明顯下調(diào),原癌基因P53蛋白表達(dá)增加。該結(jié)果表明:香菇多糖可能通過阻滯細(xì)胞周期和抑制上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化途徑從而抑制膀胱癌細(xì)胞增殖和遷移。

圖3 免疫印跡分析蛋白標(biāo)志物表達(dá)情況

3 討 論

新輔助化療(neoadjuvant chemotherapy,NAC)是肌浸潤(rùn)性膀胱癌(muscle-invasive bladder cancer,MIBC)患者在接受根治性手術(shù)前進(jìn)行的化療。NAC在提高M(jìn)IBC患者耐受性、減滅微小轉(zhuǎn)移灶、預(yù)防復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移、改善預(yù)后和5年生存期等方面具有顯著的效果,且已被歐洲泌尿外科指南列為T2-T4cN0M0期患者的優(yōu)選治療方式(A類推薦)[7]。臨床常用的膀胱癌化療藥物包括順鉑、吉西他濱、長(zhǎng)春新堿和甲氨蝶呤等,但尚無一種化療藥物及其組合物能完全滿足臨床需求[8]。因此,篩選新型化療藥物,豐富備選化療藥物在擴(kuò)展新輔助化療適應(yīng)證、提升化療效果、減少耐藥性產(chǎn)生等方面具有一定的戰(zhàn)略意義。

湖北省人類遺傳資源保藏中心是華中地區(qū)在建規(guī)模最大的生物樣本庫,目前已獲批國(guó)際生物與環(huán)境樣本庫協(xié)會(huì)保藏資質(zhì)。中心可為高通量藥物篩選及分子診療等轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究提供高質(zhì)量的腫瘤樣本和信息服務(wù)。前期工作中,我們基于臨床需求篩選得到香菇多糖、辣椒素、二氫楊梅素等具有優(yōu)異抗腫瘤活性的植物源性藥物,并進(jìn)一步驗(yàn)證了其作用效果和機(jī)制。馬莉等[9]報(bào)道香菇多糖可通過PI3K/AKT信號(hào)途徑誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡。李靜等[10]將香菇多糖首次應(yīng)用于肺癌聯(lián)合化療,有效的提高了患者的免疫力,減輕了不良反應(yīng)。值得一提的是,目前香菇多糖在膀胱癌中的基礎(chǔ)研究報(bào)道較少,臨床試驗(yàn)仍未見報(bào)道。

本研究中,我們采用MTT、流式細(xì)胞術(shù)和免疫熒光等實(shí)驗(yàn)揭示了香菇多糖抑制膀胱癌UM-UC3細(xì)胞增殖和遷移的效果。經(jīng)香菇多糖處理后,UM-UC3細(xì)胞周期成功阻滯于G0/G1期,Ki67蛋白熒光強(qiáng)度明顯下調(diào),遷移細(xì)胞數(shù)和劃痕愈合率均得到顯著降低(P<0.05)。進(jìn)一步采用不同濃度香菇多糖處理膀胱癌細(xì)胞可有效抑制上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化基因(N-cadherin、Vimentin)和周期相關(guān)基因(CDK2、CDK6)的蛋白表達(dá),上調(diào)原癌基因P53的蛋白表達(dá)。上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化是膀胱癌細(xì)胞獲取高遷移和侵襲能力的基礎(chǔ),其生物學(xué)功能得到廣泛報(bào)道[11-12]。本研究結(jié)果表明:香菇多糖可能是通過阻滯細(xì)胞周期和抑制上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化途徑,從而達(dá)到抑制膀胱癌細(xì)胞增殖和遷移的效果。

綜上所述,香菇多糖具有優(yōu)異的體外抗腫瘤活性。香菇多糖的體內(nèi)抗腫瘤活性以及生物安全性等有待后續(xù)進(jìn)一步的研究。香菇多糖來源廣泛,抗腫瘤效果好,毒副作用小,有望順利申請(qǐng)一項(xiàng)Ⅰ類新藥,并推廣應(yīng)用于膀胱癌新輔助化療[13-14]。

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